Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения".

1. Разработан ООО "Люмтек".

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 186 "Молоко и молочные продукты".

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 23 декабря 2005 г. N 331-ст.

4. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет.

Настоящий стандарт распространяется на сырое натуральное коровье молоко - сырье (далее - молоко) и устанавливает люминесцентный метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) от 50 тыс. до 20000 тыс. КОЕ/см3. Наименьший предел обнаружения КМАФАнМ - не менее 50 тыс. КОЕ/см3.

Требования к молоку установлены в ГОСТ Р 52054.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р 51917-2002 Продукты молочные и молокосодержащие. Термины и определения

ГОСТ Р 52054-2003 Молоко натуральное коровье - сырье. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2228-81 Бумага мешочная. Технические условия

ГОСТ 2405-88 Манометры, вакуумметры, мановакуумметры, напоромеры, тягомеры и тягонапоромеры. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия

ГОСТ 6709-72 Реактивы. Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 8218-89 Молоко. Метод определения чистоты

ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа

ГОСТ 10157-79 Аргон газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 12290-89 Картон фильтровальный для пищевых жидкостей. Технические условия

ГОСТ 22649-83 Стерилизаторы воздушные медицинские. Общие технические условия

ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 24861-91 (ИСО 7886-84) Шприцы инъекционные однократного применения

ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой.

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться замененным (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3.1. В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р ИСО 5725-1 и ГОСТ Р 51917.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие обозначения и сокращения:

КМАФАнМ - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов;

АТФ - аденозин-5'-трифосфат;

BPN-реагент - растворитель соматических клеток, белка и жира молока;

КОЕ - колониеобразующие единицы.

Метод основан на:

- растворении соматических клеток, белка и жира молока BPN-реагентом;

- фильтровании полученного раствора молока через бактериальный мембранный фильтр;

- растворении отфильтрованных микроорганизмов диметилсульфоксидом;

- измерении люминесценции полученного раствора, расчете молярной концентрации АТФ микроорганизмов и выражении ее значения в КОЕ/см3 молока.

4.1. Средства измерений и вспомогательные устройства

Прибор "Биотокс-7", обеспечивающий измерение люминесценции в диапазоне длин волн от 380 до 600 нм по [1].

Люминометрическая кювета полистирольная диаметром 10 мм, вместимостью 0,35 см3, дно которой выполнено из бактериального мембранного фильтра с порами 0,45 мкм (Приложение А, рисунок 1) [2].

Штатив для люминометрических кювет (Приложение А, рисунок 2) [2].

Шприц медицинский вместимостью 5 см3 по ГОСТ 22967, ГОСТ 24861.

Наконечник резиновый к медицинскому шприцу (Приложение А, рисунок 3) [2].

Колба вместимостью 5 см3, 100 см3, 1 дм3 по ГОСТ 1770.

Пипетки автоматические, позволяющие дозировать объемы: 0,02, 0,05, 0,2 и 1 см3 [3].

Наконечники к автоматическим пипеткам стерильные [4].

Термометр стеклянный жидкостной (нертутный), диапазон измерения 0 °C - 100 °C, цена деления шкалы 1 °C, по ГОСТ 28498.

Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

Шкаф сушильный, позволяющий поддерживать температуру (165 +/- 5) °C.

Стерилизатор воздушный медицинский по ГОСТ 22649 или стерилизатор паровой медицинский, позволяющие поддерживать температуру (121 +/- 2) °C.

Баня водяная, позволяющая поддерживать температуру (45 +/- 1) °C.

Перегонная установка (см. Приложение Б).

Весы лабораторные с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более +/- 0,02 мг по ГОСТ 24104.

Установка для получения деионизированной воды по [5].

Пипетка стеклянная номинальной вместимостью 50 см3 2 кл. по ГОСТ 29169.

Эксикатор по ГОСТ 23932.

Вакуумметр по ГОСТ 2405.

4.2. Реактивы и материалы

АТФ-реагент для биолюминесцентного определения АТФ, чистый сухой, содержащий люциферазу светляков, Д-люциферин, соль магния, компоненты буферной системы, стабилизаторы [6].

Вода деионизированная с электропроводимостью не более 0,1 мкСм, получаемая в соответствии с инструкцией к установке по 4.1.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

АТФ сухой с содержанием основного вещества не менее 99% [7].

BPN-реагент чистый сухой с массовой долей неионного детергента не более 5%, содержащий компоненты буферной системы и комплекс протеаз [8].

