1. Разработан Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ГУ ВНИИВСГЭ), Институтом питания РАМН и Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности (ГУ ВНИМИ).

Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 186 "Молоко и молочные продукты".

2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 26 апреля 2000 г. N 127-ст.

3. Введен впервые.

4. Переиздание. Сентябрь 2005 г.

Настоящий стандарт распространяется на натуральное коровье молоко - сырье, пастеризованное, стерилизованное и предварительно восстановленное сухое молоко (далее - молоко) и устанавливает микробиологические и рецепторные методы определения наличия антибиотиков.

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

ГОСТ 2493-75 Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия

ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия

ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 23454-79 Молоко. Методы определения ингибирующих веществ

ГОСТ 24065-80 Молоко. Методы определения соды

ГОСТ 24066-80 Молоко. Методы определения аммиака

ГОСТ 24067-80 Молоко. Метод определения перекиси водорода

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

(ссылка введена Изменением N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования.

3.1. Сущность метода

Метод основан на способности антибиотиков, содержащихся в молоке, диффундировать в агаровую среду со спорами тест-микроба и препятствовать его росту, что приводит к образованию прозрачных зон ингибиции. Наличие любого антибиотика в молоке устанавливают по диаметру зоны ингибиции.

3.2. Аппаратура, реактивы и материалы

3.2.1. Аппаратура, реактивы и материалы по ГОСТ 9225 и указанные в 3.2.2 - 3.2.16.

3.2.2. Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

3.2.3. Центрифуга частотой вращения и разделяющим фактором 750 м/с2.

3.2.4. Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

3.2.5. Колба коническая по ГОСТ 25336, вместимостью 250 см³.

3.2.6. Линейка по ГОСТ 427, пределом измерения 150 мм или аппарат Микрофот 5ПО-1.

3.2.7. Пробойник диаметром 10 мм или сверло пробочное N 4.

3.2.8. Пипетка градуированная по ГОСТ 29227, 2-го класса точности, вместимостью 25 см³.

3.2.9. Гидролизат кормовых дрожжей.

3.2.10. Диски со стрептомицином.

3.2.11. Оптический стандарт мутности ОСО 42-28-29-86.

3.2.12. Препарат СКИВ.

3.2.13. Стандарт стрептомицина РСО 9347-194-00494189-99.

3.2.14. Тест-микроб Bac. stearothermophilus ВКМВ-510, выпускаемый Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

3.2.15. Фуксин основной, спиртовой раствор концентрации 50 г/дм³.

3.2.16. Экстракт дрожжевой.

Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже, а также реактивы по качеству не ниже указанных.

3.3. Отбор проб

3.3.1. Отбор проб - по ГОСТ 9225.

3.3.2. Пробы молока до испытания допускается хранить в холодильнике при температуре (5 +/- 1) °C не более 24 ч.

3.3.3. Анализу подлежат пробы молока, давшие положительный результат по ГОСТ 23454 и отрицательный - по ГОСТ 24065, ГОСТ 24066 и ГОСТ 24067.

3.4. Подготовка к анализу

3.4.1. Подготовка посуды и материалов

3.4.1.1. Всю новую посуду, предназначенную для микробиологических исследований, кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты объемной доли 1 - 2%) в течение 15 мин, затем ополаскивают дистиллированной водой.

Вымытую посуду стерилизуют в сушильном шкафу при температуре (160 +/- 5) °C в течение 2 ч или в автоклаве при (121 +/- 2) °C в течение (30 +/- 1) мин с последующим подсушиванием.

Чашки Петри, пипетки и цилиндры стерилизуют завернутыми в бумагу или в металлических пеналах. В конец пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты. Пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками и обертывают бумагой. Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками.

3.4.2. Приготовление питательных сред

3.4.2.1. Для получения спор Bac. stearothermophilus ВКМВ-510 используют питательную среду следующего состава: дрожжевой экстракт - 10,0 г, пептон - 20,0 г, глюкоза - 0,5 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см³.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают все компоненты питательной среды, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, доводят объем раствора водой до метки и устанавливают pH среды по pH-метру, равный (7,1 +/- 0,1). Разливают раствор в колбы по 200,0 см³ и стерилизуют его при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.

3.4.2.2. Для проведения анализа готовят агаровую среду следующего состава: гидролизат кормовых дрожжей - 1,0 г, пептон - 0,4 г, хлористый натрий - 0,1 г, агар - 1,6 г, дистиллированная вода - до 100,0 см³.

