Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом N 184-ФЗ "О техническом регулировании" от 27 декабря 2002 г., а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения".

1. Разработан Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательским институтом питания РАМН.

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 36 "Функциональные пищевые продукты".

3 Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 декабря 2011 г. N 786-ст.

4. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Настоящий стандарт распространяется на функциональные пищевые продукты и устанавливает метод определения массовой доли витамина (холекальциферола) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ).

Диапазон измерений массовой доли витамина составляет от 0,1 до .

Примечание. Настоящий стандарт допускается распространять на пищевые продукты при условии соблюдения диапазона измерений.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 8.563-2009 Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р 52062-2003 Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ Р 52179-2003 Маргарины, жиры для кулинарии, кондитерской, хлебопекарной и молочной промышленности. Правила приемки и методы контроля

ГОСТ Р 52349-2005 Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4517-87 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 8981-78 Эфиры этиловый и нормальный бутиловый уксусной кислоты технические. Технические условия

ГОСТ 9293-74 Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 19627-74 Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 27025-86 Реактивы. Общие указания по проведению испытаний

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р 52349, а также следующий термин с соответствующим определением:

3.1. Содержание витамина : массовая доля холекальциферола, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в миллионных долях .

Витамин экстрагируют после омыления анализируемой пробы с использованием раствора гидроксида калия. Полученный экстракт используют для выделения методом полупрепаративной нормально-фазной (далее - НФ) ВЭЖХ фракции, содержащей витамин , и затем проводят анализ с использованием аналитической обращенно-фазной (далее - ОФ) ВЭЖХ. Витамин детектируют по поглощению в ультрафиолетовой области спектра, пики идентифицируют по их времени удерживания и спектру.

Количественный анализ проводят с помощью метода внутреннего стандарта, используя площадь или высоту пиков. В качестве внутреннего стандарта для определения витамина используется витамин .

5.1. Условия безопасного проведения работ

При выполнении испытаний необходимо соблюдать требования пожарной безопасности, установленные ГОСТ 12.1.004, электробезопасности - ГОСТ Р 12.1.019, техники безопасности при работе с реактивами - ГОСТ 12.1.007, а также требования, изложенные в технической документации на спектрофотометр, хроматограф, другие приборы и оборудование.

Помещение, в котором проводят испытания, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Контроль за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005.

При работе с газовыми баллонами необходимо руководствоваться [1].

5.2. Требования к квалификации оператора

К выполнению испытаний и обработке результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием по профессиям химик, инженер-химик, техник, лаборант, имеющие опыт работы в химической лаборатории. Первое применение метода в лаборатории следует проводить под наблюдением квалифицированного специалиста в области ВЭЖХ.

6.1. Общие условия

Испытания проводят в нормальных лабораторных условиях: температура окружающей среды - (25 +/- 5) °C; относительная влажность - (65 +/- 15)%; частота переменного тока - (50 +/- 5) Гц; напряжение в сети - (220 +/- 10) В.

Хранение стандартных веществ проводят в защищенном от света месте и при температуре не выше 4 °C.

При приготовлении и хранении растворов следует выполнять требования ГОСТ 27025, ГОСТ 4517.

Для предотвращения разрушения витамина анализ испытуемой пробы и стандартов проводят в присутствии антиоксиданта (L-аскорбиновой кислоты, гидрохинона, пирогаллола), предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

6.2. Условия хроматографического анализа

Температура колонки: 25 °C или температура окружающей среды.

Объемная скорость подачи подвижной фазы для НФ и ОФ ВЭЖХ: 0,7 - 1,0 см3/мин.

Объем вводимой пробы для проведения полупрепаративной НФ ВЭЖХ: 0,20 - 0,25 см3.

Объем вводимой пробы для проведения аналитической ОФ ВЭЖХ: 0,1 см3.

Подвижная фаза для проведения полупрепаративной НФ ВЭЖХ (в объемном соотношении): н-гексан:2-пропанол (98:2) или н-гексан:2-пропанол:тетрагидрофуран (98:1:1).

Подвижная фаза для проведения аналитической ОФ ВЭЖХ (в объемном соотношении): ацетонитрил:метиловый спирт (80:20) или ацетонитрил:метиловый спирт:метилен хлористый (50:45:5).

