1. Разработан МТК 186 и Научно-исследовательским институтом детского питания.

Внесен Госстандартом России.

2. Принят Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации (Протокол от 12 ноября 1998 г. N 14).

За принятие проголосовали:

3. Постановлением Государственного комитета Российской Федерации по стандартизации и метрологии от 28 апреля 1999 г. N 144 межгосударственный стандарт ГОСТ 30627.3-98 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 1 мая 2000 г.

4. Введен впервые.

Настоящий стандарт распространяется на молочные продукты для детского питания, обогащенные витамином E (токоферолом), и устанавливает колориметрический метод измерения массовой доли витамина E.

Метод основан на реакции восстановления токоферолами трехвалентного железа в двухвалентное с образованием окрашенного комплекса двухвалентного железа с ортофенантролином (батофенантролином или ).

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 334-73 Бумага масштабно-координатная. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия

ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия

ГОСТ 4147-74 Железо (III) хлорид 6-водный. Технические условия

ГОСТ 4166-76 Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4212-76 Реактивы. Приготовление растворов для колориметрического и нефелометрического анализа

ГОСТ 4919.1-77 Реактивы и особо чистые вещества. Методы приготовления растворов индикаторов

ГОСТ 4919.2-77 Реактивы и особо чистые вещества. Методы приготовления буферных растворов

ГОСТ 5962-67 Спирт этиловый ректификованный. Технические требования

ГОСТ 6552-80 Кислота ортофосфорная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 8981-78 Эфиры этиловый и нормальный бутиловый уксусной кислоты технические. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 24363-80 Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовки проб к анализу

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть I. Общие требования

Отбор проб и подготовка их к измерению - по ГОСТ 26809.

Баня водяная с обогревом, позволяющая поддерживать температуру от 0 до 100 °C с погрешностью +/- 2 °C.

Бумага масштабно-координатная (миллиметровая) по ГОСТ 334.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Весы лабораторные общего назначения 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104.

Воронки делительные номинальной вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336.

Воронки стеклянные типа В диаметром 56 мм по ГОСТ 25336.

Испаритель ротационный ИР-1М [1].

Колбы мерные исполнения 1 2-го класса точности номинальной вместимостью 50, 100 см3 по ГОСТ 1770.

Колбы типа К исполнения 1 номинальной вместимостью 100 см3 по ГОСТ 25336.

Пипетки исполнений 4, 6, 7 2-го класса точности номинальной вместимостью 1, 2, 5, 10, 25 см3 по ГОСТ 29227.

Пробирки стеклянные типа П4 номинальной вместимостью 10 и 20 см3 по ГОСТ 25336.

Секундомер 2-го класса [2].

Стакан исполнения 3 номинальной вместимостью 1000 см3 по ГОСТ 9147.

Термометр жидкостный (не ртутный) диапазоном измерения 0 - 100 °C ценой деления шкалы 1 °C по ГОСТ 28498.

Фотометр фотоэлектрический диапазоном измерения 220 - 1100 нм [3] или колориметр фотоэлектрический диапазоном измерения 200 - 2000 нм, диапазоном измерения коэффициента пропускания 100 - 1% [4].

Холодильник обратимый со шлифом и водяным охлаждением по ГОСТ 25336.

Цилиндры исполнения 1 вместимостью 25, 50 см3 по ГОСТ 1770.

Часы 2-го класса по ГОСТ 3145.

Шкаф сушильный лабораторный, обеспечивающий поддержание заданного температурного режима от 50 до 200 °C с погрешностью +/- 2 °C.

Эксикатор исполнения 2 по ГОСТ 25336.

Аскорбиновая кислота (витамин C) [5].

Батофенантролин (4,4-дипиридил) [6].

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Железо треххлористое 6-водное, ч., по ГОСТ 4147.

Калия гидроокись, х.ч., по ГОСТ 24363.

Натрий сернокислый безводный, х.ч., по ГОСТ 4166.

Ортофенантролин [7].

Ортофосфорная кислота, ч., по ГОСТ 6552.

Спирт абсолютный [8].

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

Токоферола ацетат (витамин E ацетат) [9] или масляный раствор массовой концентрации ацетата 300 г/дм3 (с массовой долей ацетата в масле 30%) [10].

Фенолфталеин, ч.д.а. [11].

Эфир петролейный [12], перегнанный при температуре (50 +/- 10) °C, не содержащий перекисей.

Эфир этиловый по ГОСТ 8981.

Допускается применение других средств измерения с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже вышеуказанных.

Хранение растворов - по ГОСТ 4212.

Хранение реактивов и особо чистых веществ - по ГОСТ 4919.1 и ГОСТ 4919.2.

Измерение должно проводиться при красном или затемненном свете в связи с разрушением витамина E под воздействием ультрафиолетовых лучей.

Работу с эфиром необходимо проводить в вытяжном шкафу и в хорошо вентилируемом помещении.