Промывочный раствор для подготовки образцов к АТФ-метрии, чистый, с массовой долей неионного детергента не более 1% [9].

Диметилсульфоксид [10].

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.

Аргон по ГОСТ 10157.

Фильтровальная бумага по ГОСТ 12026 или фильтровальный картон по ГОСТ 12290.

Бумага мешочная по ГОСТ 2228.

Спирт этиловый по ГОСТ Р 51652.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств с метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов и материалов по качеству не уступающих приведенным выше.

4.3. Отбор проб

Отбор проб - по ГОСТ 9225 и ГОСТ 26809.

4.4. Подготовка к измерениям

4.4.1. Приготовление водного раствора с массовой долей соляной кислоты от 1% до 2%

В мерную колбу вместимостью 1 дм3 (см. 4.1) наливают от 100 до 200 см3 дистиллированной воды и доливают пипеткой (см. 4.1) 50 см3 соляной кислоты (см. 4.2). Приливают дистиллированную воду до метки.

4.4.2. Подготовка посуды, инструментов и материалов

Лабораторную посуду, инструменты и материалы (полоски фильтровальной бумаги или фильтровального картона размером 4 x 12 см), завернутые в бумагу (см. 4.2), стерилизуют в соответствии с ГОСТ 26668 (пункт 1.2).

Колбу для отбора молока вместимостью 100 см3 (см. 4.1) кипятят в водном растворе соляной кислоты по 4.4.1 в течение 15 мин и ополаскивают дистиллированной водой. Затем колбу стерилизуют в сушильном шкафу при температуре (160 +/- 5) °C в течение 2 ч с последующим охлаждением в эксикаторе (см. 4.1) либо в стерилизаторе при температуре (121 +/- 2) °C в течение (30 +/- 1) мин с последующим охлаждением в эксикаторе (см. 4.1).

4.4.3. Очистка диметилсульфоксида с помощью перегонки

Диметилсульфоксид перегоняют в потоке аргона при температуре (72,0 +/- 0,2) °C и остаточном давлении 15 мм рт. ст. Для шлифов перегонной установки (см. 4.1) использование смазки не допускается. Перегнанный диметилсульфоксид хранят в стеклянной посуде без доступа света в течение 30 дней при температуре не выше 4 °C.

4.4.4. Подготовка раствора АТФ-реагента

В упаковку с сухим АТФ-реагентом (см. 4.2) автоматической пипеткой, позволяющей дозировать 1 см3, вносят деионизированную воду по 4.2 в объеме, указанном на этикетке упаковки, и осторожно перемешивают покачиванием. Если для испытания используют несколько упаковок с сухим АТФ-реагентом, то их содержимое после добавления деионизированной воды объединяют в одну упаковку с помощью автоматической пипетки. Перед использованием раствор АТФ-реагента выдерживают от 15 до 30 мин. Полученный раствор используют в течение 6 ч.

4.4.5. Приготовление контрольного образца АТФ с молярной концентрацией 

Взвешивают (0,2755 +/- 0,0001) г АТФ (см. 4.2), растворяют его деионизированной водой в мерной колбе вместимостью 5 см3 (молярная концентрация водного раствора АТФ - 0,1 моль/см3).

0,5 см3 водного раствора АТФ вносят в мерную колбу вместимостью 5 см3 и доводят объем раствора до метки диметилсульфоксидом по 4.4.3 (молярная концентрация полученного раствора АТФ в диметилсульфоксиде - ). Данную процедуру повторяют еще девять раз, последовательно растворяя 0,5 см3 вновь получаемых растворов диметилсульфоксидом в мерных колбах вместимостью 5 см3.

Допускается использовать для приготовления контрольного образца лиофильно высушенную смесь АТФ с инертными наполнителями, обеспечивающую после ее растворения молярную концентрацию АТФ .

4.4.6. Измерение люминесценции контрольного образца АТФ

Люминометрическую кювету помещают в кюветное отделение прибора для измерения люминесценции и последовательно вносят в нее 0,02 см3 контрольного образца АТФ по 4.4.5 и 0,05 см3 деионизированной воды, а также 0,05 см3 раствора АТФ-реагента по 4.4.4. Раствор перемешивают прокачиванием: трижды набирая содержимое люминометрической кюветы в наконечник автоматической пипетки вместимостью 0,05 см3 и возвращая его в люминометрическую кювету. Измеряют люминесценцию .

