1. Разработан и внесен Госагропромом СССР.

Исполнители:

Б.Т. Катарьян, канд. биол. наук (руководитель темы); Е.Я. Богданова; Л.Е. Скокан.

2. Утвержден и введен в действие Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 23.12.87 N 4827.

3. Срок первой проверки - 1993 г.

Периодичность проверки - 5 лет.

4. Введен впервые.

5. Ссылочные нормативно-технические данные:

Настоящий стандарт распространяется на кондитерские изделия и устанавливает перечень средств измерений, оборудования, инвентаря, лабораторной посуды, материалов, реактивов и питательных сред, необходимых для определения в кондитерских изделиях мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, бактерий группы кишечных палочек, коагулазоположительных стафилококков, дрожжей и плесневых грибов.

1.1. Средства измерения и оборудование

Ареометр по ГОСТ 18481-81.

Баня водяная.

Весы лабораторные общего назначения, 2-го класса точности с НПВ 200 г по ГОСТ 24104-80 (для взвешивания реактивов).

Весы лабораторные общего назначения, 4-го класса точности с НПВ 200 г по ГОСТ 24104-80 (для взвешивания навесок продуктов).

Горелка газовая с регулированием подачи воздуха.

Гомогенизатор или смеситель лабораторный.

Дистиллятор электрический ДЭ-4 или другой марки.

Лупа складная с увеличением по ГОСТ 25706-83.

Микроскоп световой биологический по ГОСТ 8284-78.

Облучатель бактерицидный потолочный ОБП-300 или другой марки.

Плита электрическая или газовая 4-конфорочная.

pH-метр по ГОСТ 19881-74.

Стерилизатор паровой медицинский по ГОСТ 19569-80.

Термометры ртутные стеклянные лабораторные с диапазоном измерения от 0 до 55 °C и от 0 до 105 °C по ГОСТ 215-73 и от 0 до 100 °C по ГОСТ 2823-73.

Термостат электрический суховоздушный ТС-80 или другой марки.

Холодильник бытовой.

Часы песочные на 1, 2, 3, 5 и 10 мин.

Часы сигнальные или таймер.

Шкаф сушильный, позволяющий поддерживать температуру не ниже 160 °C.

Допускается применение импортных средств измерений и оборудования по классу точности не ниже отечественных.

1.2. Инвентарь

Бак оцинкованный из нержавеющей стали с крышкой, вместимостью 20 дм3, или ведро оцинкованное с крышкой (для кипячения стеклянной посуды).

Иглодержатель бактериологический.

Кастрюли эмалированные (для приготовления питательных сред).

Мясорубка бытовая с отверстиями диаметром не более 4 мм по ГОСТ 4025-83.

Ножницы медицинские по ГОСТ 21239-77.

Петля бактериологическая.

Пинцеты медицинские по ГОСТ 21241-77.

Скальпели и ножи медицинские по ГОСТ 21240-77.

Штативы для пробирок на 10, 20 и 40 гнезд.

Кружки фарфоровые вместимостью 500, 1000 и 2000 см3 по ГОСТ 9147-80.

Воронки В-ХС по ГОСТ 25336-82.

Колбы конические Кн-1-250-19/26ТС, Кн-1-250-34/35ТС,

Кн-1-250-45/40ТС, Кн-1-2000-24/29ТС, Кн-1-2000-29/32ТС,

Кн-1-2000-34/35ТС по ГОСТ 25336-82.

Колба мерная 2-100-2 по ГОСТ 1770-74.

Колбы плоскодонные П-1-250-29/32ТС, П-1-250-34/35ТС, П-1-250-45/40ТС, П-1-2000-45/40ТС по ГОСТ 25336-82.

Мензурки вместимостью 100, 250, 500 и 1000 см3 по ГОСТ 1770-74.

Пипетки 4-1-1, 4-1-2, 5-1-1, 5-1-2, 6-1-5, 6-1-10, 7-1-5, 7-1-10 по ГОСТ 20292-74.

Поплавки стеклянные для пробирок и колб размером 5 x 20 и 10 x 45 мм (пробирки Уленгута или трубки Дархема).

Пробирки цилиндрические П-1-16-150ТС по ГОСТ 25336-82.

Спиртовки СЛ-1, СЛ-2 по ГОСТ 25336-82.

Стаканы В-1-50ТС, В-1-100ТС по ГОСТ 25336-82 (для взвешивания навесок продуктов).

Стекла покровные для микропрепаратов по ГОСТ 6672-75.

Стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284-75.

Ступки фарфоровые с пестиком вместимостью 300 и 500 см3 по ГОСТ 9147-80.