В колбу вместимостью 200 см³ вносят 100 см³ дистиллированной воды и все компоненты среды, перемешивают до полного растворения и нагревают до кипения. Затем охлаждают до температуры (55 +/- 5) °C, устанавливают pH среды по pH-метру, равный (7,3 +/- 0,1), и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.

3.4.2.3. Для проведения анализа допускается применять питательные среды указанного в 3.4.2.1 и 3.4.2.2 состава промышленного изготовления.

3.4.3. Получение спор тест-микроба

3.4.3.1. Среду по 3.4.2.1 засевают 2 - 3 см³ 18 - 20-часовой тест-культуры Bac. stearothermophilus ВКМВ-510, выращенной в пробирках с этой же средой, тщательно перемешивают и помещают в термостат температурой (55 +/- 1) °C на 3 сут.

После окончания инкубации из посевов делают мазки, окрашивают их спиртовым раствором основного фуксина 50 г/дм³ и микроскопируют.

При наличии в поле зрения 90 - 95% свободных сформировавшихся спор колбы с посевами помещают на 16 - 18 ч в холодильник для осаждения. Надосадочную жидкость из колбы сливают, а осадок разливают по стерильным центрифужным пробиркам и прогревают в водяной бане при температуре внутри пробирок (67 +/- 2) °C в течение (30 +/- 1) мин. Пробирки центрифугируют 20 - 30 мин. Осадок отмывают стерильной дистиллированной водой (не менее трех раз) до получения прозрачной жидкости над ним.

Взвесь спор вторично прогревают при температуре (67 +/- 2) °C в течение (30 +/- 1) мин. Полученную взвесь переносят в бактериологические пробирки и хранят в холодильнике не более 2 мес.

3.4.4. Приготовление засеянной агаровой среды

3.4.4.1. В пробирки отбирают взвесь спор тест-микроба по 3.4.3.1 и разводят стерильной дистиллированной водой до получения суспензии спор, визуально соответствующей 10 единицам по оптическому стандарту мутности.

3.4.4.2. К 100 см³ расплавленной и охлажденной до (60 +/- 2) °C среды по 3.4.2.2 добавляют 2,5 см³ водного раствора глюкозы массовой долей 40% и 4 см³ суспензии спор по 3.4.4.1. Смесь среды и спор тщательно перемешивают и разливают градуированной пипеткой по (11 +/- 1) см³ в чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности стола.

3.4.4.3. Чашки засевают непосредственно перед употреблением.

В некоторых случаях чашки хранят в холодильнике при температуре (5 +/- 1) °C не более 2 сут. Перед использованием их прогревают в термостате при (55 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин.

3.4.5. Приготовление обезжиренного стерильного молока

3.4.5.1. Обезжиренное стерильное молоко получают из цельного молока кислотностью 16 - 18 °T, предварительно проверенного на отсутствие ингибирующих веществ по ГОСТ 23454. В пробирки разливают обезжиренное молоко по 10 см³ и стерилизуют при в течение (10 +/- 1) мин.

Допускается использовать препарат СКИВ.

3.4.6. Приготовление контрольного разведения стрептомицина активностью 2,5 мкг/см³ (Ед/г)

3.4.6.1. Контрольное разведение стрептомицина используют для проверки активности роста тест-микроба.

3.4.6.2. Контрольное разведение стрептомицина готовят в фосфатных буферных растворах.

Состав раствора 1: двузамещенный фосфорнокислый калий - 2,0 г, однозамещенный фосфорнокислый калий - 8,0 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см³.

В мерной колбе вместимостью 1000 см³ растворяют компоненты в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем водой до метки. Устанавливают pH раствора по pH-метру, равный (6,1 +/- 0,1), и стерилизуют при температуре (112 +/- 2) °C в течение (30 +/- 1) мин. Срок хранения раствора - не более 30 сут при температуре (5 +/- 1) °C.

Состав раствора 2: двузамещенный фосфорнокислый калий - 16,73 г, однозамещенный фосфорнокислый калий - 0,523 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см³.

В мерной колбе вместимостью 1000 см³ растворяют компоненты в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем водой до метки. Устанавливают pH раствора по pH-метру, равный (7,9 +/- 0,1), и стерилизуют при температуре (112 +/- 2) °C в течение (30 +/- 1) мин. Срок хранения раствора - не более 30 сут при температуре (5 +/- 1) °C.