Процедуру измерения люминесценции контрольного образца АТФ проводят дважды. АТФ-реагент считают пригодным для проведения испытаний, если для среднеарифметического значения двух результатов наблюдений люминесценции выполняется условие: 

4.4.7. Подготовка пробы молока

Из объединенной пробы молока по ГОСТ 9225 отбирают 250 см3 молока, фильтруют его через иглопробивную ткань в соответствии с требованиями ГОСТ 8218 (см. разделы 2, 3). Предварительно ткань стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (30 +/- 1) мин, охлаждают в эксикаторе до температуры (20 +/- 2) °C. Предварительно поверхность установки для фильтрования молока обрабатывают этиловым спиртом (см. 4.2) и высушивают.

4.5. Проведение измерений

4.5.1. Отбирают 50 см3 отфильтрованного молока по 4.4.7 и помещают в колбу вместимостью 100 см3, подготовленную по 4.4.2. Молоко подогревают до температуры (20 +/- 2) °C и перемешивают.

4.5.2. Автоматической пипеткой отбирают 1 см3 молока по 4.5.1, вносят его в упаковку с BPN-реагентом и перемешивают ее содержимое. Упаковку выдерживают в водяной бане при (45 +/- 1) °C в течение 10 мин.

4.5.3. Люминометрическую кювету устанавливают на стопку из трех-пяти полосок фильтровальной бумаги или на одну полоску фильтровального картона по 4.4.2, помещенных в штатив для люминометрических кювет (Приложение А, рисунок 2). В люминометрическую кювету автоматической пипеткой вместимостью 0,2 см3 вносят 0,2 см3 раствора по 4.5.2 и продавливают его в фильтровальную бумагу или фильтровальный картон, создавая избыточное давление воздуха с помощью шприца с резиновым наконечником (Приложение А, рисунок 3). Стопку фильтровальной бумаги или полоску фильтровального картона в штативе для люминометрических кювет периодически перемещают так, чтобы после фильтрования под люминометрической кюветой она оставалась сухой.

Если фильтрование затруднено, то процедуру по 4.5.2 повторяют с увеличением времени выдерживания упаковки в водяной бане до 20 мин.

4.5.4. В люминометрическую кювету по 4.5.3 автоматической пипеткой вместимостью 0,2 см3 вносят 0,2 см3 промывочного раствора (см. 4.2) и продавливают его в фильтровальную бумагу или фильтровальный картон, создавая избыточное давление с помощью шприца с резиновым наконечником. Стопку фильтровальной бумаги (или полоску фильтровального картона) в штативе для люминометрических кювет периодически перемещают так, чтобы после фильтрования под люминометрической кюветой она оставалась сухой.

4.5.5. Подготовленную люминометрическую кювету по 4.5.4 помещают в кюветное отделение прибора для измерения люминесценции и автоматической пипеткой вместимостью 0,02 см3 вносят в нее 0,02 см3 диметилсульфоксида по 4.4.3. Через 1 мин автоматической пипеткой вместимостью 0,05 см3 в люминометрическую кювету вносят последовательно 0,05 см3 деионизированной воды и 0,05 см3 раствора АТФ-реагента по 4.4.4. Раствор перемешивают прокачиванием: трижды набирая содержимое люминометрической кюветы в наконечник автоматической пипетки и возвращая его в люминометрическую кювету. Измеряют люминесценцию анализируемой пробы .

4.5.6. Процедуры по 4.5.3 - 4.5.5 проводят дважды.

4.6. Обработка результатов

4.6.1. За результат измерений люминесценции контрольного образца принимают среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений , если их повторяемость (сходимость) не превышает 10% среднеарифметического значения.

4.6.2. За результат измерений люминесценции анализируемой пробы принимают среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений , если их повторяемость (сходимость) не превышает 10% среднеарифметического значения.

4.6.3. В случае если повторяемость превышает 10%, процедуры по 4.4.6 и 4.5.2 - 4.5.5 повторяют.

4.6.4. Молярную концентрацию АТФ , моль/см3, в анализируемой пробе рассчитывают по формуле

где 0,1 - коэффициент, учитывающий концентрирование микроорганизмов в люминометрической кювете при фильтровании раствора;

- молярная концентрация АТФ в контрольном образце, по 4.4.6;

- среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений люминесценции контрольного образца АТФ по 4.4.6, усл. ед.;

- среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений люминесценции анализируемой пробы, усл. ед.

4.6.5. Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов определяют по таблице 1.