1. Разработан Акционерным обществом открытого типа "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (АООТ "ВНИИКП");

Нижегородским государственным техническим университетом.

Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 "Комбикорма, БВД, премиксы".

2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 29 июля 1996 г. N 488.

3. Введен впервые.

Настоящий стандарт распространяется на премиксы и устанавливает методы определения витаминов , холинхлорида, химическими методами и высокоэффективной жидкостной хроматографией.

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 61-75 Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 246-76 Гидросульфит натрия технический. Технические условия

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия

ГОСТ 2603-79 Ацетон. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4109-79 Бром. Технические условия

ГОСТ 4139-75 Калий роданистый. Технические условия

ГОСТ 4166-76 Натрий серно-кислый. Технические условия

ГОСТ 4174-77 Цинк сернокислый 7-водный. Технические условия

ГОСТ 4201-79 Натрий углекислый кислый. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4206-75 Калий железосинеродистый. Технические условия

ГОСТ 4234-77 Калий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 4530-76 Кальций углекислый. Технические условия

ГОСТ 6016-77 Спирт изобутиловый. Технические условия

ГОСТ 6217-74 Уголь активный древесный дробленый. Технические условия

ГОСТ 6552-80 Кислота ортофосфорная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9337-79 Натрий фосфорнокислый 12-водный. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 19908-90 Тигли, чаши, стаканы, колбы, воронки, пробирки и наконечники из прозрачного кварцевого стекла. Общие технические условия

ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25664-83 Метол (4-метиламинофенол сульфат). Технические условия

ГОСТ 26573.0-85. Премиксы. Технические условия

ГОСТ 27067-86 Аммоний роданистый. Технические условия

ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 29228-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 2. Пипетки градуированные без установленного времени ожидания

ГОСТ 29251-91 Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 29252-91 Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 2. Бюретки без времени ожидания

Отбор проб по ГОСТ 13496.0.

Сущность метода заключается в извлечении витамина (тиамина) из навески анализируемого продукта раствором серной кислоты, окислении его раствором железосинеродистого калия в тиохром, экстракции окисленной формы из водной фазы изобутиловым спиртом и измерении интенсивности флуоресценции.

4.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Флуорометр Квант-7, ФАНК-1.

Аппарат для встряхивания жидкости типа АВУ-1.

Колбы мерные 2-50(100)-1(2) по ГОСТ 1770.

Воронки стеклянные типа В по ГОСТ 25336.

Пробирки П-1(2)-25-0,2 по ГОСТ 1770.

Шкаф сушильный с терморегулятором, обеспечивающий постоянство температуры (105 +/- 2) °C.

Воронки делительные типа ВД вместимостью 100 см3 по ГОСТ 25336.

Стаканы В-1-100ТХС по ГОСТ 25336.

Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-1(2), 6(7)-1(2)-5(10) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Цилиндры 1(2, 3, 4)-25(50, 100) по ГОСТ 1770.

Фильтры обеззоленные (красная лента) по нормативному документу [3].

Кислота серная по ГОСТ 4204, раствор молярной концентрации .

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор в соотношении 1:1 (по объему) и раствор молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3.

Калий хлористый по ГОСТ 4234.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 10%.

Спирт изобутиловый по ГОСТ 6016.

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166.

Калий железосинеродистый (красная кровяная соль) по ГОСТ 4206, раствор с массовой долей 1%.

Хининсульфат или хининхлорид по нормативным документам [9, 10].

Тиаминбромид или тиаминхлорид по нормативным документам [16, 17].

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания.

1. Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

4.2. Подготовка к испытанию

4.2.1. Приготовление окислительной смеси

1 см3 свежеприготовленного раствора железосинеродистого калия смешивают с 49 см3 раствора гидроокиси натрия.

Смесь готовят в день проведения анализа.

4.2.2. Приготовление основного стандартного раствора из хининсульфата

10 мг хининсульфата растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см3 в растворе серной кислоты и доводят этой кислотой объем до метки. Раствор хранится не более 1 года в склянке из темного стекла.

4.2.3. Приготовление рабочего стандартного раствора хининсульфата

Рабочий стандартный раствор готовят непосредственно перед анализом. Для этого 1 см3 основного стандартного раствора (4.2.2) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки раствором серной кислоты.

Концентрация хининсульфата - 1 мкг/см3.

4.2.4. Приготовление основного стандартного раствора из тиаминбромида

Взвешивают 10 мг кристаллического тиаминбромида, предварительно высушенного в сушильном шкафу в течение 2 - 3 ч при температуре 100 - 105 °C, растворяют его в мерной колбе вместимостью 100 см3 в растворе соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3 и доводят этой кислотой объем до метки. Раствор содержит 100 мг тиамина в 1 см3.

Раствор хранят не более 1 мес в склянке из темного стекла в прохладном месте.

4.2.5. Приготовление рабочего стандартного раствора тиаминбромида

Рабочий стандартный раствор готовят непосредственно перед анализом.

1 см3 основного стандартного раствора тиаминбромида (4.2.4) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки дистиллированной водой.

Концентрация рабочего стандартного раствора тиаминбромида - 1 мкг/см3.

4.2.6. Контроль за содержанием витамина в стандартном растворе проводят по 6.2.4.

4.3. Проведение испытания

Навеску премикса массой 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 5 г хлористого калия и приливают 70 см3 серной кислоты. Затем колбу с реактивами встряхивают на аппарате в течение 10 мин, доводят объем в колбе до метки раствором серной кислоты, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр, отбросив первую порцию фильтрата. Переносят 2 см3 фильтрата в мерную колбу вместимостью 50 см3 и доводят до метки раствором серной кислоты. Отбирают 20 см3 разбавленного фильтрата и переносят в делительную воронку, куда приливают 20 см3 изобутилового спирта, тщательно перемешивают в течение 2 мин. После расслоения верхний слой сливают, а нижний - переносят в градуированную пробирку и доводят до объема 20 см3 раствором серной кислоты, перемешивают.