Проверку оптимальности условий хроматографического разделения в условиях полупрепаративной НФ ВЭЖХ осуществляют путем хроматографического анализа раствора анализируемой пробы по 8.2.5. Эффективность хроматографического разделения признается удовлетворительной, если коэффициент разделения пика витамина D от пиков токоферолов матрицы составляет не менее 1,3. В противном случае для достижения требуемой эффективности разделения экспериментальным путем подбирают скорость потока подвижной фазы или проводят испытания других подвижных фаз и колонок.

Проверку оптимальности условий хроматографического разделения в условиях аналитической ОФ ВЭЖХ осуществляют путем хроматографического анализа смешанного раствора витаминов и с массовой концентрацией каждого вещества не менее 0,5 мкг/см3. Данный раствор готовят из основных растворов по аналогии с методикой приготовления рабочих растворов по 8.1.2.1 и 8.1.2.2. Эффективность хроматографического разделения признается удовлетворительной, если коэффициент разделения соседних пиков витаминов и составляет не менее 1,3. В противном случае для достижения требуемой эффективности разделения экспериментальным путем подбирают скорость потока подвижной фазы или проводят испытания других подвижных фаз и колонок.

7.1. Для определения массовой доли витамина применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование и материалы:

- весы по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,1 мг;

- спектрофотометр со спектральным рабочим диапазоном от 190 до 1100 нм, основной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%;

- кюветы кварцевые с длиной оптического пути 1 см;

- хроматограф для проведения анализа методом полупрепаративной ВЭЖХ, включающий следующие элементы: насос; устройство для ввода пробы; колонку для проведения анализа методом полупрепаративной НФ ВЭЖХ диаметром 0,4 - 0,46 см, длиной 25 - 30 см, заполненную силикагелем или силикагелем, модифицированным CN- или с размером частиц 5 мкм; спектрофотометрический (длина волны детектирования 265 нм) или диодно-матричный детектор с погрешностью измерений не более 10% отн., устройство для сбора фракций, регистрирующее устройство (самописец или интегратор), позволяющее проводить измерение площади (или высоты) пика с погрешностью не более 1%; программное обеспечение для обработки полученных результатов измерений;

- хроматограф для проведения анализа методом аналитической ВЭЖХ, включающий следующие элементы: насос; устройство для ввода проб; колонку для проведения анализа методом аналитической ОФ ВЭЖХ диаметром 0,40 - 0,46 см, длиной 25 - 30 см, заполненную октадецилсиликагелем, с размером частиц 5 мкм; спектрофотометрический (длина волны детектирования 265 нм) или диодно-матричный детектор с погрешностью измерений не более 10% отн., регистрирующее устройство (самописец или интегратор), позволяющее проводить измерение площади (или высоты) пика с погрешностью не более 1%; программное обеспечение для обработки полученных результатов измерений;

- фильтры для фильтрования подвижной фазы и анализируемых растворов (например, с размером пор 0,45 мкм);

- микрошприцы типа "Гамильтон" вместимостью 0,2 см3 и 0,5 см3 для ввода проб в жидкостный хроматограф;

- пипетки градуированные 1(2,3)-1(2)-1-0,5(1,2,5,10,25) по ГОСТ 29227 или дозаторы автоматические с аналогичными или изменяемыми объемами доз с относительной погрешностью дозирования не более +/- 1%;

- цилиндры 1-50(100,250)-1(2) по ГОСТ 1770;

- колбы мерные 2-50(100,250,500,1000)-2 по ГОСТ 1770;

- пробирки мерные с притертыми пробками П-2-5(10,15,20,25)-0,1(0,2)ХС по ГОСТ 1770;

- стаканы В(Н)-1-50(100,150,250)ТХС по ГОСТ 25336;

- колбы круглодонные К-1-100(250,500)-29/32ТС по ГОСТ 25336;

- воронки В-36(56)-80ХС, В-75-110(140)ХС, В-100-150ХС по ГОСТ 25336;

- линейка металлическая с ценой деления 1 мм по ГОСТ 427;

- встряхиватель для колб и пробирок с диапазоном частот колебаний платформ 100 - 150 колебаний в минуту;

- центрифуга, обеспечивающая 4 - 6 тыс. об/мин;

- баня водяная с регулятором нагрева, поддерживающая температуру от 30 °C до 100 °C;

- баня ультразвуковая лабораторная рабочим объемом не менее 2 дм3;

