1. Разработан и внесен Всесоюзным научно-исследовательским институтом комбикормовой промышленности.

Разработчики: Н.В. Лисицина, В.К. Кокин, Ю.М. Колпаков.

2. Утвержден и введен в действие Постановлением Комитета стандартизации и метрологии СССР от 19.12.1991 N 2008.

3. Срок проверки - 1997 г., периодичность проверки - 5 лет.

4. Введен впервые.

5. Ссылочные нормативно-технические документы

Стандарт распространяется на необработанное зерно, а также на зерно, подвергнутое различным способам гидротермической обработки (микронизация, экструдирование, поджаривание и т.п.), и устанавливает метод определения деструкции крахмала.

Отбор проб - по ГОСТ 13586.3.

Сущность метода заключается в определении степени гидролиза углеводного комплекса зерна с помощью фермента глюкоамилазы и определении глюкозы, получаемой в результате деструкции крахмала.

2.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 2-го класса точности с допускаемой погрешностью взвешивания +/- 0,01 г.

Мельница лабораторная электрическая.

Термостат биологический.

Плитка электрическая.

Пипетки исполнения 2; 2-го класса точности, вместимостью 1 см3, 5 см3, 20 см3 по ГОСТ 20292.

Пипетки градуированные по ГОСТ 20292 исполнений 1, 4, 7.

Колбы мерные исполнений 1, 2; вместимостью 100 см3, 1000 см3 2-го класса точности по ГОСТ 1770.

Стаканы химические по ГОСТ 25336.

Цилиндры исполнения 1 вместимостью 100, 250, 500 см3 по ГОСТ 1770.

Колбы мерные.

Колбы конические вместимостью 150 см3 по ГОСТ 25336.

Сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Бюретки для титрования, исполнения 1 и 3, 2-го класса точности с ценой деления 0,1 см3 по ГОСТ 20292.

Воронки стеклянные для фильтрования по ГОСТ 25336.

Часы сигнальные или песочные на 3 мин.

Фильтры бумажные.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Кислота серная по ГОСТ 4204, х.ч. или ч.д.а.

Гидроокись натрия по ГОСТ 4328.

Калий-натрий виннокислый по ГОСТ 5845, х.ч.

Гипосульфит натрия, раствор массовой концентрации 0,1 моль/дм3.

Натрий уксуснокислый по ГОСТ 2080.

Натрий углекислый по ГОСТ 83.

Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, раствор массовой концентрации 1 моль/дм3.

Калий двухромовокислый по ГОСТ 4220, раствор массовой концентрации 0,1 моль/дм3.

Калий йодистый по ГОСТ 4232, раствор с массовой долей 30%.

Медь сернокислая по ГОСТ 4165.

Препарат ферментный глюкоамилазы очищенный по ТУ 64-13-18.

Крахмал растворимый по ГОСТ 10163.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

2.2. Подготовка к испытанию

2.2.1. Подготовка пробы

Среднюю пробу испытуемого продукта измельчают на лабораторной мельнице и просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Частицы, оставшиеся на сите в количестве до 1%, удаляют.

2.2.2. Приготовление раствора сернокислой меди (раствор Фелинга 1)

Навеску сернокислой меди массой 40 г переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем дистиллированной водой до метки.

2.2.3. Приготовление щелочного раствора виннокислого калия-натрия (раствор Фелинга 2)

200 г виннокислого калия-натрия и 150 г гидроокиси натрия растворяют примерно в 400 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 см3. После охлаждения раствора объем его доводят дистиллированной водой до 1000 см3.

2.2.4. Приготовление раствора крахмала с массовой долей 1%

Навеску растворимого крахмала массой 1 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 25 см3 дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Затем в колбу добавляют еще 25 см3 дистиллированной воды, помещают колбу в кипящую водяную баню и, непрерывно перемешивая, выдерживают до полного растворения крахмала. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры и объем доводят дистиллированной водой до метки, после чего содержимое колбы перемешивают стеклянной палочкой.

Раствор крахмала готовят в день проведения анализа.

2.2.5. Приготовление раствора гипосульфита натрия массовой концентрации 0,1 моль/дм3

Для приготовления раствора гипосульфита натрия массовой концентрации 0,1 моль/дм3 и установления его титра 25 г соли растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды, к полученному раствору прибавляют 0,1 г углекислого натрия, оставляют стоять в течение суток и устанавливают титр по 0,1 моль/дм3 раствору двухромовокислого калия (4,9036 г двухромового кислого калия растворяют в 1 дм3 воды).

