Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом "Научно-исследовательский и проектно-конструкторский институт по развитию и эксплуатации флота" (ОАО "Гипрорыбфлот")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. N 51)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1626-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31781-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5 Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52840-2007

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Настоящий стандарт распространяется на рыбу-сырец <*>, мороженые рыбу, филе рыбы и рыбный фарш, используемые для приготовления пищевой продукции, и устанавливает метод изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в полиакриламидном геле для их видовой идентификации.

--------------------------------

<*> Охлажденная (без применения льда и воды).

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 83-79 Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия

ГОСТ 244-76 Натрия тиосульфат кристаллический. Технические условия

ГОСТ 1277-75 Реактивы. Серебро азотнокислое. Технические условия

ГОСТ 1625-89 Формалин технический. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4165-78 Медь (II) сернокислая 5-водная. Технические условия

ГОСТ 5962-67 Спирт этиловый ректификованный. Технические условия

ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 7631-85 Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 12738-77 Колбы стеклянные с градуированной горловиной. Технические условия

ГОСТ 19814-74 Кислота уксусная синтетическая и регенерированная. Технические условия

ГОСТ 24104-2001 <*> Весы лабораторные. Общие технические требования

--------------------------------

<*> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты", опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 изоэлектрическая точка белка: Значение водородного показателя (pH), при котором заряд молекулы белка равен нулю.

3.2 маркерные белки: Основные белки, характерные (видоспецифичные) для каждого вида анализируемого объекта.

3.3 стандартные белки: Белки с известной изоэлектрической точкой.

3.4 референс-образец: Образец рыбы, идентифицированный по морфологическим признакам.

3.5 саркоплазматические белки: Белки, входящие в состав саркоплазмы клеток мышечной ткани.

Примечание - На рыбу, отобранную для получения образца, должна быть оформленная декларация о соответствии или сертификат соответствия с указанием ее научного названия (на латинском языке). Образец хранят в герметично упакованном виде при температуре не выше минус 18 °C.

Метод основан на видовой специфичности саркоплазматических белков и заключается в разделении молекул белков по их изоэлектрическим точкам в полиакриламидном геле. Идентификация проводится путем сравнения картин распределения белковых полос анализируемого образца с референс-образцом для данного вида.

5.1.1 Универсальная модульная автоматизированная система для разделения белков с использованием готовых гелевых сред в программируемом режиме и автоматической обработкой гелей (фиксация, окрашивание, отмывка), с контролем условий разделения (температуры, параметров тока) со следующими программными параметрами: напряжение от 10 до 2000 В, сила тока от 0,1 до 50,0 мА, мощность от 0,1 до 7,0 Вт, температура от 0 °C до 70 °C или иное электрофоретическое оборудование для разделения белков методом ИЭФ.

5.1.2 Центрифуга рефрижераторная с частотой вращения не менее 13000 мин^-1.

5.1.3 Пробирки центрифужные вместимостью 50 и 10 см³.

5.1.4 Гели полиакриламидные (5% T, 3% C), содержащие фармалит.

5.1.5 Аппликатор с капиллярными отверстиями объемом 1 мкл для внесения образцов в гель.

5.1.6 Микродозатор с переменным объемом дозирования от 0,5 до 10,0 мм³ (шаг - 0,1 мм³, точность +/- (1,5 - 5,0)%, воспроизводимость от 1,0% до 5,0%.

5.1.7 Наконечники для микродозаторов (микропипеток) с переменным объемом дозирования жидкостей.

5.1.8 Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические вместимостью от 50 до 1000 см³ по ГОСТ 25336.

5.1.9 Колбы стеклянные с градуированной горловиной вместимостью 100 см³ по ГОСТ 12738.

5.1.10 Штамп лунок для образца с лунками вместимостью не менее 1,5 мкл.

5.1.11 Цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 50 и 100 см³ по ГОСТ 1770.

5.1.12 Пипетки стеклянные градуированные вместимостью 5 см³ по ГОСТ 29227.

5.1.13 Ступка фарфоровая по ГОСТ 9147.

5.1.14 Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом абсолютной погрешности однократного взвешивания не более +/- 0,01 г.

5.1.15 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда по ГОСТ 26678.

5.1.16 Пленка парафиновая.

5.1.17 Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

5.2.1 Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 19814, х.ч.

5.2.2 Медь сернокислая 5-водная по ГОСТ 4165, ч.д.а.

5.2.3 Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962, х.ч.

5.2.4 Краситель кумасси бриллиантовый голубой R 250.

5.2.5 Глицерин по ГОСТ 6259, ч.д.а.

5.2.6 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

5.2.7 Альдегид глутаровый с содержанием основного компонента не менее 25%.

5.2.8 Серебро азотнокислое по ГОСТ 1277.

5.2.9 Натрий углекислый по ГОСТ 83.

5.2.10 Формальдегид по ГОСТ 1625.

5.2.11 Трис-HCl (CH₂OH)₃CNH₂HCl.

5.2.12 Кислота трихлоруксусная CCl₃COOH.

5.2.13 Кислота уксусная синтетическая и регенерированная по ГОСТ 19814.

5.2.14 Набор стандартных калибровочных белков с известными изоэлектрическими точками в диапазоне pH 3 - 9; 4 - 6,5; 5 - 8.

5.2.15 Натрия тиосульфат кристаллический по ГОСТ 244.

Отбор проб проводят по ГОСТ 7631.

7.1.1 Фиксирующий раствор: в колбу вместимостью 500 см³ помещают 100 г трихлоруксусной кислоты и доводят объем дистиллированной водой до метки. Раствор используют 3 - 4 раза.