- испаритель ротационный с диапазоном рабочего давления от 7 мм рт. ст. до 760 мм рт. ст. (от до ) или насос водоструйный по ГОСТ 25336;

- холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336;

- термометр лабораторный жидкостный с диапазоном температур от 0 до 100 °C, ценой деления шкалы 1 °C по ГОСТ 28498;

- баллон с газообразным азотом по ГОСТ 9293, ос.ч. и [1];

- бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026;

- плитка электрическая закрытого типа по ГОСТ 14919;

- мельница лабораторная электрическая;

- холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

7.2. При выполнении измерений применяют следующие реактивы и материалы:

- абсолютный этиловый спирт массовой долей основного вещества не менее 99,9%;

- ректификованный этиловый спирт массовой долей основного вещества не менее 96% или по ГОСТ Р 51652, ГОСТ 18300;

- метиловый спирт массовой долей основного вещества не менее 99,9%;

- ацетонитрил массовой долей основного вещества не менее 99,8%;

- метилен хлористый массовой долей основного вещества не менее 99,8%;

- н-гексан массовой долей основного вещества не менее 99,5%;

- этилацетат массовой долей основного вещества не менее 99% или по ГОСТ 8981;

- 2-пропанол массовой долей основного вещества не менее 99,5%;

- тетрагидрофуран массовой долей основного вещества не менее 99,5%;

- петролейный эфир, перегнанный при температуре (50 +/- 10) °C, очищенный от перекисей;

- диэтиловый эфир, очищенный от перекисей, содержащий 0,1% пирогаллола по [2];

- калия гидроокись (KOH) по ГОСТ 24363, х.ч. или ч.д.а., раствор KOH массовой долей 50%;

- натрий сернокислый безводный массовой долей основного вещества не менее 99,5% или по ГОСТ 4166, х.ч.;

- дистиллированную воду по ГОСТ 6709;

- кислоту аскорбиновую по [3] или [4], х.ч.;

- гидрохинон массовой долей основного вещества не менее 99% или по ГОСТ 19627;

- пирогаллол массовой долей основного вещества не менее 99%;

- бутилгидрокситолуол - БГТ массовой долей основного вещества не менее 99%, раствор БГТ в н-гексане массовой концентрацией 2 мг/см3;

- эргокальциферол (витамин ), , массовой долей основного вещества не менее 98%;

- холекальциферол (витамин ), , массовой долей основного вещества не менее 98%.

7.3. Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерений, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

8.1. Приготовление растворов

8.1.1. Исходные растворы стандартов

8.1.1.1. Для приготовления исходного раствора витамина в мерную колбу объемом 100 см3 помещают около 100 мг витамина , растворяют в этиловом ректификованном спирте и доводят до метки спиртом. Этот раствор содержит около 1 мг/см3 витамина . Массовую концентрацию исходного раствора витамина уточняют по 8.1.2.1.

8.1.1.2. Для приготовления исходного раствора витамина в мерную колбу объемом 100 см3 помещают около 100 мг витамина , растворяют в этиловом ректификованном спирте и доводят до метки спиртом. Этот раствор содержит около 1 мг/см3 витамина . Массовую концентрацию исходного раствора витамина уточняют по 8.1.2.2.

Приготовленные растворы хранят в темноте при температуре не выше 4 °C.

8.1.2. Рабочие растворы стандартов

8.1.2.1. 1 см3 исходного раствора витамина , приготовленного по 8.1.1.1, с помощью пипетки переносят в мерную колбу объемом 100 см3 и доводят до метки этиловым ректификованным спиртом. Раствор готовят непосредственно перед проведением анализа. Массовая концентрация рабочего раствора витамина составляет 10 мкг/см3.

Измерение оптической плотности стандартного раствора витамина проводят в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при 265 нм, используя в качестве раствора сравнения спирт этиловый ректификованный. Для расчета массовой концентрации раствора витамина (, мкг/см3) используют уравнение:

где - значение оптической плотности рабочего раствора витамина при 265 нм;

475 - значение оптической плотности раствора витамина массовой концентрации 1 г в 100 см3 при 265 нм в спирте этиловом при толщине поглощающего слоя 1 см ;

- коэффициент пересчета граммов в микрограммы;

100 - коэффициент пересчета на 1 см3.