Из пробирки берут 8 см3 раствора в делительную воронку, приливают 6 см3 окислительной смеси (4.2.1), перемешивают, добавляют 20 см3 изобутилового спирта и встряхивают 2 мин. После расслоения нижний водный слой отбрасывают, а верхний (спиртовый) - фильтруют через обеззоленный фильтр (красная лента), пропуская через слой безводного сернокислого натрия (4 - 5 г) в флуорометрическую пробирку и флуорометрируют.

Для окисления стандартного раствора берут 8 см3 рабочего стандартного раствора тиамина и проводят дальнейшую его обработку, как с испытуемой пробой.

Для гашения флуоресценции в испытуемом и стандартном растворах к ним добавляют по 1 - 2 капли раствора соляной кислоты в соотношении 1:1 (по объему), перемешивают и измеряют остаточную флуоресценцию.

Если в качестве стандартного раствора используют раствор хининсульфата (или хининхлорида), то его не окисляют и не гасят, так как он имеет одно и то же значение по флуорометру, равное 72.

По стандартному раствору хининхлорида (хининсульфата) настраивают (по инструкции) прибор на деление прибора 80.

4.4. Обработка результатов испытания

Содержание витамина , X в премиксе, г/т, вычисляют по формуле

где A - показание флуорометра для испытуемого раствора до гашения;

- показание флуорометра для испытуемого раствора после гашения;

V - первоначальный объем раствора, см3;

, - разведения, см3;

C - масса витамина в стандартном растворе, мкг;

F - показания флуорометра для стандартного раствора до гашения;

- показания флуорометра для стандартного раствора после гашения;

m - масса навески, г;

- объем испытуемого раствора, взятый на испытание, см3.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности P = 0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности P = 0,95 расхождения не должны превышать 15%.

Примечание. При использовании в качестве стандартного раствора хининсульфата (хининхлорида) в расчетную формулу вместо выражения подставляют цифру 72.

Сущность метода заключается в извлечении витамина (рибофлавина) из навески путем кислотного гидролиза и измерении интенсивности флуоресценции.

5.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Флуорометр Квант-7, ФАНК-1.

pH-метр по нормативному документу [8].

Баня водяная.

Центрифуга ОПН-8.

Фильтры обеззоленные (синяя лента) по нормативному документу [3].

Колбы мерные 2-50(100, 1000)-1(2) по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-1, 6(7)-1(2)-25 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Цилиндры 1(2, 3, 4)-100 по ГОСТ 1770.

Кислота уксусная по ГОСТ 61.

Витамин по нормативному документу [11].

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор с массовой долей 5% и раствор молярной концентрации c(HCl) = 0,1 моль/дм3.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 15%.

Натрий двууглекислый по ГОСТ 4201.

Натрия гидросульфит по ГОСТ 246.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания.

1. Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

5.2. Подготовка к испытанию

5.2.1. Приготовление основного стандартного раствора витамина 

40 мг витамина растворяют в дистиллированной воде, подкисленной 10 см3 ледяной уксусной кислоты, при нагревании до 50 °C в мерной колбе вместимостью 1000 см3. Доводят объем до метки дистиллированной водой. В 1 см3 раствора содержится 40 мкг рибофлавина.

Раствор хранят в прохладном, темном месте в склянке из темного стекла не более 2 мес.

5.2.2. Приготовление рабочего стандартного раствора рибофлавина

1 см3 основного стандартного раствора рибофлавина переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки дистиллированной водой, подкисленной раствором соляной кислоты с массовой долей 5% до pH 5,5 - 6,0.

В 1 см3 раствора содержится 0,4 мкг рибофлавина.

Раствор готовят перед употреблением.

5.2.3. Контроль за содержанием витамина в стандартном растворе проводят по 6.2.4.

5.3. Проведение испытания

Навеску премикса массой 2 - 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, приливают 75 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,1 моль/дм3, смывая частицы премикса со стенок колбы. Колбу помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. Содержимое колбы периодически перемешивают.

После охлаждения колбы pH раствора доводят до значения 5,5 - 6,0 раствором гидроокиси натрия. Затем объем в колбе доводят дистиллированной водой до метки, хорошо перемешивают и центрифугируют в течение 15 мин при 8000 об/мин.

Из полученного фильтрата готовят раствор с нужным разведением (например, 1 см3 фильтрата разводят в мерной колбе вместимостью 50 см3) и определяют интенсивность флуоресценции, помещая в одну флуорометрическую пробирку 12 - 15 см3 испытуемого раствора, в другую - такое же количество рабочего стандартного раствора. Затем в эти же пробирки добавляют 2 - 3 раза по 0,1 г двууглекислого натрия и по 0,1 г гидросульфита натрия или 4 - 6 капель раствора гидроокиси натрия. Содержимое пробирок осторожно перемешивают, фильтруют, если раствор мутный, и снова измеряют интенсивность флуоресценции на приборе.

5.4. Обработка результатов испытания

Содержание витамина , X в премиксе, г/т, вычисляют по формуле

где A - показания флуорометра для испытуемого раствора до гашения флуоресценции;

- показания флуорометра для испытуемого раствора после гашения флуоресценции;

C - содержание витамина в рабочем стандартном растворе, мкг/см3;

V - первоначальный объем раствора, см3;

- окончательный объем разведения, см3;

F - показания флуорометра для стандартного раствора до гашения флуоресценции;

- показания флуорометра для стандартного раствора после гашения флуоресценции;

m - масса навески, г;

- объем раствора, взятый для разведения, см3.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности P = 0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности P = 0,95 расхождения не должны превышать 15%.