3.4.6.3. Контрольное разведение готовят из основного раствора стрептомицина активностью 500 мкг/см³, который получают растворением 5 мг стандарта антибиотика, взвешенного с отсчетом показания весов до 0,1 мг, в буферном растворе 1 по 3.4.6.2. Объем буферного раствора составляет 0,01 активности антибиотика.

Пример: При активности стандарта стрептомицина 760 мкг/мг навеску антибиотика (5 мг) растворяют в 7,6 см³ буферного раствора 1 и получают основной раствор активностью 500 мкг/см³.

Основной раствор антибиотика хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой не более 30 сут при температуре (5 +/- 1) °C.

Из основного раствора в трех пробирках готовят серию разведений антибиотика. В первую пробирку наливают 1 см³ буферного раствора 2 по 3.4.6.2 и 1 см³ основного раствора, во вторую - 9 см³ буферного раствора 2 и 1 см³ раствора из первой пробирки, в третью - 9 см³ стерильного обезжиренного молока по 3.4.5 и 1 см³ раствора из второй пробирки. Активность антибиотика в разведениях составляет соответственно 250; 25 и 2,5 мкг/см³. Разведение антибиотика в молоке активностью 2,5 мкг/см³ является контрольным.

Контрольное разведение стрептомицина используют в течение рабочего дня.

3.4.6.4. Взамен контрольного разведения стрептомицина для проверки активности роста тест-микроба могут быть использованы диски со стрептомицином по 3.2.10.

3.4.7. Подготовка проб молока к анализу

Каждую пробу молока наливают по 5 - 10 см³ в чистую стерильную пробирку, прогревают в течение (10 +/- 1) мин на водяной бане при температуре внутри пробирки (87 +/- 2) °C и охлаждают в холодной воде до температуры 18 - 25 °C.

3.5. Проведение анализа

3.5.1. Непосредственно перед исследованием молока на поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри по 3.4.4, пробойником или пробочным сверлом вырезают семь лунок диаметром 10 мм. Шесть лунок располагают по окружности чашки на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 28 мм их центров от центра чашки. Седьмую лунку вырезают в центре чашки (рисунок 1) только в случае использования контрольного разведения антибиотика.

3.5.2. В центральную лунку вносят 0,05 см³ контрольного разведения антибиотика по 3.4.6.3 или в центре чашки на поверхность засеянной агаровой среды помещают диск со стрептомицином по 3.2.10. В лунки, расположенные по окружности чашки, вносят по 0,05 см³ исследуемых проб молока по 3.4.7.

3.5.3. Чашки Петри выдерживают при комнатной температуре в течение (20 +/- 1) мин, затем их помещают в термостат крышками вверх и инкубируют при температуре (55 +/- 1) °C в течение 4 ч. Чашки в термостате размещают в один ряд.

3.6. Обработка результатов

3.6.1. Результаты анализа оценивают непосредственно после инкубирования. Чашки просматривают в проходящем свете от любого источника света.

Диаметры зон ингибиции роста тест-культуры, образуемых испытуемым образцом молока и контрольным разведением антибиотика, измеряют линейкой или на аппарате Микрофот 5ПО-1 по краям окружностей зон.

3.6.2. При отсутствии зон ингибиции контрольного разведения стрептомицина исследования повторяют с использованием вновь приготовленных засеянных чашек по 3.4.4 и контрольного разведения антибиотика по 3.4.6.

3.6.3. При отсутствии антибиотиков в молоке диаметр зоны ингибиции должен быть менее 12 мм, а при их наличии - 12 мм и более.

3.7. Метрологические характеристики

3.7.1. Наименьшие пределы определения антибиотиков представлены в таблице 1.

4.1. Сущность метода

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bac. stearothermophilus var. calidolactis C953 от фиолетовой до желтой при отсутствии в исследуемом молоке антибиотиков и других ингибирующих веществ и сохранении окраски - при их наличии.

4.2. Аппаратура, материалы и реактивы

4.2.1. Термостат или блок термостатируемых ячеек, позволяющий поддерживать температуру от 30 до 70 °C с допускаемыми отклонениями +/- 0,5 °C от заданной.

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

4.2.2. Холодильник бытовой по ГОСТ 16217.

4.2.3. Ампулы , герметично укупоренные, вместимостью 1,0 см³ с агаровой средой, содержащей споры Bac. stearothermophilus var. calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур, собранные в блоки.