Флаконы из темного стекла вместимостью 250 и 500 см3.

Цилиндр мерный 1-1000 по ГОСТ 1770-74.

Чашки биологические (Петри) ЧБН-1-100, ЧБН-2 по ГОСТ 25336-82.

Допускается применение импортной лабораторной посуды по классу точности не ниже отечественной.

Новую стеклянную посуду, предназначенную для микробиологических анализов, перед употреблением кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты с объемной долей 1 - 2%) в течение 15 мин, промывают водопроводной водой, затем ополаскивают дистиллированной водой, высушивают и стерилизуют в сушильном шкафу при 160 - 165 °C в течение 2 ч или в паровом стерилизаторе при (121 +/- 2) °C в течение 30 мин с последующим высушиванием.

Бинты марлевые медицинские по ГОСТ 1172-75.

Бумага индикаторная.

Бумага оберточная по ГОСТ 8273-75.

Бумага фильтровальная листовая по ГОСТ 12026-76.

Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556-81.

Ерши и щетки (для мойки стеклянной посуды).

Карандаши восковые по стеклу.

Марля медицинская по ГОСТ 9412-77.

Мыло хозяйственное.

Пробки резиновые конусные по ГОСТ 7852-76.

Проволока из тугоплавких материалов диаметром 0,3 - 0,5 мм (для изготовления бактериологических петель).

Ткань полотенечная по ГОСТ 11027-80.

Фартук прорезиненный или клеенчатый.

Халат белый хлопчатобумажный с косынкой или шапочкой.

Шпагат.

Порошки стиральные.

Агар-агар в волокнах или порошке по ГОСТ 20438-75 или агар микробиологический по ГОСТ 17206-84, или агар пищевой по ГОСТ 16280-70.

Агар сухой Эндо.

Бульон питательный сухой.

Генциан фиолетовый, краситель.

Глюкоза по ГОСТ 6038-79 или глюкоза кристаллическая гидратная по ГОСТ 975-75.

Дрожжи хлебопекарные прессованные по ГОСТ 171-81.

Желчь крупного рогатого скота жидкая (свежая или консервированная медицинская) или сухая обезвоженная.

Йод по ГОСТ 4159-79.

Калий йодистый по ГОСТ 4232-74.

Кислота лимонная пищевая по ГОСТ 908-79.

Кислота соляная по ГОСТ 3118-77.

Кристаллический фиолетовый, индикатор.

Лактоза 1-водная.

Масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739-78.

Мясо-говядина в полутушах и четвертинах по ГОСТ 779-55 или мясо-баранина в тушах по ГОСТ 1935-55, или мясо-конина в полутушах и четвертинах по ГОСТ 27095-86.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77.

Натрий сернистокислый безводный по ГОСТ 195-77 или 7-водный по ГОСТ 429-76.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233-77.

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805-76.

Плазма крови кроличья сухая.

Питательный агар сухой.

Питательный агар сухой КД.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67.

Среда сухая Кесслер.

Среда сухая Кода.

Сусло-агар сухой.

Сусло солодовое (пивное) неохмеленное или виноградное.

Фенол по ГОСТ 6417-72.

Фуксин основной.

Экстракт дрожжевой в порошке или экстракт кормовых дрожжей.

Яйца куриные.

4.1. Приготовление растворов реактивов.

Для приготовления растворов реактивов применяются:

вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;

реактивы по ГОСТ 13867-68, х.ч. и ч.д.а.

4.1.1. Раствор гидроокиси натрия с массовой долей 10%

В мерную колбу вместимостью 100 см3 наливают 80 см3 воды, добавляют навеску гидроокиси натрия 10 г, растворяют содержимое колбы встряхиванием, доводят водой до метки и переносят содержимое в колбу вместимостью 250 см3.

Приготовленный раствор стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение 20 мин.

Раствор применяют для подщелачивания питательных сред.

4.1.2. Раствор кристаллического фиолетового с массовой долей 1%

В мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 100 см3 наливают 80 см3 воды, подогретой до 60 °C, и добавляют 1 г кристаллического фиолетового. Индикатор растворяют встряхиванием колбы. После охлаждения объем раствора доводят до метки водой, переливают содержимое колбы во флакон из темного стекла с притертой пробкой и хранят не более 7 сут.

Приготовленный раствор используют для добавления в питательную среду с целью подавления роста грамположительных микроорганизмов.

4.1.3. Раствор лимонной кислоты с массовой долей 20%

В мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 100 см3 наливают 80 см3 воды, добавляют 20 г лимонной кислоты, растворяют содержимое колбы встряхиванием и доводят объем раствора до метки водой. Переливают в колбу вместимостью 250 см3 и стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение 20 мин.