8.1.2.2. 1 см3 исходного раствора витамина , приготовленного по 8.1.1.2, с помощью пипетки переносят в мерную колбу объемом 100 см3 и доводят до метки спиртом этиловым ректификованным. Раствор готовят непосредственно перед проведением анализа. Массовая концентрация рабочего раствора витамина составляет 10 мкг/см3.

Измерение оптической плотности стандартного раствора витамина проводят в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при 265 нм, используя в качестве раствора сравнения спирт этиловый ректификованный. Для расчета массовой концентрации раствора витамина (, мкг/см3) используют уравнение:

где - значение оптической плотности рабочего раствора витамина при 265 нм;

485 - значение оптической плотности раствора витамина массовой концентрации 1 г в 100 см3 при 265 нм в спирте этиловом при толщине поглощающего слоя 1 см ;

- коэффициент пересчета граммов в микрограммы;

100 - коэффициент пересчета на 1 см3.

8.1.2.3. Для приготовления рабочего раствора внутреннего стандарта витамина 10 см3 стандартного раствора витамина по 8.1.1.1 с помощью пипетки помещают в мерную колбу объемом 100 см3 и доводят до метки спиртом этиловым ректификованным. Раствор готовят непосредственно перед использованием. Массовая концентрация рабочего раствора витамина составляет 1 мкг/см3.

8.1.2.4. Для приготовления рабочего раствора смеси витаминов и , необходимого для проведения полупрепаративной НФ ВЭЖХ, помещают 5 см3 рабочего раствора витамина по 8.1.2.1 и 5 см3 рабочего раствора витамина по 8.1.2.2 в колбу роторного испарителя. Растворитель тщательно упаривают на водяной бане при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток перерастворяют в 50 см3 н-гексана или подвижной фазы, используемой для проведения полупрепаративной НФ ВЭЖХ. Массовая концентрация витамина в растворе составляет 1 мкг/см3.

8.1.2.5. Из исходных растворов готовят не менее четырех рабочих растворов витамина в диапазоне концентраций 0,1 - 10,0 мкг/см3, используемых для построения градуировочного графика по 8.4. Для этого 1,0 см3 и 10,0 см3 рабочего раствора витамина по 8.1.2.2 с помощью пипетки помещают в мерную колбу на 100 см3 и растворы доводят до метки спиртом этиловым абсолютным (массовая концентрация полученных растворов витамина составляет 0,1 мкг/см3 и 1,0 мкг/см3), а также 0,5 см3 и 1,0 см3 исходного раствора витамина по 8.1.1.2 помещают в мерную колбу на 100 см3 и растворы доводят до метки спиртом этиловым абсолютным (массовая концентрация полученных растворов витамина составляет 5,0 мкг/см3 и 10,0 мкг/см3).

8.2. Отбор и подготовка проб

8.2.1. Отбор проб проводят по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 26809, ГОСТ Р 52062, ГОСТ Р 52179.

8.2.2. Крупные частицы средней пробы, выделенной методом квартования из лабораторной пробы, измельчают с использованием подходящего оборудования (например, лабораторной мельницы) до такого состояния, чтобы весь продукт проходил через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Размолотую пробу тщательно перемешивают.

Анализируемые пробы гомогенизируют, избегая воздействия повышенной температуры.

8.2.3. Для омыления испытуемой пробы, содержащей менее 30% жира, 5 - 20 г исследуемого материала помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 - 500 см3, добавляют 90 - 100 см3 этилового ректификованного спирта, 1 г аскорбиновой кислоты (или 1 г пирогаллола), 50 см3 50%-ного раствора гидроокиси калия. Перед омылением в колбу вносят соответствующее количество раствора внутреннего стандарта. Количество витамина должно быть близким к ожидаемому количеству витамина в анализируемом образце. Омыление проводят в течение 30 мин на водяной бане с обратным холодильником (желательно в токе азота) при температуре 70 °C - 80 °C.

При проведении щелочного гидролиза при комнатной температуре в течение не менее 16 ч используют вышеуказанные соотношения материала и реактивов.