Для установления титра раствора гипосульфита в колбу с притертой пробкой приливают точно 20 см3 0,1 моль/дм3 раствора двухромовокислого калия, доливают водой до 100 см3, прибавляют при помешивании 4 см3 концентрированной серной кислоты и 4 см3 раствора йодистого калия с массовой долей 30%. Колбу закрывают пробкой и оставляют в темном месте на 2 - 3 мин, затем титруют раствором гипосульфита натрия, все время интенсивно перемешивая жидкость, пока коричневый цвет раствора не перейдет в светло-желтый, прибавляют 1 см3 1%-ного раствора крахмала и продолжают титрование до исчезновения синей окраски и перехода ее в зеленоватую.

Поправочный коэффициент (K) к точно 0,1 моль/дм3 раствору гипосульфита определяют по формуле

где V - объем гипосульфита натрия, израсходованный на титрование, см3.

2.2.6. Приготовление раствора серной кислоты с плотностью 1,14 г/см3

В колбу вместимостью 1000 см3 наливают 500 см3 дистиллированной воды, туда же осторожно добавляют 228,9 г концентрированной серной кислоты плотностью 1,84 г/см3. После охлаждения до комнатной температуры раствор доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Плотность полученного раствора должна составлять 1,14 г/см3.

2.2.7. Приготовление ацетатного буфера с pH = 4,7 - 5,0

Для приготовления ацетатного буфера берут раствор ледяной уксусной кислоты массовой концентрации 1 моль/дм3 (60,12 г уксусной кислоты на 1 дм3 воды) и уксуснокислого натрия (136,09 г уксуснокислого натрия на 1 дм3).

Ацетатную буферную смесь готовят смешиванием указанных растворов в соотношении от 1:1 до 1:2 соответственно значениям pH 4,7 - 5,0.

2.2.8. Приготовление раствора ферментного препарата глюкоамилазы

Навеску ферментного препарата очищенной глюкоамилазы массой 1 г при глюкоамилазной активности препарата (ГлА) 1000 Ед на 1 г или 0,5 г при активности препарата 2000 ГлА на 1 г помещают в стеклянный стаканчик вместимостью 25 - 30 см3. Туда же добавляют небольшое количество дистиллированной воды и тщательно растирают стеклянной палочкой до получения однородной массы. Полученную массу количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят дистиллированной водой да метки, перемешивают и, при необходимости, фильтруют через стеклянную воронку с бумажным фильтром. 1 см3 раствора ферментного препарата имеет глюкоамилазную активность 10 Ед. При необходимости активность препарата глюкоамилазы проверяют по ГОСТ 20264.4.

Раствор ферментного препарата хранят не более суток при температуре от плюс 2 до минус 4 °C.

2.3. Проведение испытания

Навеску испытуемой пробы массой 1 г помещают в коническую колбу вместимостью 100 см3. Затем приливают 25 см3 дистиллированной воды температурой 37 °C, 3 см3 ацетатного буфера и 2 см3 раствора ферментного препарата. Колбы выдерживают в биологическом термостате 1 ч при 37 °C, периодически, примерно через 15 мин, перемешивая их содержимое. После этого отбирают 10 см3 надосадочной жидкости и переносят в коническую колбу, куда предварительно наливают 10 см3 раствора Фелинга 1 и 10 см3 раствора Фелинга 2. Полученную смесь нагревают до кипения на электроплитке или газовой горелке и кипятят 3 мин, при этом выпадает осадок закиси меди красно-бурого цвета. После охлаждения до комнатной температуры в колбу с осадком вносят 20 см3 раствора серной кислоты, приготовленной по п. 2.2.6, и 2 г йодистого калия.

Выделившийся свободный йод быстро оттитровывают раствором гипосульфита натрия, приготовленного по п. 2.2.5, до кофейной окраски, после чего вносят 1 см3 раствора растворимого крахмала и снова титруют до молочно-белой окраски.

Параллельно опыту ставят контрольный опыт, в котором вместо надосадочной жидкости берут 10 см3 дистиллированной воды, остальные операции проводят в той же последовательности, что и для опытной пробы.

2.4. Обработка результатов

Количество глюкозы (X) в миллиграммах в 1 г сухого вещества анализируемой пробы вычисляют по формуле

где - объем гипосульфита натрия, израсходованный на титрование контрольной пробы, см3;

- объем гипосульфита натрия, израсходованный на титрование опытной пробы, см3;

30 - объем исходной суспензии в колбе, см3;

3,3 - коэффициент пересчета 0,1 моль/дм3 раствора гипосульфита натрия на глюкозу, установленный экспериментальным путем;

K - поправочный коэффициент к титру гипосульфита натрия;

10 - количество гидролизата, израсходованное на анализ;

W - массовая доля влаги в анализируемой пробе, г.

Вычисления проводят до первого десятичного знака с последующим округлением до целого числа.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми не должны превышать 10% от среднего арифметического результата.

