Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены".

1. Подготовлен Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом мясной промышленности имени В.М. Горбатова Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии).

2. Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации (ТК 226).

3. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 42-2012 от 15 ноября 2012 г.).

За принятие проголосовали:

4. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1475-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31787-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5. Стандарт подготовлен на основе ГОСТ Р 53641-2009.

6. Введен впервые.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в указателе "Национальные стандарты".

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в указателе "Национальные стандарты", а текст изменений - в информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе "Национальные стандарты".

Настоящий стандарт распространяется на мясные продукты - вареные колбасные изделия из термически обработанных ингредиентов (ливерные колбасы и паштеты с использованием субпродуктов) и устанавливает фотометрический метод определения остаточной активности кислой фосфатазы.

Диапазон измерения массовой доли остаточной активности кислой фосфатазы от 0% до 0,012% фенола.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ИСО 5725-2-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования номенклатуры видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042:1983, ИСО 4788:1980) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3652-69 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия

ГОСТ 4025-95 Мясорубки бытовые. Технические условия

ГОСТ 4109-79 Реактивы. Бром. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 5789-78 Реактивы. Толуол. Технические условия

ГОСТ 6552-80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9792-73 Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 10931-74 Реактивы. Натрий молибденовокислый 2-водный. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 18289-78 Реактивы. Натрий вольфрамовокислый 2-водный. Технические условия

ГОСТ 20469-95 Электромясорубки бытовые. Технические условия

ГОСТ 20903-75 Кюветы прямоугольные кварцевые для спектрофотометров. Основные размеры. Технические требования

ГОСТ 22280-76 Реактивы. Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия

ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой.

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

Метод основан на фотометрическом измерении интенсивности окраски продукта, зависящей от величины остаточной активности кислой фосфатазы, выраженной массовой долей фенола, в процентах.

4.1. Отбор проб - по ГОСТ 9792, [1].

4.2. Дополнительно анализируемую пробу освобождают от оболочки, измельчают, дважды пропуская через мясорубку, и тщательно перемешивают. Затем пробу помещают в стеклянную или пластмассовую емкость вместимостью 200 - 400 см3, заполняя ее полностью, и закрывают крышкой.

Пробу хранят при температуре (4 +/- 2) °C до окончания испытаний.

Спектрофотометр, обеспечивающий измерение при длине волны (600 +/- 10) нм, или фотоэлектрический калориметр со светофильтром, имеющим максимум поглощения при длине волны (600 +/- 10) нм.

pH-метр лабораторный, позволяющий проводить измерения с допускаемой погрешностью +/- 0,05 единицы pH.

Кюветы стеклянные по ГОСТ 20903 с расстоянием между рабочими гранями 10 мм.

Мясорубка бытовая по ГОСТ 4025 или электромясорубка бытовая по ГОСТ 20469 с отверстиями решетки диаметром от 3 до 4 мм.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания +/- 0,0001 г.

Ультратермостат или водяная баня, обеспечивающие регулирование температуры от 30 °C до 100 °C.

Воронки В-36-80 ХС, В-56-80 ХС по ГОСТ 25336.

Колбы мерные 2-500-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770, откалиброванные на наливной объем.

Холодильник ХШ-1-400-29/32 ХС по ГОСТ 25336.

Колба К-1-2000-29/32 ТХС по ГОСТ 25336.

Пипетки 4-2-1, 4-2-2, 7-2-5, 7-2-10 по ГОСТ 29169.

Пробирки П1-16-150 ХС, П1-21-200 ХС, П1-25-200 ХС по ГОСТ 25336.

Палочки стеклянные.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Груша резиновая.

Кислота лимонная по ГОСТ 3652, х.ч.

Натрий лимоннокислый 5,5-водный по ГОСТ 22280, ч.д.а.

Фенилфосфорной кислоты динатриевая соль, ч, свежеприготовленный раствор массовой концентрации 2 г/дм3.

Кислота трихлоруксусная кристаллическая, ч, растворы массовой концентрации 50 и 200 г/дм3.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч., раствор молярной концентрации 0,5 моль/дм3.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Фенол по 23519 марки А.

Толуол по ГОСТ 5789, ч.д.а.

Натрий вольфрамовокислый 2-водный по ГОСТ 18289, х.ч.

Натрий молибденовокислый по ГОСТ 10931, ч.д.а.

Литий сернокислый 1-водный с массовой долей основного вещества не менее 97%.

Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552, х.ч., плотностью 1,72 г/см3.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч., плотностью 1,19 г/см3.

Бром по ГОСТ 4109, х.ч.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, оборудования с техническими характеристиками и реактивов по качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.

6.1. Приготовление цитратного буфера

В мерной колбе вместимостью 1000 см3 в дистиллированной воде растворяют (13,88 +/- 0,005) г лимоннокислого натрия и (0,588 +/- 0,0005) г лимонной кислоты, доливают дистиллированной водой до метки и перемешивают, pH буфера 6,5. Затем добавляют 1 см3 толуола.

Срок хранения раствора в холодильнике при температуре (4 +/- 1) °C - не более 12 сут.

6.2. Приготовление реактива Фолина

100 г вольфрамовокислого натрия и 25 г молибденовокислого натрия растворяют в 700 см3 дистиллированной воды. К раствору добавляют 50 см3 ортофосфорной кислоты и 100 см3 соляной кислоты. Смесь осторожно кипятят в течение 10 ч в колбе вместимостью 2000 см3 с обратным холодильником, после чего охлаждают при комнатной температуре. Затем добавляют 150 г сернокислого лития, 50 см3 дистиллированной воды и несколько капель брома. Остаток брома отгоняют кипячением смеси в вытяжном шкафу, охлаждают, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3, доводят объем дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют. Приготовленный реактив Фолина должен быть золотисто-желтого цвета без зеленого оттенка.