Сущность метода заключается в экстракции витаминов (тиамина) и (рибофлавина) из навески раствором соляной кислоты и определении их на жидкостном хроматографе со спектрофотометрическим детектором с использованием обращенно-фазного режима элюирования.

Метод применим в диапазоне содержания витамина от 0,05 до 0,5 г/кг в премиксе, витамина - от 0,1 до 2 г/кг в премиксе.

6.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором и систематической погрешностью измерений не выше 10%. Допускается использовать хроматографы "Цвет-306", "Цвет-3006 со спектрофотометрическим детектором" и "Милихром".

Колонка хроматографическая стальная или стеклянная высотой 150 мм и диаметром 4 мм с числом теоретических тарелок не менее 2000, заполненная сорбентом "Силасорб С-18" или "Сепарон С-18".

Спектрофотометр СФ-26 или СФ-46 (спектральный диапазон 186 - 1100 нм).

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Линейка измерительная металлическая по ГОСТ 427.

Секундомер механический по нормативному документу [15].

Сорбент "Силасорб С-18" зернением 7 мкм.

pH-метр по нормативному документу [8].

Мешалка магнитная ММ-5.

Центрифуга лабораторная ЦЭ-2 с числом оборотов 6000 в мин.

Иономер ЭБ-74 со стеклянным электродом ЭСЛ-62-07.

Микрошприц МШ-10 или микропипетка МП-2.

Колбы конические со шлифом вместимостью 100 см3 по ГОСТ 25336.

Колбы мерные 2-25(50, 100, 200)-1(2) по ГОСТ 1770.

Воронка ВФ-1-56(75)ХС или ВФ-2-75(110)ХС со стеклянным фильтром ПОР 100 по ГОСТ 25336.

Пипетки градуированные 6(7)-1(2)-10 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Ацетонитрил по нормативному документу [7].

Натрия октилсульфонат, хроматографически чистый (изготовление Германия, фирма Pylver).

Триэтиламин, перегнанный по нормативному документу [4].

Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552.

Кислота соляная по ГОСТ 3118 концентрированная и раствор молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3.

Витамин по нормативному документу [11].

Витамин по нормативным документам [16, 17].

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания.

1. Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

6.2. Подготовка к испытанию

6.2.1. Приготовление элюента

Для приготовления 1 дм3 элюента смешивают 120 см3 ацетонитрила с 880 см3 дистиллированной воды, добавляют 2,5 см3 триэтиламина, 0,5 г октилсульфоната натрия и приливают ортофосфорную кислоту до pH 7,6 по pH-метру. Полученную смесь фильтруют через стеклянный фильтр для удаления механических примесей.

Срок хранения элюента - не более 1 мес.

6.2.2. Приготовление раствора-экстрагента

К 1 дм3 дистиллированной воды прибавляют 0,8 см3 концентрированной (37%-ной) соляной кислоты, pH раствора 2 +/- 0,2.

6.2.3. Приготовление основных стандартных растворов витаминов и 

Для приготовления основных стандартных растворов витаминов и берут навески 0,1 г тиаминхлорида и 0,01 г рибофлавина. Навеску тиаминхлорида растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см3, а рибофлавина - в мерной колбе вместимостью 200 см3, при нагревании до температуры 70 - 80 °C и доводят дистиллированной водой до метки. Полученные растворы содержат в 1 см3 1 мг витамина и 0,05 мг витамина соответственно.

Срок хранения основных стандартных растворов витаминов и - не более 2 недель в холодильнике.

6.2.4. Контроль за содержанием витаминов и в основных стандартных растворах

Контроль за содержанием витаминов в основных стандартных растворах осуществляют спектрофотометрически по значениям молярных коэффициентов светопоглощения.

Для этого основные стандартные растворы разбавляют дистиллированной водой в 50 раз и измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см.

Массовую концентрацию витаминов и , c, рассчитывают по формуле

где D - оптическая плотность;

E - молярный коэффициент;

l - толщина слоя раствора, 1 см.

Массовую концентрацию витаминов , , и , , мг/см3, рассчитывают соответственно по формулам:

где 205 - молярный коэффициент светопоглощения тиаминхлорида при рабочей длине волны 268 нм;

324 - молярный коэффициент светопоглощения рибофлавина при рабочей длине волны 445 нм.

6.2.5. Приготовление рабочего стандартного раствора витаминов и 

Из основных стандартных растворов готовят рабочие стандартные растворы с содержанием витаминов - 0,02 мг и - 0,025 мг в 1 см3.

Для этого в мерную колбу вместимостью 50 см3 помещают 1 см3 основного стандартного раствора тиаминхлорида (6.2.3) и 25 см3 основного стандартного раствора рибофлавина (6.2.3), доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Рабочий стандартный раствор готовят в день испытаний.

6.3. Проведение испытания

6.3.1. Экстракция витаминов и 

Навеску премикса массой 1 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 см3 и приливают 10 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3. Колбу ставят на магнитную мешалку с включением нагрева. Перемешивание и нагрев осуществляют в течение 10 мин. Полученную суспензию переливают в центрифужную пробирку и центрифугируют при 5000 - 6000 об/мин в течение 3 мин. Центрифугат сливают в мерную колбу вместимостью 25 см3. Коническую колбу с остатком раствора смывают небольшим количеством (около 5 см3) раствора соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3, сливают раствор в центрифужную пробирку и снова центрифугируют. Центрифугат соединяют с первым в той же мерной колбе. Промывание центрифугированием повторяют 3 - 4 раза, каждый раз сливая промывные воды в ту же колбу. После этого раствор в мерной колбе доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют или дополнительно центрифугируют для очищения от механических примесей и взвешенных частиц. Приготовленный раствор используют для хроматографического анализа.