Сущность метода заключается в быстрой клейстеризации водяной суспензии размолотого зерна на кипящей водяной бане и последующем определении степени разжижения амилазами крахмала, содержащегося в пробе, по числу падения выражающемуся периодом времени с момента погружения вискозиметрической пробирки в кипящую воду, необходимым для падения мешалки вискозиметра с определенной высоты через водную суспензию, полученную из размолотого зерна и находящуюся в вискозиметрической пробирке в состоянии разжижения.

3.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Прибор для определения числа падения.

Пробирки вискозиметрические с внутренним диаметром (21,00 +/- 0,02) мм, наружным диаметром (23,80 +/- 0,3) мм.

Пробки резиновые N 22 для вискозиметрических пробирок.

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с допускаемой погрешностью взвешивания +/- 0,01 г.

Мельница лабораторная электрическая.

Пипетки исполнения 2, 2-го класса точности вместимостью 1 и 25 см3 по ГОСТ 20292.

Цилиндр исполнения 1 вместимостью 100 см3 по ГОСТ 1770.

Колбы конические вместимостью 150 см3 по ГОСТ 25336.

Сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Плитка электрическая или горелка газовая.

Ножницы.

Палочки стеклянные длиной 13 - 20 см3.

Бумага индикаторная лакмусовая или универсальная.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Ферментные препараты: амилосубтилин по ГОСТ 23635 и глюкоамилаза очищенная по ТУ 64.13.18.

Примечание. Допускается использовать импортную аппаратуру, мерную посуду или другие средства измерений, имеющие такие же или более высокие метрологические характеристики.

3.2. Подготовка к испытанию

3.2.1. Подготовка пробы

Среднюю пробу испытуемого продукта измельчают на лабораторной мельнице и просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Частицы, оставшиеся на сите в количестве до 1%, удаляют.

3.2.2. Приготовление раствора ферментных препаратов

Для приготовления растворов амилазы (Ас) и глюкоамилазы (ГлА) используют ферментные препараты из расчета содержания в 1 см3 раствора 0,8 Ед Ас и 10 Ед ГлА.

Расчет для взятия навесок ферментов проводят следующим образом.

Например, согласно качественным удостоверениям активность препарата составляет 600 Ед Ас на 1 г препарата, а активность глюкоамилазы - 1000 Ед ГлА на 1 г препарата.

Исходя из этого, для приготовления рабочего раствора ферментных препаратов 133 мг препарата и 1 г препарата глюкоамилазы растворяют поочередно, начиная с глюкоамилазы, в 100 см3 дистиллированной воды при температуре 55 °C и pH 4,7 - 5,0 и охлаждают до комнатной температуры.

3.3. Проведение испытания

Навеску размолотого зерна помещают в вискозиметрическую пробирку прибора для определения числа падения. Массу навески устанавливают по таблице, учитывая значения влажности продукта (см. Приложение).

Затем в пробирку наливают пипеткой 1 см3 рабочего раствора ферментных препаратов, приготовленного по п. 3.2.2, и дистиллированную воду в количестве, указанном в таблице. Пробирку закрывают резиновой пробкой и энергично встряхивают не менее 20 раз до получения однородной суспензии.

В случае затруднения в получении однородной суспензии пробку вынимают и перемешивают содержимое пробирки стеклянной палочкой. Затем колесиком шток-мешалки перемещают прилипшие частицы продукта со стенок в общую массу суспензии. Все операции по подготовке суспензии проводят в течение 60 - 90 с.

Для определения числа падения пробирку с суспензией помещают в отверстие в крышке кипящей водяной бани прибора, закрепив ее держателем таким образом, чтобы фотоэлемент прибора находился против шток-мешалки. В то же время автоматически включается счетчик времени. Через 5 с после погружения пробирки в водяную баню автоматически начинает работать шток-мешалка, которая перемешивает суспензию в пробирке. Через 60 с шток-мешалка автоматически останавливается в верхнем положении, затем начинается ее свободное падение. После полного опускания шток-мешалки счетчик автоматически останавливается.

По счетчику определяют число падения (X) - время в секундах с момента погружения пробирки с суспензией в водяную баню до момента полного опускания шток-мешалки.

3.4. Обработка результатов

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.

Вычисление проводят до первого десятичного знака с последующим округлением результата до целого числа.

Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений (d) и между результатами, полученными в разных условиях (D), в секундах, при двусторонней доверительной вероятности P = 0,95 не должны превышать следующих значений:

где - среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, с;

- среднее арифметическое результатов двух испытаний, выполненных в разных условиях, с.

Пример. Результаты испытания по первой навеске - 68 с, по второй - 73 с. Среднее арифметическое значение - 70,5 с. Допускаемое расхождение от этого среднего арифметического значения составляет 8,1 с.

Фактическое расхождение между результатами испытания двух навесок составляет 5 с, что не превышает допускаемого расхождения между ними.