8.2.4. Для омыления испытуемой пробы, содержащей более 30% жира, в колбу для омыления вносят 5 - 20 г исследуемого материала, добавляют 90 - 100 см3 спирта этилового, примерно 1 г аскорбиновой кислоты (или 1 г пирогаллола), 50 см3 50%-ного раствора гидроокиси калия. Перед омылением в колбу вносят соответствующее количество раствора внутреннего стандарта витамина , количество которого должно быть близким к ожидаемому количеству витамина в анализируемом образце. Омыление проводят на водяной бане в течение 30 - 45 мин (желательно в токе азота) при температуре 95 °C - 100 °C.

Рекомендуемое добавляемое количество внутреннего стандарта приведено в таблице 1.

Если после омыления и охлаждения жир или масло остаются на поверхности омыляемой смеси, то вновь приливают 50 см3 50%-ного раствора KOH и омыление повторяют.

После окончания гидролиза, проведенного по 8.2.3 (8.2.4), содержимое колбы быстро охлаждают до (20 +/- 5) °C и количественно переносят в делительную воронку. Витамин D экстрагируют 100 см3 н-гексана (этилацетата, петролейного или диэтилового эфира).

Для удаления воды экстракт фильтруют через фильтр с 2 - 5 г безводного сульфата натрия. Фильтр промывают 20 см3 н-гексана, затем добавляют в фильтрат 1 см3 раствора (2 мг/см3) БГТ в н-гексане. Экстракт промывают 3 - 5 раз порциями воды по 50 - 100 см3 до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по универсальной индикаторной бумаге) и затем упаривают с помощью роторного испарителя при пониженном давлении и при температуре не выше 40 °C.

8.2.5. Для приготовления раствора исследуемого образца для анализа с помощью полупрепаративной НФ ВЭЖХ к сухому остатку после упаривания экстракта приливают 2 см3 н-гексана (или другого растворителя или смеси растворителей, которые используются в качестве подвижной фазы в системе полупрепаративной ВЭЖХ).

8.2.6. Для выделения фракции, содержащей витамин D, 0,2 - 0,5 см3 раствора по 8.2.5 элюируют в условиях полупрепаративной ВЭЖХ и собирают элюат, содержащий смесь витаминов и (в условиях НФ ВЭЖХ эти соединения элюируются одновременно), предварительно определив время удерживания этих соединений по 8.3. Время удерживания витамина D зависит от используемых подвижных и неподвижных фаз и обычно составляет 10 - 15 мин. Общее время хроматографического разделения составляет 25 - 30 мин.

8.2.7. Фракцию элюата, полученную по 8.2.6, упаривают на роторном испарителе при пониженном давлении и температуре не более 40 °C, и сухой остаток перерастворяют в 0,5 см3 подвижной фазы для аналитической ОФ ВЭЖХ.

8.3. Подготовка жидкостных хроматографов

Подготовку жидкостных хроматографов к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации оборудования. Перед началом работы колонки промывают элюентом.

Раствор смеси витаминов и по 8.1.2.4 несколько раз вводят в хроматограф для полупрепаративного анализа и проверяют повторяемость времени удерживания витамина D (в варианте НФ ВЭЖХ витамины и элюируются одновременно). Хроматографические условия оптимизируют для оптимального разделения пика витамина D от пиков токоферолов и других соединений матрицы.

Раствор смеси витаминов и по 8.1.2.6 несколько раз вводят в хроматограф для варианта аналитической ОФ ВЭЖХ и проверяют повторяемость полного разделения пиков витаминов и (степень разделения пиков должна быть не менее 1,0). Условия хроматографирования также должны обеспечивать оптимальное отделение пиков витаминов и от пиков других соединений матрицы.

8.4. Построение градуировочной зависимости

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя по программному обеспечению.

Градуировочный график строят в координатах "аналитический сигнал, или мм" - "массовая концентрация витамина в градуировочном растворе, мкг/см3". Для каждого анализируемого градуировочного раствора проводят два параллельных измерения и находят среднеарифметическое значение. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времени удерживания не должно превышать 5% средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых концентраций витамина . Коэффициент градуировочного графика определяют как среднеарифметическое значение коэффициентов , вычисляемых по формуле

где - массовая концентрация микронутриентов в i-м градуировочном растворе, мкг/см3;

- площадь пика i-го градуировочного раствора, , или высота, мм.

Проводят хроматографический анализ не менее четырех рабочих стандартных растворов витамина , приготовленных по 8.1.2.5.

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется значением достоверной аппроксимации .