6.3.2. Хроматографирование

Хроматографирование осуществляют в следующих условиях. Разделение проводят на колонке 4 x 150 мм, заполненной сорбентом (6.2.4).

Подвижная фаза - элюент (6.2.1).

Рабочая длина волны спектрофотометрического детектора хроматографа 254 нм. Скорость элюирования - 1,2 см3/мин. Время удерживания для витамина составляет 6 мин, а для витамина - 8 мин. Объем загрузки анализируемого раствора - 10 мкдм3. Для насыщения колонки в начале работы производится 3 - 5 загрузок, отмечая высоты пиков. При достижении постоянной высоты можно приступить к испытаниям. Анализируемые растворы хроматографируют каждый по три раза в одинаковых условиях. В этих же условиях хроматографируют рабочие стандартные растворы витаминов и .

Измеряют высоты пиков как расстояние от вершины пика до линии, проведенной в основании пика (Приложение А, рисунок А.1, и Приложение Б, рисунок Б.1).

6.4. Обработка результатов испытания

Содержание витаминов и , и в премиксе, г/т, вычисляют по формуле

где - высота пика витамина на хроматограммах экстракта из премикса, мм;

- массовая концентрация витамина в рабочем стандартном растворе, мг/см3;

- объем премикса с экстрактом, см3;

- высота пика витамина на хроматограммах рабочего стандартного раствора, мм;

m - масса навески премикса, г.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности P = 0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности P = 0,95 расхождения не должны превышать 15%.

Сущность метода заключается в экстракции холинхлорида дистиллированной водой, образовании в присутствии трехзамещенного фосфата натрия комплекса рейнеката холинхлорида и измерении интенсивности окраски его ацетоновых растворов спектрофотометрически.

7.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Фотоэлектроколориметр - ФЭК-56М, КФК или спектрофотометр типа СФ-26.

Насос вакуумный по ГОСТ 25336.

Центрифуга ОПН-8.

Колбы конические вместимостью 50 - 100 см3 по ГОСТ 25336.

Эксикатор вакуумный по ГОСТ 25336.

Стаканы химические вместимостью 200 - 250 см3 по ГОСТ 25336.

Баня водяная.

Колбы конические с притертой пробкой вместимостью 100 и 250 см3 по ГОСТ 25336.

Воронка ВФО-40-ПОР-16 (Шотта N 2) по ГОСТ 25336.

Аппарат для встряхивания жидкости типа АВУ-1.

Колбы мерные 2-25(100)-1(2) по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-2, 6(7)-1(2)-5(10, 25) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Цилиндр мерный 1(2, 3, 4)-100 по ГОСТ 1770.

Фильтры обеззоленные (синяя лента) по нормативному документу [3].

Холинхлорид кристаллический по нормативному документу [18].

Спирт этиловый по ГОСТ 18300.

Натрий фосфорнокислый 12-водный по ГОСТ 9337, раствор с массовой долей 0,1%.

Ацетон по ГОСТ 2603.

Спирт изопропиловый по нормативному документу [1].

Рейнекат аммония по нормативному документу [5].

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания.

1. Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

7.2. Подготовка к испытанию

7.2.1. Приготовление осаждающего реактива

2 г рейнеката аммония растворяют в 100 см3 этилового спирта в конической колбе при нагревании на водяной бане при температуре (40 +/- 2) °C в течение 20 мин. После охлаждения раствор фильтруют через обеззоленный складчатый фильтр. Раствор готовят в день определения.

7.2.2. Приготовление стандартного раствора холинхлорида

0,1 г кристаллического холинхлорида высушивают до постоянной массы в вакуум-эксикаторе и растворяют его в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см3. Доводят до метки дистиллированной водой. Стандартный раствор содержит 1 мг холинхлорида в 1 см3.

Допускается приготовление стандартного раствора из 70%-ного раствора холинхлорида с пересчетом на 100%-ную активность.

7.2.3. Построение градуировочного графика

В 5 конических колб вместимостью 50 см3 помещают 1, 2, 5, 7, 10 см3 стандартного раствора холинхлорида соответственно, добавляют 10 см3 раствора фосфата натрия и 5 см3 раствора рейнеката аммония и далее проводят все испытания по 7.2.4. Интенсивность окрашенных растворов измеряют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром или спектрофотометре при длине волны 526 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно ацетона и на основании его показаний строят градуировочный график.

7.2.4. Проведение испытания

Навеску премикса массой 1 - 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, вносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, приливают 50 см3 дистиллированной воды, нагревают до 80 °C и встряхивают на аппарате 15 мин. Охлаждают колбу, объем доводят до метки дистиллированной водой и фильтруют через обеззоленный складчатый фильтр в стакан. Отбирают 5 - 20 см3 фильтрата в колбу с притертой пробкой, приливают 10 см3 раствора фосфорнокислого натрия и 5 см3 раствора рейнеката аммония. Колбу с содержимым встряхивают и оставляют на 2 ч при температуре 4 °C. После выпадения кристаллов холинхлорида раствор фильтруют на воронке Шотта N 2 с асбестовым слоем, используя вакуумный насос. Кристаллы, оставшиеся на фильтре, промывают 4 - 5 порциями (по 5 см3) охлажденного изопропилового спирта (спирт хранится в холодильнике до полного использования). Меняют колбу и растворяют кристаллы ацетоном, приливая его в три приема по 7 см3, каждый раз осторожно размешивая верхний асбестовый слой с осадком.