(п. 4.2.3 в ред. Изменения N 1, утв. Приказом Росстандарта от 09.02.2006 N 6-ст)

4.2.4. Среда питательная таблетированная , фасованная в бутылочки из темного стекла с навинчивающимся колпачком.

(в ред. Изменения N 1, утв. Приказом Росстандарта от 09.02.2006 N 6-ст)

4.2.5. Шприц-дозатор автоматический вместимостью 1,0 см³, настроенный на объем пробы 0,1 см³.

4.2.6. Наконечники пластмассовые одноразовые, вместимостью 0,1 см³.

4.2.7. Пинцет.

4.2.8. Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже указанных.

4.2.9. Ампулы или , герметично укупоренные, вместимостью 1,0 см³ с агаровой и питательной средой, содержащей споры Bac. stearothermophilus var. calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур, собранные в блоки.

(п. 4.2.9 введен Изменением N 1, утв. Приказом Росстандарта от 09.02.2006 N 6-ст)

4.2.10. Тестовый набор - комплект, включающий герметично укупоренные пробирки, собранные в блоки, и содержащие споры Bac. stearothermophilus var. calidolactis, помещенные в агар с питательными веществами и индикатором бромкрезолпурпуром; пипетки мерные вместимостью 0,1 см³ одноразового использования и цветовую шкалу [3].

(п. 4.2.10 введен Изменением N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

4.2.11. Пипетки вместимостью 0,1 см³ для отбора образцов молока для исследования по ГОСТ 29169.

(п. 4.2.11 введен Изменением N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

4.3. Отбор проб

4.3.1. Отбор проб и подготовка их к анализу - по ГОСТ 9225.

4.3.2. Допускается хранить пробы в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6 +/- 2) °C.

4.4. Подготовка к анализу

4.4.1. Подготовка к анализу ампул по 4.2.3 и бутылочек по 4.2.4

(в ред. Изменения N 1, утв. Приказом Росстандарта от 09.02.2006 N 6-ст)

Стеклянную бутылочку с питательными таблетками вынимают из холодильника и выдерживают в течение 20 мин при температуре от 15 до 25 °C.

4.4.2. Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают от блока необходимое число ампул или пробирок (с учетом контрольной пробы) и маркируют. Оставшиеся ампулы или пробирки хранят в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °C.

(п. 4.4.2 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

4.4.3. Отвинчивают колпачок бутылочки и помещают его на стол вниз донышком. Пинцетом вынимают капсулу с силикагелем и поролоновый уплотнитель. Насыпают в колпачок необходимое количество таблеток питательной среды. Поролоновый уплотнитель и капсулу с силикагелем помещают в бутылочку.

4.4.4. Подготовка к анализу ампул или пробирок - по 4.2.9 или 4.2.10.

Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают от блока необходимое число ампул или пробирок (с учетом контрольной пробы) и маркируют. Оставшиеся ампулы или пробирки хранят в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °C".

(п. 4.4.4 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

4.5. Проведение анализа

4.5.1. Проведение анализа с использованием ампул , или 

4.5.1.1. Соединительной частью шприца прокалывают укупорку ампул по 4.2.3 или 4.2.9.

4.5.1.2. В каждую открытую ампулу по 4.2.3 пинцетом помещают по одной таблетке питательной среды , взятой из колпачка бутылочки по 4.4.3. Затем бутылочку плотно закрывают колпачком и хранят при температуре (20 +/- 2) °C.

4.5.1.3. Шприцем-дозатором отбирают 0,1 см³ анализируемого молока и вносят в каждую ампулу по 4.5.1.2 или 4.2.9. Для каждой пробы анализируемого молока используют новый наконечник. Оставшееся молоко сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °C.

4.5.1.4. Ампулы помещают в термостат и выдерживают при температуре (64,0 +/- 0,5) °C в течение 3 ч.

4.5.2. Проведение анализа с использованием тестового набора 

4.5.2.1. Одноразовой мерной пипеткой отбирают 0,1 см³ анализируемого молока и вносят в пробирку с приоткрытой фольгой по 4.2.10. Оставшееся молоко сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °C.

4.5.2.2. Пробирки с анализируемым молоком закрывают фольгой и помещают в блок термостатируемых ячеек и выдерживают при температуре (64,5 +/- 0,5) °C в течение 3 ч.

4.5.2.3. Контрольное определение проводят в соответствии с 4.5.1, 4.5.2. В ампулу или пробирку вносят 0,1 см³ предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.