Приготовленный раствор применяют для подкисления питательных сред.

4.1.4. Раствор пептонно-солевой

пептон - 1,0 г

хлористый натрий - 8,5 г

В эмалированную кастрюлю или колбу вместимостью 2000 см3 наливают 900 см3 воды, добавляют 1 г пептона и 8,5 г хлористого натрия, растворяют в воде при слабом нагревании, переносят в цилиндр вместимостью 1000 см3 и доводят объем раствора водой до 1000 см3. Затем раствор переносят в колбу вместимостью 2000 см3 и устанавливают pH до (7,0 +/- 0,1).

Приготовленный раствор разливают по 90 см3 в колбы вместимостью 250 см3 или в пробирки по 9 см3 и стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение 30 мин.

Применяют раствор для приготовления разведений взвешенной навески продукта.

4.1.5. Раствор физиологический

В колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,85 г хлористого натрия, растворяют и доводят объем водой до метки, затем раствор стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение 20 мин.

Раствор применяют для разведения сухой кроличьей плазмы и для приготовления яично-желточной взвеси.

4.1.6. Растворы реактивов для окраски микропрепаратов по Граму

4.1.6.1. Карболовый раствор фиолетового генциана

В фарфоровую ступку вместимостью 300 см3 наливают 10 см3 спирта, добавляют 1 г фиолетового генциана и 5 г фенола, смесь тщательно растирают, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки.

Приготовленный раствор хранят во флаконе из темного стекла с притертой пробкой.

4.1.6.2. Раствор Люголя

Во флакон из темного стекла с притертой пробкой вместимостью 500 см3 вносят 1 г йода, 2 г йодистого калия и наливают 300 см3 воды.

4.1.6.3. Фуксин Циля

В фарфоровую ступку вместимостью 300 см3 вносят 5 г фенола, 10 см3 спирта и 1 г основного фуксина, тщательно растирают и добавляют 80 см3 воды. Смесь переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки.

Приготовленный раствор хранят во флаконе из темного стекла с притертой пробкой.

4.1.7. Для окраски микропрепаратов по Граму ускоренным методом используют следующие реактивы.

4.1.7.1. Реактив 1

В мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 100 см3 вносят 0,5 г кристаллического фиолетового и добавляют этиловый спирт до метки.

Приготовленный реактив хранят во флаконе из темного стекла с притертой пробкой.

4.1.7.2. Реактив 2

В мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 100 см3 вносят 0,4 г йодистого калия, приливают этиловый спирт до метки и растворяют нагреванием на водяной бане при 45 - 50 °C при постоянном помешивании. Оставляют раствор на (24 +/- 3) ч при комнатной температуре, добавляют 0,1 г основного фуксина и 0,2 г йода, доводят до метки этиловым спиртом.

Приготовленный реактив хранят во флаконе из темного стекла с притертой пробкой.

4.2. Приготовление питательных сред

Питательные среды приготовляют в эмалированной или стеклянной посуде. Для приготовления питательных сред применяются:

вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;

вода питьевая по ГОСТ 2874-82;

реактивы по ГОСТ 13867-68 х.ч. и ч.д.а.

4.2.1. Водный агар

В колбу вместимостью 2000 см3 вносят 15 г агара, добавляют 1000 см3 дистиллированной воды и растворяют нагреванием.

Приготовленную среду стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение 20 мин.

Применяют водный агар для наслаивания на застывшую питательную среду с посевным материалом с целью предотвращения роста бактерий, образующих на поверхности агаризованной питательной среды сплошной налет.

4.2.2. Бульон мясо-пептонный с агаром

Для приготовления среды используют бульон или мясную воду.

Раствор бульона приготовляют из сухого питательного бульона производственного изготовления (состав и способ приготовления см. на этикетке упаковки).

Для приготовления мясной воды в кастрюлю вместимостью 2000 см3 помещают 500 г мяса, освобожденного от костей, сухожилий и жира, пропускают через мясорубку, приливают 1000 см3 питьевой воды (предварительно прокипяченной, охлажденной и профильтрованной через бумажный фильтр), нагревают до кипения и кипятят на слабом огне 1,5 ч, периодически помешивая и доливая питьевой водой до первоначального объема. Для определения готовности смеси фильтруют сначала небольшое количество ее в пробирку через бумажный фильтр, если жидкость прозрачная, кипячение прекращают. Приготовленную смесь охлаждают, фильтруют через ткань и доводят pH смеси до (7,1 +/- 0,1).