Содержимое колбы фильтруют в мерную колбу вместимостью 25 см3. Объем доводят в колбе ацетоном до метки. Интенсивность окрашенных растворов измеряют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром или спектрофотометре при длине волны 526 нм в кюветах толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно ацетона.

7.3. Обработка результатов испытания

Содержание 70%-ного холинхлорида, X в премиксе, г/т, рассчитывают по формуле

где K - масса холинхлорида, найденная по градуировочному графику, мм;

1,43 - коэффициент пересчета на 70%-ный раствор холинхлорида;

V - общий объем экстракта, см3;

m - масса навески, г;

- объем раствора, взятый на проведение анализа, см3.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности P = 0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности P = 0,95 расхождения не должны превышать 15%.

Сущность метода заключается в кислотном гидролизе связанных форм витамина (никотиновой кислоты), очистке гидролизата, получении окрашенного раствора и колориметрическом определении в сравнении со стандартным раствором.

8.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Фотоэлектроколориметр типа ФЭК-56, КФК или спектрофотометр типа СФ-26 или аналогичные с диапазоном длин волн 400 - 440 нм.

Баня водяная.

Баня ледяная.

Воронка Бюхнера N 3 или N 4 по ГОСТ 9147.

Палочки стеклянные.

Стакан химический вместимостью 1 и 2 дм3 по ГОСТ 25336.

Склянки из темного стекла.

Колбы конические вместимостью 250 дм3 по ГОСТ 25336.

Бюретка 1-2-25 по ГОСТ 29251 и ГОСТ 29252.

Фильтры обеззоленные (красная и синяя ленты) по нормативному документу [3].

Колбы мерные 2-100(500, 1000)-1(2) по ГОСТ 1770.

Воронки стеклянные по ГОСТ 25336.

Пипетки 1(2, 4, 5)-1(2)-1(2), 6(7)-1(2)-5(10, 25) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Пробирки с притертой пробкой вместимостью 15 см3 по ГОСТ 1770.

Цилиндры мерные 1(2, 3, 4)-50(100, 500) по ГОСТ 1770.

Бром по ГОСТ 4109.

Калий роданистый по ГОСТ 4139 или аммоний роданистый по ГОСТ 27067, растворы с массовыми долями 1 и 10%.

Кальций углекислый по ГОСТ 4530.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации c(HCl) = 0,5 моль/дм3 (0,5 н.).

Кислота серная по ГОСТ 4204, растворы с молярными концентрациями и .

Витамин по нормативному документу [12].

Метол по ГОСТ 25664, раствор с массовой долей 6%.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, растворы молярных концентраций c(NaOH) = 4 моль/дм3 и c(NaOH) = 10 моль/дм3.

Спирт этиловый по ГОСТ 18300.

Уголь активный по ГОСТ 6217.

Фенолфталеин по нормативному документу [6].

Цинк сернокислый по ГОСТ 4174, раствор с массовой долей 80%.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания.

1. Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. и ч.д.а.

8.2. Подготовка к испытанию

8.2.1. Перекристаллизация метола

500 см3 раствора серной кислоты молярной концентрации нагревают до кипения, добавляют 100 г метола и снова доводят до кипения. Если раствор сильно окрашен, к нему добавляют 10 г активного угля. Кипящий раствор быстро фильтруют через предварительно нагретую (кипящей водой) воронку Бюхнера, фильтрат переносят в большой химический стакан, приливают 0,7 дм3 этилового спирта (96°), размешивают, помещают в ледяную баню и оставляют на несколько часов в темном месте.

Выпавшие в осадок кристаллы отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают на фильтре 2 - 3 раза этиловым спиртом, порциями по 30 - 40 см3 и высушивают на воздухе в темном месте.

Подготовленный метол хранят в склянке из темного стекла в холодильнике до полного использования.

8.2.2. Приготовление раствора метола

Навеску перекристаллизированного метола массой (8 +/- 0,002) г вносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем до метки раствором соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,5 моль/дм3. Раствор готовят перед употреблением.

8.2.3. Приготовление бромной воды

В темную склянку с притертой пробкой 100 см3 дистиллированной воды, добавляют в вытяжном шкафу 4 - 5 см3 брома, хорошо встряхивают и оставляют на 1 - 3 сут для лучшего насыщения воды бромом. Бромную воду охлаждают в емкости со льдом в течение 30 мин.

8.2.4. Приготовление роданбромидного раствора

К 30 см3 охлажденной бромной воды по каплям прибавляют раствор роданистого калия или роданистого аммония с массовой долей 10% до светло-желтого окрашивания. Затем по каплям прибавляют эти же растворы с массовой долей 1% до полного обесцвечивания бромной воды. К обесцвеченному раствору постепенно, небольшими порциями, по 20 - 50 мг, добавляют углекислый кальций до прекращения выделения пузырьков газа.

Раствор фильтруют от осадка через обеззоленный фильтр с синей лентой в склянку из темного стекла с притертой пробкой и хранят на холоде. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

8.2.5. Приготовление основного стандартного раствора витамина 

(500 +/- 0,002) мг витамина помещают в мерную колбу вместимостью 500 см3, добавляют 200 см3 дистиллированной воды, 5 см3 раствора серной кислоты молярной концентрации и после растворения кристаллов доводят объем дистиллированной водой до метки.

В 1 см3 раствора содержится 1000 мкг витамина .

Раствор годен к употреблению в течение 6 мес при хранении в холодильнике.

8.2.6. Приготовление рабочего стандартного раствора витамина 

5 см3 основного стандартного раствора витамина разводят дистиллированной водой в колбе вместимостью 1 дм3, доводят до метки этой же водой и тщательно перемешивают. В 1 см3 раствора содержится 5 мкг витамина . Раствор готовят в день проведения анализа.