(п. 4.5 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

4.6. Обработка результатов

4.6.1. Ампулы или пробирки извлекают из термостата или блока термостатируемых ячеек и определяют цвет содержимого.

(п. 4.6.1 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

4.6.2. Желтый цвет содержимого ампул или пробирок с контрольным и анализируемыми образцами молока свидетельствует об отсутствии в молоке ингибирующих веществ. Фиолетовое кольцо на поверхности содержимого ампулы или пробирки (размером не более 1 мм) не учитывают.

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

4.6.3. Фиолетовый цвет содержимого ампул или пробирок с анализируемым образцом молока свидетельствует о наличии в молоке ингибирующих веществ.

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

4.6.4. Вывод о наличии в молоке антибиотиков делают после дополнительных исследований молока по ГОСТ 24065 - ГОСТ 24067 и при получении отрицательных результатов.

4.7. Метрологические характеристики

4.7.1. Наименьшие пределы определения антибиотиков представлены в таблице 2.

(п. 4.7.1 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

5.1. Рецепторный метод с 3,3,5,5-триметилбензидином и диметилсульфоксидом

(раздел 5 в ред. Изменения N 1, утв. Приказом Росстандарта от 09.02.2006 N 6-ст, в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

5.1.1. Сущность метода

Метод основан на иммуноферментной реакции, в процессе которой антибиотики бета-лактамного типа захватываются специфическими белковыми рецепторами, меченными ферментом, содержащим индикатор, с образованием химически прочного окрашенного комплекса при взаимодействии с молоком, содержащим антибиотики.

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

Наличие или отсутствие пенициллина и антибиотиков бета-лактамного типа (ампициллина, цефапирина, амоксициллина, цефтиофура, клоксациллина, диклоксациллина, цефалониума, цефалексина, нафциллина, цефазолина, цефкуинома, цефацетрила, оксациллина, цефаперазона) устанавливают, сравнивая цвет зоны анализируемого молока с цветом контрольной зоны индикаторного устройства .

5.1.2. Аппаратура, материалы и реактивы

5.1.2.1. Термостат, позволяющий поддерживать температуру (45 +/- 5) °C.

5.1.2.2. Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

5.1.2.3. Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

5.1.2.4. Тест-набор Бета-лактам , одноразовый комплект в герметичной упаковке, включающий пробирку с 3,3,5,5-триметилбензидином, укупоренную; пипетку мерную вместимостью 0,4 см³; индикаторное устройство с диметилсульфоксидом по [1].

Тест-набор Бета-лактам хранят в холодильнике при температуре от 0 °C до 7 °C. Необходимое число комплектов для работы в течение суток допускается хранить при температуре (20 +/- 2) °C.

5.1.3. Отбор проб

5.1.3.1. Отбор проб - по ГОСТ 9225. Пробы хранят в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6 +/- 2) °C.

5.1.4. Подготовка к анализу

5.1.4.1. Термостат нагревают до температуры (45 +/- 5) °C и выдерживают при этой температуре не менее 5 мин.

5.1.4.2. Вскрывают упаковку тест-набора Бета-лактам , проверяют положение шарика реактива в пробирке по 5.1.2.4. Шарик реактива при заполнении пробирки молоком должен находиться на ее дне. При необходимости шарик реактива устанавливают встряхиванием пробирки на ее дно.

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

5.1.5. Проведение анализа

5.1.5.1. Мерную пипетку по 5.1.2.4 наполняют анализируемым молоком до метки.

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

5.1.5.2. Анализируемое молоко из пипетки выливают в пробирку. Пробирку закрывают и тщательно перемешивают круговыми движениями до растворения реактива. Пробирку и индикаторное устройство помещают в термостат и выдерживают при температуре (45 +/- 5) °C в течение 5 - 6 мин.

5.1.5.3. Вынимают подогретое индикаторное устройство из термостата и устанавливают на горизонтальной поверхности так, чтобы приемная воронка для заливки анализируемым молоком находилась слева от оператора.

5.1.5.4. Содержимое пробирки переливают в приемную воронку индикаторного устройства.

5.1.5.5. При появлении анализируемого молока в круглом окне клавиши индикаторного устройства клавишу нажимают до упора для изменения тока жидкости и промывки пористого материала раствором антибиотиков. Включение индикаторного устройства сопровождается характерным щелчком клавиши.

5.1.5.6. Индикаторное устройство повторно помещают в термостат, выдерживают при температуре (45 +/- 5) °C в течение 4 мин и извлекают из термостата. Стабильность окраски сохраняется в течение 15 мин после извлечения устройства из термостата.