6.1. Приготовление спиртового раствора треххлористого железа массовой концентрации 2 мг/см3

(0,200 +/- 0,001) г треххлористого железа, взвешенного на весах 2-го класса точности, растворяют в 25 - 50 см3 абсолютного спирта в мерной колбе вместимостью 100 см3, доводят до метки тем же спиртом и перемешивают.

Раствор хранят в склянке из темного стекла при (6 +/- 2) °C.

6.2. Приготовление спиртового раствора треххлористого железа массовой концентрации 0,25 мг/см3

1,25 см3 раствора треххлористого железа массовой концентрации 2 мг/см3 смешивают с 8,75 см3 абсолютного спирта и тщательно перемешивают.

Раствор готовят непосредственно перед применением.

6.3. Приготовление раствора молярной концентрации в абсолютном спирте

(0,327 +/- 0,001) г ортофосфорной кислоты, взвешенной на весах 2-го класса точности, растворяют в 25 - 50 см3 абсолютного спирта в мерной колбе вместимостью 100 см3, доводят до метки тем же спиртом и перемешивают.

6.4. Приготовление спиртового раствора ортофенантролина или батофенантролина массовой концентрации 1 мг/см3

(0,100 +/- 0,001) г ортофенантролина, взвешенного на весах 2-го класса точности, растворяют в 25 - 50 см3 абсолютного спирта в мерной колбе вместимостью 100 см3, доводят до метки тем же спиртом и перемешивают.

6.5. Приготовление спиртового раствора (4,4-дипиридила) массовой концентрации 5 мг/см3

(0,500 +/- 0,001) г , взвешенного на весах 2-го класса точности, растворяют в 25 - 50 см3 абсолютного спирта в мерной колбе вместимостью 100 см3, доводят до метки тем же спиртом и перемешивают.

Спиртовые растворы ортофенантролина, батофенантролина и хранят в склянке из темного стекла при (6 +/- 2) °C.

6.6. Приготовление спиртового раствора фенолфталеина массовой концентрации 10 мг/см3

(1,00 +/- 0,04) г фенолфталеина, взвешенного на весах 4-го класса точности, растворяют в 70 см3 этилового спирта в мерной колбе вместимостью 100 см3, добавляют 30 см3 дистиллированной воды и перемешивают.

6.7. Приготовление водного раствора гидроокиси калия массовой концентрации 0,5 г/см3

(125,0 +/- 0,1) г гидроокиси калия, взвешенной на весах 4-го класса точности, растворяют в 100 - 150 см3 дистиллированной воды в фарфоровом стакане, охлаждают до (20 +/- 5) °C, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см3, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

6.8. Обезвоживание сернокислого натрия

Сернокислый натрий высушивают в сушильном шкафу при (150 +/- 10) °C 8 - 12 ч. Хранят в эксикаторе.

6.9. Приготовление стандартного раствора 

(0,040 +/- 0,001) г 100%-ного препарата витамина E, взвешенного на весах 2-го класса точности, растворяют в 50 см3 абсолютного спирта в мерной колбе вместимостью 100 см3 и доводят объем до метки этим же спиртом.

6.9.1. Гидролиз

В круглодонную колбу вместимостью 100 см3 вносят 5 см3 полученного по 6.9 стандартного раствора витамина, добавляют 15 см3 этилового спирта, (0,10 +/- 0,03) г аскорбиновой кислоты, взвешенной на весах 4-го класса точности, 1 см3 гидроокиси калия массовой концентрации 0,5 г/см3 и перемешивают. Колбу соединяют с обратным водяным холодильником и выдерживают в кипящей водяной бане (18 +/- 2) мин.

6.9.2. Экстракция

По окончании гидролиза содержимое колбы охлаждают до (20 +/- 5) °C и количественно переносят в делительную воронку. Колбу ополаскивают 50 см3 дистиллированной воды, воду сливают в ту же воронку.

Признаком полного омыления служит то, что при добавлении воды к смеси муть не образуется. При образовании мути гидролиз повторяют, увеличивая при этом объем щелочи до 2 см3 или время гидролиза до (30 +/- 2) мин.

Неомыляемые вещества экстрагируют диэтиловым или петролейным эфиром три раза по 25 см3. После чего нижний (водный) слой отбрасывают.

6.9.3. Промывка

Объединенный эфирный экстракт (верхний слой) переносят в делительную воронку и отмывают от щелочи до нейтральной реакции по фенолфталеину, расходуя при этом 50 - 60 см3 дистиллированной воды.

Промытую эфирную вытяжку фильтруют в сухую круглодонную колбу со шлифом через слой безводного сернокислого натрия (20 - 30 г), не допуская заполнения воронки выше уровня этого слоя. По окончании фильтрования фильтр промывают эфиром объемом не менее 15 см3.