8.3. Проведение испытания

Навеску массой 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, смывая горлышко колбы 60 - 65 см3 раствора серной кислоты молярной концентрации . Содержимое перемешивают и колбу помещают в кипящую водяную баню на 40 мин, периодически перемешивая содержимое. По окончании гидролиза колбу охлаждают до комнатной температуры, доводят объем дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отбрасывая первые 5 - 10 см3 фильтрата.

Отбирают 10 - 20 см3 фильтрата в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем до метки дистиллированной водой. Затем 25 см3 полученного раствора помещают в цилиндр вместимостью 50 см3, добавляют 1 - 2 капли раствора фенолфталеина и нейтрализуют, внося по каплям раствор гидроокиси натрия молярной концентрации c(NaOH) = 10 моль/дм3 до получения слабо-розового окрашивания. Избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации , добавляя по каплям до исчезновения розового окрашивания. Раствор охлаждают, добавляют 2 см3 раствора сернокислого цинка и 1 - 2 капли этилового спирта (для устранения пены).

Из пипетки по каплям добавляют раствор гидроокиси натрия молярной концентрацией c(NaOH) = 4 моль/дм3, одновременно перемешивая палочкой до образования осадка и появления бледно-розового окрашивания раствора. Избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации (до исчезновения розового окрашивания) и оставляют стоять в течение 10 мин, периодически перемешивая. Палочку вынимают, обмывают над цилиндром дистиллированной водой и доводят объем до 50 см3, перемешивают и фильтруют через бумажный складчатый фильтр.

Цветную реакцию проводят в восьми пробирках с притертыми пробками: в одну пробирку вносят 5 см3 дистиллированной воды (контроль на реактивы, ); в три пробирки вносят по 5 см3 рабочего стандартного раствора, B; в четыре пробирки вносят по 5 см3 полученного фильтрата, из них 2 пробирки с испытуемым раствором A; две - поправка на аминореагирующие вещества, .

Все пробирки, кроме , помещают на 5 мин в водяную баню при температуре (50 +/- 2) °C. После этого в 2 пробирки вносят по 2 см3 дистиллированной воды, а во все остальные пробирки - по 2 см3 роданбромидного раствора из бюретки в вытяжном шкафу. Пробирки закрывают пробками, перемешивают и помещают в баню при той же температуре на 10 мин. По истечении этого времени пробирки вынимают, охлаждают водой до комнатной температуры и ставят на 10 мин в темное место. Затем в каждую пробирку приливают по 3 см3 раствора метола, перемешивают и оставляют на 1 ч в темном месте при комнатной температуре. По истечении этого времени растворы фильтруют через бумажный складчатый фильтр, если они мутные, и колориметрируют на фотоэлектроколориметре (синий светофильтр) или спектрофотометре при длине волны 400 - 440 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно дистиллированной воды.

8.4. Обработка результатов испытания

Содержание витамина , X в премиксе, г/т, рассчитывают по формуле

где A - оптическая плотность испытуемого раствора (среднее из двух параллельных определений);

- оптическая плотность раствора - поправки на аминореагирующие вещества (среднее из двух параллельных определений);

V - объем гидролизата, см3;

- объем разведения, см3;

- объем раствора после обработки сернокислым цинком, см3;

C - масса витамина в измеряемом стандартном растворе, мкг;

B - оптическая плотность стандартного раствора (среднее из трех параллельных определений);

- оптическая плотность раствора - контроль на реактивы;

m - масса навески премикса, г;

- объем, взятый на дополнительное разведение, см3;

- объем гидролизата, взятый на обработку сернокислым цинком, см3;

- объем раствора, взятый для проведения цветной реакции, см3.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности P = 0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности P = 0,95 расхождения не должны превышать 15%.

9.1. Определение витамина с применением жидкостного микроколоночного хроматографа отечественного производства марки "Милихром"

Сущность метода заключается в экстракции витамина (никотиновой кислоты) из навески премикса раствором соляной кислоты и последующем определении его содержания в испытуемом растворе с помощью хроматографа "Милихром".

9.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Хроматограф жидкостный микроколоночный "Милихром" со спектрофотометрическим детектором (спектральный диапазон от 190 до 360 нм).

Колонка хроматографическая размером 2 x 120 мм с числом теоретических тарелок не менее 4000, заполненная одним из следующих сорбентов: Силасорб С18, Силасорб SPHC 18, Сепарон С18.

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Колбы конические КН-100, КН-200 по ГОСТ 19908.

Баня водяная с терморегулятором.

Пипетки 2-1(2)-1, 2-1(2)-5, 2-1(2)-10 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Колбы мерные 2-50-1(2), 2-100-1(2), 2-200-1(2) по ГОСТ 1770.

Воронка ВФ-1-40-ПОР 16-ХС по ГОСТ 25336.

Воронка 71 по ГОСТ 19908.

Стакан ВН-50, ВН-200 по ГОСТ 19908.

pH-метр по нормативному документу [8]

Цилиндр мерный 2-50, 2-100 по ГОСТ 1770.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 40%.

Кислота серная по ГОСТ 4204, раствор молярной концентрации .

Кислота уксусная по ГОСТ 61 с массовой долей 95%.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации c(HCl) = 0,1 моль/дм3.

Витамин по нормативному документу [12].

Фенолфталеин по нормативному документу [6].

Триметиламин по нормативному документу [2].

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Примечания.

1. Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

9.1.2. Подготовка к испытанию

9.1.2.1. Приготовление элюента для хроматографии

Трехкомпонентный элюент готовят смешиванием уксусной кислоты, дистиллированной воды и триметиламина в объемном соотношении 3:95:2. Для этого в мерную колбу вместимостью 500 см3 вносят пипеткой 15 см3 концентрированной уксусной кислоты, затем цилиндром вносят 100 см3 дистиллированной воды и перемешивают. Добавляют 10 см3 триметиламина, перемешивают, доводят до метки дистиллированной водой и снова тщательно перемешивают. Приготовленный раствор фильтруют через стеклянный фильтр ПОР 16 и помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой. Полученный элюент хранят не более 1 мес в холодильнике.

9.1.2.2. Подготовка хроматографической колонки

Через колонку пропускают элюент в количестве 20 - 30 свободных объемов колонки, т.е. два полных шприца насоса хроматографа при расходе элюента сначала 50 мкдм3/мин, а затем 100 мкдм3/мин. Промывку колонки заканчивают при получении стабильной нулевой линии.

После стабилизации колонки проводят ее насыщение витамином . Для этого выполняют 7 - 10 анализов более концентрированного градуировочного раствора витамина . Насыщение колонки прекращают, когда расхождение между последовательными определениями не превышает 3,0%.

9.1.2.3. Приготовление раствора серной кислоты молярной концентрации .

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 30 - 40 см3 дистиллированной воды и добавляют 14,2 см3 концентрированной серной кислоты. Осторожно перемешивают и добавляют еще 35 - 40 см3 дистиллированной воды. Когда раствор остынет до комнатной температуры, осторожно доводят объем дистиллированной водой до метки.

9.1.2.4. Построение градуировочного графика

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,1 г витамина и приливают 70 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,1 моль/дм3. Колбу помещают в водяную баню и нагревают в течение 10 мин при температуре 75 °C. Затем охлаждают и содержимое количественно переносят в химический стакан вместимостью 200 см3. Добавляют 1 - 2 капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина, раствор гидроокиси натрия с массовой долей 40% до образования розового окрашивания, избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации . Раствор фильтруют через бумажный фильтр с синей полосой в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем до метки дистиллированной водой. Получают основной стандартный раствор витамина массовой концентрации 1 мг/см3. Из этого раствора готовят рабочие растворы, содержащие 0,4; 0,8; 1,0, 1,5; 2,0; 3,0 мг витамина в 50 см3. Для этого соответственно 0,4; 0,8; 1,0; 1,5; 2,0 и 3,0 см3 основного раствора помещают в 6 мерных колб вместимостью 50 см3 и доводят до метки дистиллированной водой.

Рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе при следующих условиях:

хроматографическая колонка 2 x 120 мм;

сорбент - Силасорб С 18, Силасорб SPH С 18, Сепарон С 18;

трехкомпонентный элюент на основе уксусной кислоты;

объем пробы - 6 мкдм3;

длина волны - 260 нм;

скорость подачи элюента - 80 - 100 мкдм3/мин;

постоянная времени - 0,2 с.

Удерживаемый объем пика витамина - 560 - 580 мкдм3 (может меняться в зависимости от длины колонки и плотности ее заполнения). Каждый раствор хроматографируют 2 раза. После выхода пика колонку промывают, прокачивая через нее 150 - 200 мкдм3 элюента до выхода на нулевую линию.

Значение средних высот хроматографических пиков (в единицах оптической плотности е.о.п.) откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс - количество витамина в 50 см3 раствора.

Градуировочный график строят так же, откладывая по оси ординат средние высоты хроматографических пиков, выраженные в единицах длины (миллиметрах).

Построение градуировочного графика можно заменить расчетом коэффициентов наклона K, мг/е.о.п., по формуле

где - коэффициент наклона градуировочного графика для i-го градуировочного раствора, мг/е.о.п.;

n - количество точек, по которым строится градуировочный график.

Значение коэффициента наклона градуировочного графика K, мг/е.о.п. или мг/мм, вычисляют по формуле

где - содержание витамина в соответствующем i-м градуировочном растворе;

- высота i-го хроматографического пика, е.о.п. или мм.

9.1.2.5. Проверка градуировочного графика

Градуировочный график контролируют не реже 1 раза в неделю. Для этого 1 - 2 рабочих раствора витамина следует анализировать, как указано в 9.1.2.4.

Отклонение полученных результатов от измеренных в момент построения градуировочного графика a, %, определяют по формуле

где , - высота хроматографического пика, определенная при построении градуировочного графика и в момент проверки соответственно, е.о.п. или мм.

При отклонении результатов более чем на 5% строят новый градуировочный график.

Градуировочные растворы хранят в холодильнике в стеклянной посуде с притертой пробкой. Срок годности растворов не более 1 мес.

9.1.3. Проведение кислотного гидролиза

Навеску премикса массой 1 - 5 г, взятую с погрешностью не более 0,001 г, помещают в коническую колбу вместимостью 100 см3 и добавляют 3 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,1 моль/дм3. Колбу нагревают на водяной бане при температуре (75 +/- 1) °C в течение 10 мин, охлаждают, содержимое колбы количественно переносят в химический стакан вместимостью 200 см3. Добавляют 1 - 2 капли спиртового раствора фенолфталеина с массовой долей 1% и раствор гидроокиси натрия с массовой долей 40% до образования розового окрашивания. Избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации . После 10-минутного выдерживания раствор фильтруют через обеззоленный фильтр с синей лентой в мерную колбу вместимостью 50 см3 и доводят объем до метки дистиллированной водой.

9.1.4. Хроматографирование

Полученный экстракт хроматографируют, как в 9.1.2.4. Для определения содержания витамина в премиксах проводят 2 параллельных анализа, начиная со взятия навески. Каждый экстракт хроматографируют два раза, находят среднеарифметическое значение высоты пиков в единицах оптической плотности или миллиметрах и по градуировочному графику определяют содержание витамина в миллиграммах, Приложение В, рисунок В.1.