5.1.6. Обработка результатов

5.1.6.1. Сравнивают цвет контрольной зоны в индикаторном окне с цветом зоны анализируемого молока.

5.1.6.2. Контрольная зона должна быть синего цвета. Если изменение цвета контрольной зоны после проведения процедур по 5.5.4 - 5.5.6 не произошло, то определение повторяют с новым тест-набором Бета-лактам .

5.1.6.3. Если цвет зоны анализируемого молока на индикаторном устройстве аналогичен или темнее цвета контрольной зоны - пенициллин или антибиотики бета-лактамного типа в анализируемом молоке отсутствуют.

Белый или менее интенсивный цвет зоны анализируемого молока по сравнению с цветом контрольной зоны свидетельствует о наличии в анализируемом молоке пенициллина или антибиотиков бета-лактамного типа.

5.2. Рецепторный метод с коллоидным золотом

5.2.1. Сущность метода

5.2.1.1. Метод основан на проведении реакции комплексообразования антибиотиков бета-лактамного типа со специфическими белковыми рецепторами, меченными коллоидным золотом, и последующем визуальном выявлении оставшихся свободными меченых рецепторов путем хроматографии на полосках хроматографической бумаги, содержащих в виде соответствующих линий реакционную и контрольную зоны.

5.2.2. Аппаратура, материалы и реактивы

5.2.2.1. Термостат или блок термостатируемых ячеек, позволяющий поддерживать температуру (47,5 +/- 0,5) °C.

5.2.2.2. Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

5.2.2.3. Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

5.2.2.4. Тест-набор [4], включающий флаконы со специфическими рецепторами, меченными коллоидным золотом; полоски хроматографической бумаги с зоной исследуемого молока и контрольной зоной; шприц-дозатор вместимостью 0,2 см³ с наконечниками.

5.2.3. Отбор проб

Отбор проб - по ГОСТ 9225. Пробы хранят в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6 +/- 2) °C.

5.2.4. Подготовка к анализу

5.2.4.1. Термостат или блок термостатируемых ячеек нагревают до температуры (47,5 +/- 0,5) °C и выдерживают при этой температуре не менее 5 мин.

5.2.4.2. Флакон встряхивают для осаждения содержимого в нем на дно.

5.2.5. Проведение анализа

5.2.5.1. Шприцем-дозатором с наконечником отбирают 0,2 см³ анализируемого молока и переливают во флакон по 5.2.4.2. Флакон закрывают крышкой и встряхивают до полного растворения сухих веществ без образования пены.

5.2.5.2. Помещают флакон в термостат или блок термостатируемых ячеек по 5.2.2.1.

5.2.5.3. Не менее чем через 3 мин термостатирования во флакон, находящийся в термостате или в блоке термостатируемых ячеек, помещают входящую в комплект полоску хроматографической бумаги.

5.2.5.4. Хроматографирование проводят в течение 2 мин. Затем полоску хроматографической бумаги извлекают из флакона.

5.2.6. Обработка результатов

5.2.6.1. Сравнивают интенсивность цвета окрашенных в красный цвет зон, появляющихся после проведения процедуры по 5.2.5.4 в виде линий на полосках хроматографической бумаги.

5.2.6.2. Зона на верхней части полоски является контрольной. Если ее окрашивания не произошло после выполнения требований по 5.2.5.3, 5.2.5.4, то повторяют все процедуры в соответствии с 5.2.

5.2.6.3. Зона исследуемого молока расположена под контрольной зоной. Большая или равная интенсивность цвета контрольной зоны, а также отсутствие окраски зоны образца является признаком наличия антибиотиков бета-лактамного типа в молоке.

5.2.6.4. Меньшая интенсивность цвета контрольной зоны, по сравнению с интенсивностью цвета зоны под ней, является признаком отсутствия антибиотиков.

5.2.6.5. Контрольное определение проводят в соответствии с 5.1 и 5.2. В ампулу или пробирку вносят 0,1 см³ предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.

(п. 5.2 введен Изменением N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

5.3. Метрологические характеристики

Наименьшие пределы определения антибиотиков бета-лактамного типа представлены в таблице 3.

(п. 5.3 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Ростехрегулирования от 23.01.2008 N 1-ст)

Работу со споровой культурой тест-микроба в лаборатории проводят в соответствии с санитарными правилами по [2].