6.9.4. Отгонка растворителя

Колбу с фильтратом подсоединяют к роторному испарителю и отгоняют эфир под вакуумом при температуре водяной бани не более 30 °C для диэтилового эфира и не более 50 °C - для петролейного эфира.

Неомыляемый остаток растворяют в абсолютном спирте и доводят объем до 100 см3 этим же спиртом.

Если используют препарат витамина E другой концентрации, то навеску рассчитывают так, чтобы конечная концентрация стандартного раствора (после гидролиза) составляла не менее 20 мкг/см3.

6.9.5. Проверка концентрации стандартного раствора 

В полученном растворе определяют массовую концентрацию , измеряя оптическую плотность спиртового раствора при длине волны 292 нм.

Массовую концентрацию , мкг/см3, вычисляют по формуле

где D - оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 292 нм против абсолютного спирта;

10000 - масса в 1 см3 1%-ного раствора, мкг;

E - удельный показатель поглощения при длине волны 292 нм для 1%-ного раствора в абсолютном спирте, равен 74,7.

6.9.6. Построение калибровочного графика

В пять пробирок вносят по 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 см3 полученного стандартного раствора и доводят объем в каждой пробирке абсолютным спиртом до 5 см3. В шестую пробирку вносят 5,0 см3 абсолютного спирта (холостая проба). Затем во все пробирки приливают по 0,5 см3 раствора ортофенантролина или батофенантролина массовой концентрации 1 мг/см3, или массовой концентрации 5 мг/см3, добавляют 0,5 см3 раствора треххлористого железа массовой концентрации 0,25 мг/см3, перемешивают и не более чем через 20 с добавляют 0,5 см3 раствора ортофосфорной кислоты молярной концентрации и снова перемешивают. Реакцию проводят с каждой пробиркой отдельно.

Определяют оптическую плотность на колориметре или фотометре при длине волны 490 нм, устанавливая в параллельный световой поток кювету, наполненную абсолютным спиртом.

Для построения калибровочного графика по оси абсцисс откладывают массу от 5 до 20 мкг, а по оси ординат - разность показаний прибора между испытуемым раствором и холостой пробой.

Построение калибровочного графика повторяют при смене прибора или одного из реактивов, необходимых для проведения реакции.

6.10. Щелочной гидролиз продукта

Для жидких и пастообразных продуктов отобранную для анализа пробу прогревают при 37 °C 20 - 30 мин и перемешивают для равномерного распределения жира в продукте.

Навеску сухого продукта на гидролиз берут с учетом массовой доли витамина E в продукте.

Навеска жидкого и пастообразного продукта - (15 +/- 0,01) г.

Навеску помещают в круглодонную колбу роторного испарителя вместимостью 100 см3. К навеске для сухого продукта добавляют (9 +/- 1) см3 дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения. В круглодонную колбу ротационного испарителя к навеске продукта добавляют 100 - 150 мг аскорбиновой кислоты, взвешенной на весах 4-го класса точности, приливают 40 см3 этилового спирта и, перемешивая, вносят 5 - 7 см3 раствора гидроокиси калия массовой концентрации 0,5 г/см3.

Колбу соединяют с обратным холодильником и выдерживают при температуре кипения смеси на водяной бане в течение (30 +/- 1) мин.

6.11. Экстракция

Экстракцию и последующие операции проводят в соответствии с 6.9.2 - 6.9.4.

Эфирный экстракт помещают в круглодонную колбу вместимостью 250 см3. Эфир выпаривают на ротационном испарителе согласно 6.9.4, а сухой остаток немедленно растворяют в 15 см3 абсолютного спирта.

Оптическую плотность измеряют на колориметре или фотометре при длине волны 490 нм, устанавливая в параллельный световой поток кювету, наполненную абсолютным спиртом.

1,0 - 5,0 см3 полученного раствора (в зависимости от массовой доли витамина E в продукте) помещают в пробирку, доводят объем раствора до 5 см3 абсолютным спиртом и перемешивают. Затем проводят реакцию согласно 6.9.6. Проводят параллельные измерения в двух пробирках и берут средний результат. В третьей пробирке готовят холостую пробу согласно 6.9.6.

Массовую долю витамина E (токоферола) X, , вычисляют по формуле

где m - масса витамина E в анализируемом растворе продукта, установленная по калибровочному графику (по разнице показаний оптической плотности между анализируемым раствором и холостой пробой), мкг;

- общий объем анализируемого раствора в абсолютном спирте после экстракции, см3;

- объем спиртового раствора, взятый на проведение цветной реакции, см3;

- масса продукта, взятая на гидролиз, г.

За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных измерений. Вычисления проводят до второго десятичного знака и округляют до первого десятичного знака.

Относительная погрешность измерения массовой доли витамина E - +/- 20% при доверительной вероятности P = 0,95.

Расхождение между результатами двух параллельных измерений не должно превышать 15% среднего арифметического значения результатов измерений.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать 20% среднего арифметического значения результатов измерений.