Градуировка проводится в следующих случаях: на этапе освоения метода, при изменении условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

В колонку хроматографа для проведения аналитической ОФ ВЭЖХ последовательно вводят равные объемы испытуемого раствора по 8.2.7 и одного из градуировочных растворов по 8.1.2.5.

Идентификацию пиков проводят, сопоставляя время удерживания, спектры в УФ-диапазоне длин волн или соотношения интенсивности сигнала детектора при различных длинах волн для соответствующих пиков стандартов и определяемых соединений.

Поправочный коэффициент k рассчитывают с помощью метода внутреннего стандарта по формуле

где - площадь ( или ) или высота (мм) пика внутреннего стандарта витамина ;

- площадь ( или ) или высота (мм) пика определяемого витамина ;

- массовая концентрация внутреннего стандарта витамина по 8.1.2.3, мкг/см3;

- массовая концентрация определяемого витамина , мкг/см3.

Массовую долю витамина в анализируемом образце X, , рассчитывают по формуле

где - масса внутреннего стандарта (витамина ), добавленного к навеске пробы анализируемого образца, мг;

- масса пробы, взятой для омыления, кг;

- площадь ( или ) или высота (мм) пика внутреннего стандарта витамина ;

- площадь ( или ) или высота (мм) пика определяемого витамина ;

k - поправочный коэффициент, рассчитанный по формуле 4.

Результат вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака.

Каждую пробу анализируют дважды, начиная со взятия навески испытуемой пробы. Расхождение между результатами двух параллельных измерений , (в процентах от среднего значения ), выполненными одним оператором с использованием идентичных реактивов и оборудования и в минимально возможный промежуток времени, не должно превышать норматива контроля сходимости r с доверительной вероятностью 95%.

При соблюдении этого условия за окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение .

Границы относительной погрешности определения массовой доли витамина , в процентах от результата испытания, и при доверительной вероятности 95% не должны превышать значений, указанных в таблице 2.

Результат определения витамина представляют в следующем виде:

где - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, ;

- значение границы абсолютной погрешности определений, , рассчитанное по формуле

где - значение границы относительной погрешности измерений, % (таблица 2).

11.1. Повторяемость

Каждую пробу анализируют дважды, начиная со взятия навески испытуемой пробы. Расхождение между результатами двух параллельных измерений (, ), выполненными одним оператором с использованием идентичных реактивов и оборудования и в минимально возможный промежуток времени, считают удовлетворительным, если , где - среднеарифметическое значение. Значение r (предел повторяемости) приведено в таблице 2.

При превышении r испытание повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

11.2. Воспроизводимость

Пробу делят на две равные части. Расхождение между результатами двух определений (, ), выполненными разными операторами в разное время с использованием различных реактивов и оборудования, считают удовлетворительным, если , где X - среднеарифметическое значение. Значение R (предел воспроизводимости) приведено в таблице 2.

При превышении R испытание повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

11.3. Контроль погрешности результатов испытаний

Контроль погрешности (точности) результатов испытаний проводят методом добавок. Пробу делят на две равные части. В одну из них добавляют стандарт витамина в количестве, составляющем 50% - 150% от исходного содержания компонента в пробе, и проводят испытания в соответствии с настоящим стандартом.

Результаты испытаний признают удовлетворительными, если погрешность определения массовой доли витамина в добавке не превышает норматива оперативного контроля погрешности , :

где - среднеарифметическое значение результатов двух испытаний пробы с добавкой, ;

- среднеарифметическое значение результатов двух испытаний пробы без внесения добавки, ;

- массовая доля добавки, .

При проведении внутрилабораторного контроля значение рассчитывают (при доверительной вероятности 90%) по формуле

где - значение границы относительной погрешности определения массовой доли витамина , указанное в таблице 2.

При проведении межлабораторного контроля значение рассчитывают (при доверительной вероятности 95%) по формуле

11.4. Контроль стабильности результатов при реализации методики в лаборатории

Контроль стабильности результатов измерений в лаборатории осуществляют в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя метод контроля стабильности стандартного отклонения промежуточной прецизионности по ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 6.2.3) с применением контрольных карт Шухарта. Периодичность контроля и процедуры контроля стабильности результатов измерений должны быть предусмотрены в руководстве по качеству лаборатории в соответствии с ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025 (подраздел 4.2) и ГОСТ Р 8.563 (пункт 7.1.1).