Для приготовления питательной среды в кастрюлю вместимостью 2000 см3 приливают 1000 см3 раствора бульона или мясной воды, добавляют 10 г пептона, 5 г хлористого натрия и 15 - 20 г агара. Смесь нагревают, доводят до кипения и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. Устанавливают pH среды до (7,1 +/- 0,1), разливают в пробирки или в колбы и стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение 20 мин.

Среду применяют для культивирования мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

4.2.3. Бульон мясо-пептонный с агаром, глюкозой и дрожжевым экстрактом

В кастрюлю вместимостью 2000 см3 наливают 1000 см3 раствора бульона или мясной воды, приготовленных по п. 4.2.2, добавляют 10 г пептона, 5 г хлористого натрия, 1 г глюкозы и 2 г дрожжевого экстракта в порошке или 10 см3 жидкого дрожжевого экстракта.

Для приготовления жидкого дрожжевого экстракта в кастрюлю вместимостью 3000 см3 нарезают небольшими кусочками 100 г пекарских прессованных дрожжей и заливают 500 см3 воды. Смесь ставят в термостат и выдерживают при 58 - 60 °C в течение 2 сут и встряхивают 1 - 2 раза в сутки. Конец автолиза устанавливают по полному разжижению дрожжей. Экстракт должен иметь коричневый оттенок и приятный запах. Приготовленный жидкий дрожжевой экстракт переносят в колбы и стерилизуют при (112 +/- 2) °C в течение 20 мин. 5 см3 приготовленного дрожжевого экстракта равноценно 1 г дрожжевого экстракта в порошке.

Добавляют дрожжевой экстракт в питательные среды как источник веществ, способствующих регенерации поврежденных клеток микроорганизмов.

Для приготовления питательной среды смесь бульона или мясной воды с пептоном, хлористым натрием, глюкозой и дрожжевым экстрактом доводят до кипения и кипятят на слабом огне в течение 1 - 2 мин, периодически помешивая. Смесь фильтруют через бумажный фильтр в цилиндр вместимостью 1000 см3, доводят объем смеси водой до 1000 см3, устанавливают pH до (7,1 +/- 0,1), добавляют 15 - 20 г агара, доводят до кипения и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. Приготовленную среду стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение 20 мин.

Среду используют для культивирования мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

4.2.4. Среда Кесслер с лактозой

Для приготовления среды используют сухую питательную среду Кесслер производственного изготовления по нормативно-технической документации (состав и способ приготовления см. на этикетке упаковки).

Жидкую среду Кесслер можно приготовить следующим образом.

В кастрюлю вместимостью 2000 см3 наливают 1000 см3 питьевой воды, добавляют 10 г пептона и 50 см3 желчи, растворяют нагреванием на водяной бане при 80 - 85 °C в течение 20 - 30 мин, при постоянном помешивании смеси. Затем смесь фильтруют через ватно-марлевый фильтр в колбу вместимостью 2000 см3 и добавляют 2,5 г лактозы (глюкозы), переносят в цилиндр вместимостью 1000 см3 и доводят объем питьевой водой до 1000 см3. Затем смесь переносят в колбу вместимостью 2000 см3, устанавливают pH до (7,0 +/- 0,1), добавляют 4 см3 водного раствора кристаллического фиолетового. Приготовленную среду разливают по 90 см3 в колбы вместимостью 250 см3 и по 9 см3 в пробирки с поплавками и стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение 10 мин. Среда после стерилизации должна быть темно-фиолетового цвета, в поплавках должны отсутствовать пузырьки воздуха.

Среда применяется для культивирования бактерий группы кишечных палочек.

4.2.5. Агар Эндо

Для приготовления среды используют сухой агар Эндо производственного изготовления (состав и приготовление см. на этикетке упаковки).

Сухой агар Эндо можно заменить средой следующего состава:

Для приготовления раствора лактозы с массовой долей 20% в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 20 г лактозы, растворяют ее дистиллированной водой и доводят до метки. Переносят содержимое в колбу вместимостью 250 см3 и стерилизуют при (116 +/- 2) °C в течение 20 мин.

К 1000 см3 расплавленного и охлажденного до 70 °C мясо-пептонного агара добавляют 50 см3 стерильного раствора лактозы, предварительно нагретой на водяной бане до 100 °C в течение 5 мин.

В колбу вместимостью 250 см3 добавляют 5 см3 раствора основного фуксина и 100 см3 свежеприготовленного водного раствора сернистокислого натрия.

К охлажденному до 45 - 50 °C мясо-пептонному агару с лактозой добавляют смесь растворов основного фуксина и сернистокислого натрия, взбалтывают и разливают по чашкам Петри в затемненном помещении (на свету питательная среда краснеет).