9.1.5. Обработка результатов испытания

Содержание витамина , X в премиксе, мг/кг, вычисляют по формуле

где C - содержание витамина, найденное по градуировочному графику, мг;

m - навеска премикса, г.

При использовании коэффициента наклона K вместо градуировочного графика содержание витамина в премиксе, мг/г, вычисляют по формуле

где K - коэффициент наклона градуировочного графика, мг/е.о.п.;

A - высота хроматографического пика, е.о.п.;

m - масса навески премикса, г.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности P = 0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности P = 0,95 расхождения не должны превышать 15%.

9.2. Определение витамина с применением жидкостных хроматографов импортного производства

Сущность метода заключается в экстракции витамина из навески премикса раствором соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3 и хроматографическом анализе его содержания в испытуемом растворе с использованием жидкостного хроматографа со спектрофотометрическим детектором.

Метод применим в диапазоне содержания витамина от 0,2 до 4 г/кг премикса.

9.2.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором при спектральном диапазоне от 200 до 300 нм. Возможно использование детектора при постоянной длине волны 254 нм.

Колонка хроматографическая стальная или стеклянная высотой 150 - 200 мм и диаметром 2,6 - 4,6 мм с числом теоретических тарелок не менее 3000 на 1 м, заполненная сорбентом "Силасорб С-18" или "Сепарон С-18" с зернением 7,5 мкм.

Весы лабораторные не ниже 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Центрифуга лабораторная ЦЭ-2 с числом оборотов 6000 в минуту.

Колбы мерные 2-50(100)-1(2) по ГОСТ 1770.

Иономер ЭВ-74 со стеклянным электродом ЭСЛ-63-07.

Пипетка 4-1(2)-1 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Ацетонитрил по нормативному документу [7].

Тетрабутиламмоний хлористый по нормативному документу [14].

Тетрабутиламмоний бромистый по нормативному документу [13].

Витамин по нормативному документу [12].

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Примечания.

1. Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

9.2.2. Подготовка к испытанию

9.2.2.1. Приготовление элюента для хроматографии

В колбе вместимостью 1 дм3 смешивают 120 см3 ацетонитрила с 880 см3 дистиллированной воды, добавляют (2 +/- 0,002) г хлористого (бромистого) тетрабутиламмония. Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр для удаления механических примесей и помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой.

Полученный раствор можно хранить в течение 1 мес.

9.2.2.2. Приготовление раствора экстрагента

Для экстракции витамина используют раствор соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3, который готовят прибавлением к 1 дм3 дистиллированной воды 0,6 см3 концентрированной 37%-ной соляной кислоты. Значение pH должно быть 2 +/- 0,2.

9.2.2.3. Приготовление основного стандартного раствора витамина 

Навеску витамина массой 0,1 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см3 и доводят до метки этой же водой. Полученный раствор содержит 1 мг витамина в 1 см3.

Раствор хранят в холодильнике до полного использования.

9.2.2.4. Приготовление рабочего стандартного раствора витамина 

Рабочий стандартный раствор никотиновой кислоты готовят в зависимости от предполагаемого содержания ее в премиксе по таблице 1. Рабочий стандартный раствор готовят в день проведения контроля.

9.2.3. Проведение испытания

9.2.3.1. Экстрагирование

Навеску премикса массой 1 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, приливают 2/3 объема раствора соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3, перемешивают и оставляют стоять в течение 20 мин, несколько раз при этом перемешивая, после чего доводят до метки тем же раствором. Полученную суспензию перемешивают и часть отливают в центрифужную пробирку, центрифугируют в течение 5 мин при 6000 об/мин. Полученный центрифугат используют для хроматографического анализа.

9.2.3.2. Хроматографирование

Хроматографирование осуществляют при следующих условиях: колонка, заполненная сорбентом, подвижная фаза - элюент по 9.2.2.1, рабочая длина волны спектрофотометрического детектора 262 нм (или 254 нм), скорость элюирования - 1,5 см3/мин, температура - комнатная. При данных условиях проводят 3 - 5 загрузок стандартного раствора по 5 мкдм3, отмечая время выхода пика витамина в секундах и высоту пика относительно базисной линии. При достижении постоянной высоты можно приступать к контролю. Загружают по 3 раза в одинаковых условиях 5 - 10 мкдм3 стандартного раствора витамина массовой концентрации 0,01 - 0,04 мг в 1 см3 в зависимости от состава премикса (10 мкдм3 раствора массовой концентрации 0,01 - 0,02 мг/см3 или 5 мкдм3 раствора массовой концентрации 0,04 мг/см3) и экстракт премикса после центрифугирования. По времени выхода определяют пик витамина в экстракте и измеряют высоту пика как расстояние от вершины пика до линии, проведенной в основании пика (Приложение Г, рисунок Г.1). Измеряя и сравнивая высоты пиков на хроматограммах, вычисляют содержание витамина в премиксах.

9.2.3.3. Обработка результатов испытания

Содержание витамина , X в премиксе, г/кг, вычисляют по формуле

где - концентрация витамина в рабочем стандартном растворе, мг/см3;

- высота пика витамина на хроматограмме испытуемого раствора, мм;

V - общий объем экстракта, см3;

- высота пика витамина на хроматограмме рабочего стандартного раствора, мм;

m - масса навески, г.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности P = 0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности P = 0,95 расхождения не должны превышать 15%.

10.1. Работы с концентрированными кислотами, щелочами и др. летучими веществами должны проводиться в вытяжном шкафу.

10.2. Необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с электроприборами.