Срок хранения реактива Фолина в склянке с притертой пробкой в темном месте - не более 6 мес.

Допускается применение готового реактива Фолина <*>.

--------------------------------

<*> 1,2-Naphthoquinone-4-sulfonic acid sodium salt, фирма "Fluka", номер по каталогу - 47641.

6.3. Приготовление основного раствора

На лабораторных весах взвешивают 2,0 г фенола с записью результата до третьего знака после запятой, растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1000 см3, доводят объем до метки и перемешивают. Отбирают пипеткой с помощью резиновой груши 5 см3 раствора в колбу вместимостью 500 см3, добавляют около 300 см3 дистиллированной воды, вносят 25 г кристаллической трихлоруксусной кислоты. После растворения содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Полученный основной раствор содержит 20 мкг фенола в 1 см3.

6.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика готовят три основных раствора.

6.4.1. Приготовление градуировочных растворов

Из каждого основного раствора готовят шесть градуировочных растворов. Для этого в соответствии с таблицей 1 в пробирки вместимостью 25 см3 вносят основной раствор фенола и доводят объем в каждой пробирке до 2,5 см3, добавляя соответствующий объем раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 50 г/дм3.

6.4.2. В каждую пробирку добавляют 5 см3 раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 0,5 моль/дм3 перемешивают, выдерживают 10 мин, добавляют 1,5 см3 реактива Фолина, разведенного дистиллированной водой в соотношении 1:2, и снова перемешивают.

Через 30 мин в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм измеряют оптическую плотность растворов по отношению к контрольному раствору (пробирка N 1) при длине волны (600 +/- 10) нм.

6.4.3. По полученным средним данным из трех основных растворов строят градуировочный график. Пример построения градуировочного графика для определения массовой доли фенола приведен в Приложении А.

6.5. Приготовление испытуемого раствора

Из подготовленной к испытанию пробы берут две навески массой по 1 г (результат взвешивания записывают до третьего десятичного знака) и переносят в две пробирки - опытную и контрольную.

В пробирки вносят по 10 см3 цитратного буфера pH 6,5, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и настаивают в течение 20 мин при комнатной температуре, периодически перемешивая.

В контрольную пробирку добавляют 5 см3 раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 200 г/дм3, перемешивают и добавляют 5 см3 раствора динатриевой соли фенилфосфорной кислоты массовой концентрации 2 г/дм3, выдерживают 10 мин и фильтруют.

В опытную пробирку добавляют 5 см3 раствора динатриевой соли фенилфосфорной кислоты массовой концентрации 2 г/дм3 и помещают в ультратермостат при температуре (39 +/- 1) °C на 1 ч, затем добавляют 5 см3 раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 200 г/дм3, выдерживают 10 мин и фильтруют.

7.1. Для проведения цветной реакции из контрольной и опытной пробирок отбирают по 2,5 см3 безбелкового фильтрата. Цветную реакцию проводят по 6.4.2.

7.2. По градуировочному графику определяют массовую долю фенола в пробирках.

8.1. Массовую долю фенола, X, %, вычисляют по формуле

где C - масса фенола, найденная по градуировочному графику, соответствующая оптической плотности, найденной по разности плотностей в опытной и контрольной пробирках , мкг;

20 - разведение навески, см3;

m - масса анализируемой пробы, г;

2,5 - объем фильтрата, отобранный для цветной реакции, см3;

- коэффициент пересчета в г;

- оптическая плотность раствора в опытной пробирке;

- оптическая плотность раствора в контрольной пробирке.

Вычисление проводят до четвертого знака после запятой.

8.2. За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение двух параллельных измерений, полученных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

где и - результаты двух параллельных измерений, %;

r - значение предела повторяемости, %.

В случае, если абсолютное расхождение между результатами двух измерений превышает предел повторяемости (сходимости) r, проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, проводят в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-6. За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение повторных параллельных измерений, имеющих расхождение в допустимых пределах. Окончательный результат округляют до третьего десятичного знака.

8.3. Результаты измерения представляют в виде

где - среднеарифметическое значение двух параллельных определений, признанных приемлемыми, %;

- граница абсолютной погрешности измерения при P = 0,95.

9.1. Диапазон измерения

Диапазон измерения массовой доли остаточной активности кислой фосфатазы от 0% до 0,012% фенола.

9.2. Прецизионность метода

Показатели прецизионности метода определены в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-2.

9.2.1 Границы абсолютной погрешности результатов измерения, %, при доверительной вероятности P = 0,95 вычисляют по формуле

где - среднеарифметическое значение двух параллельных измерений, признанных приемлемыми, %.

9.2.2. Предел повторяемости r, %, при доверительной вероятности P = 0,95 вычисляют по формуле

Расхождение между результатами двух измерений, полученными на идентичной испытуемой пробе, одним оператором, с использованием одного и того же оборудования в пределах кратчайшего из возможных интервалов времени, будет превышать предел повторяемости r в среднем не более одного раза из двадцати случаев при правильном использовании метода.

9.2.3. Абсолютное расхождение между результатами двух единичных измерений, полученными одним и тем же методом на идентичной испытуемой пробе, в разных лабораториях, разными операторами, с использованием разного оборудования, будут различаться с превышением предела воспроизводимости R, %, в среднем не более одного раза из двадцати случаев, который вычисляют по формуле

где - среднеарифметическое значение результатов двух измерений, %.

10.1. При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.

10.2. Помещение, в котором проводятся измерения, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

10.3. При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.019.

А.1. График для определения массовой доли фенола приведен на рисунке А.1.