Готовая среда в горячем состоянии красноватого цвета, в холодном - бледно-розовая или бесцветная.

Среду, разлитую в стерильные чашки Петри, можно хранить при (6 +/- 2) °C не более 10 сут.

Применяют среду для выявления бактерий группы кишечных палочек.

4.2.6. Яично-желточный солевой агар

Приготовление яично-желточной взвеси.

Из куриного яйца, протертого с поверхности этиловым спиртом с объемной долей 70%, извлекают стерильной пипеткой вместимостью 10 см3 желток и вносят его в колбу вместимостью 250 см3, добавляют 100 см3 стерильного физиологического раствора. Взвесь тщательно перемешивают.

Приготовление питательной среды.

Непосредственно перед проведением анализа растворяют хлористый натрий в 1000 см3 расплавленного мясо-пептонного агара, охлаждают смесь до 45 - 50 °C и добавляют 100 см3 яично-желточной взвеси. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Среду в чашках Петри можно хранить при (6 +/- 2) °C не более 5 сут.

Применяют среду для выявления коагулазоположительных стафилококков и лецитиназной активности микроорганизмов.

4.2.7. Солевой бульон

Для приготовления питательной среды используют раствор сухого питательного бульона производственного изготовления (состав и способ приготовления см. на этикетке упаковки) или мясную воду, приготовленную по п. 4.2.2.

В кастрюлю вместимостью 2000 см3 наливают 1000 см3 раствора бульона или мясной воды, добавляют 10 г пептона и 0,1 или 3,1 г хлористого натрия в случае использования раствора бульона и 6 или 9 г хлористого натрия в случае использования мясной воды. Смесь кипятят, фильтруют через бумажный фильтр в цилиндр вместимостью 1000 см3, доводят объем фильтрата до 1000 см3 питьевой водой и устанавливают pH смеси до (7,1 +/- 0,1). Приготовленную среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение 20 мин.

Солевой питательный бульон используется в качестве накопительной среды для выявления коагулазоположительных стафилококков.

4.2.8. Сахарный бульон (бульон с глюкозой)

Для приготовления питательной среды используют раствор сухого питательного бульона производственного изготовления (состав и способ приготовления см. на этикетке упаковки) или мясную воду, приготовленную по п. 4.2.2.

В кастрюлю вместимостью 2000 см3 наливают 1000 см3 раствора питательного бульона или мясной воды, добавляют 10 г пептона и 1 г глюкозы. Смесь кипятят, фильтруют через бумажный фильтр в цилиндр вместимостью 1000 см3, доводят объем фильтрата до 1000 см3 питьевой водой и устанавливают pH смеси до (7,1 +/- 0,1). Приготовленную среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение 20 мин.

Питательный бульон с глюкозой используется в качестве накопительной среды для выявления коагулазоположительных стафилококков.

4.2.9. Сусло-агар

Для приготовления питательной среды используется сухой сусло-агар производственного изготовления (состав и способ приготовления см. на этикетке упаковки).

Среду сусло-агар можно приготовить следующим образом.

В кастрюлю вместимостью 2000 см3 наливают 1000 см3 сусла солодового (пивного, неохмеленного) или виноградного и разбавляют питьевой водой до плотности 1,03 - 1,04 г/см3. В разбавленном сусле устанавливают pH до 6,0 - 6,5 или 3,5, добавляют к нему 20 г (при pH сусла 6,0 - 6,5) или 30 г (при pH сусла 3,5) агара. Смесь расплавляют на водяной бане или текучим паром в паровом стерилизаторе и разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при (116 +/- 2) °C в течение 15 мин.

Среду применяют для культивирования дрожжей и плесневых грибов.

4.2.10. Пептонно-глюкозный агар (среда Сабуро)

В кастрюлю вместимостью 2000 см3 наливают 1000 см3 подогретой до 45 - 50 °C питьевой воды, добавляют 10 г пептона, 40 г глюкозы и устанавливают pH смеси до (6,5 +/- 0,1). К смеси добавляют 20 г агара и нагревают до полного расплавления агара, охлаждают и переносят в цилиндр вместимостью 1000 см3, доводят объем смеси до 1000 см3 питьевой водой. Приготовленную среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при (112 +/- 2) °C в течение 20 мин.

Среду применяют для культивирования дрожжей и плесневых грибов.

Необходимое значение pH растворов реактивов и питательных сред устанавливают при комнатной температуре с помощью раствора гидроокиси натрия с массовой долей 10% или раствора лимонной кислоты с массовой долей 20%.

Допускается проводить ориентировочное определение pH растворов и питательных сред с помощью индикаторной бумаги, позволяющей определять pH с интервалом 0,2 единицы.