7.1.2 Промывной раствор (обесцвечивающий): в колбу вместимостью 1000 см³ вносят 300 см³ 96%-ного этилового спирта, добавляют 600 см³ дистиллированной воды и 100 см³ ледяной уксусной кислоты. Раствор используют 3 - 4 раза.

7.1.3 Окрашивающие растворы состоят из основного и рабочего.

7.1.3.1 Основной раствор: в стеклянную плоскодонную колбу вместимостью 300 см³ помещают (0,400 +/- 0,001) г кумасси бриллиантового голубого, добавляют 80 см³ дистиллированной воды и перемешивают в течение 10 мин. Затем добавляют 120 см³ 96%-ного этилового спирта и перемешивают в течение 5 мин.

7.1.3.2 Рабочий раствор: смешивают 10 см³ раствора по 7.1.3.1 с 90 см³ раствора по 7.1.2, добавляют (0,170 +/- 0,001) г сернокислой 5-водной меди. Сульфат меди добавляют, чтобы уменьшить окрашивание фона. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

7.1.4 Консервирующий раствор: в колбу вместимостью 1000 см³ вносят 40 см³ глицерина, добавляют 920 см³ дистиллированной воды и 40 см³ уксусной ледяной кислоты.

7.1.5 Промывной раствор готовят в количестве не менее 400 см³, фиксирующий, окрашивающий и консервирующий растворы - не менее 80 см³.

7.2.1 Фиксирующий раствор: в колбу вместимостью 500 см³ помещают (100,00 +/- 0,01) г трихлоруксусной кислоты и доводят объем дистиллированной водой до метки. Раствор используют 3 - 4 раза.

7.2.2 Промывной раствор: в колбу вместимостью 1000 см³ вносят 100 см³ 96%-ного этилового спирта, добавляют 850 см³ дистиллированной воды и 50 см³ ледяной уксусной кислоты.

7.2.3 Раствор, усиливающий окраску (сенсибилизатор): в колбе вместимостью 100 см³ смешивают 30 см³ 25%-ного глутарового альдегида и 60 см³ дистиллированной воды.

7.2.4 Окрашивающий раствор: в колбу вместимостью 100 см³ вносят (0,150 +/- 0,001) г азотнокислого серебра и доводят объем дистиллированной водой до метки.

7.2.5 Раствор, развивающий окраску (проявитель): в колбу вместимостью 1000 см³ вносят 200 см³ 12,5%-ного раствора углекислого натрия, 800 см³ дистиллированной воды и 400 мкл 37%-ного формальдегида.

7.2.6 Раствор, останавливающий окраску: в колбу вместимостью 100 см³ вносят (1,60 +/- 0,01) г тиосульфата натрия и (3,70 +/- 0,01) г трис-HCl и доводят объем дистиллированной водой до метки.

7.2.7 Консервирующий раствор: в колбу вместимостью 100 см³ вносят 10 см³ глицерина и доводят объем дистиллированной водой до метки.

7.2.8 Промывной раствор готовят в количестве не менее 400 см³. Фиксирующий, окрашивающий, проявляющий растворы и растворы, усиливающий окраску и останавливающий окраску, готовят в количестве не менее 80 см³. Количество дистиллированной воды - не менее 400 см³.

8.1.1 Мышечную ткань исследуемого образца и референс-образца освобождают от крови, темных мышц. Навеску массой (5,0 +/- 0,1) г светлой мышечной ткани рыбы-сырца, филе или сырого фарша измельчают в течение 30 с в ступке с 5 см³ дистиллированной воды.

8.1.2 Смесь, полученную по 8.1.1, переносят в центрифужные пробирки вместимостью 50 см³ и центрифугируют при температуре 4 °C в рефрижераторной центрифуге при частоте вращения 4000 мин^-1 в течение 15 мин.

8.1.3 Надосадочную жидкость, полученную по 8.1.2, переносят в центрифужные пробирки вместимостью 10 см³ и центрифугируют при температуре 4 °C в рефрижераторной центрифуге при частоте вращения 12000 мин^-1 в течение 15 мин.

8.1.4 Надосадочную жидкость, полученную по 8.1.3, фильтруют через бумажный фильтр в колбу. Полученный прозрачный раствор используют для проведения ИЭФ.

Готовят раствор стандартных калибровочных белков в дистиллированной воде в зависимости от диапазона pH, выбранного для анализа: в 30 - 40 мкл дистиллированной воды для окрашивания кумасси и в 2 см дистиллированной воды для окрашивания серебром.

8.3.1 Включают систему.

8.3.2 Помещают полиакриламидный гель в систему в соответствии с инструкцией, прилагаемой к ней.

8.3.3 Формируют лунки в парафиновой пленке с помощью штампа: штамп с лунками, обращенными вверх, кладут на стол; накрывают парафиновой пленкой защитным покрытием вверх (по направлению линий отверстий); в парафиновой пленке, двигаясь вдоль линии лунок, делают углубления при помощи стеклянной палочки, а затем снимают защитный слой.

8.3.4 Растворы, полученные по 8.1.4 из анализируемого образца и референс-образца, а также раствор стандартного набора калибровочных белков с известной изоэлектрической точкой, выбранный в зависимости от заложенного в программе диапазона pH, вносят микродозатором в лунку в количестве 1,5 мкл.

8.3.5 Аппликатор опускают на поверхность растворов исследуемого образца, референс-образца и стандартного набора калибровочных белков, помещенных в лунки, сформированные в парафиновой пленке с помощью штампа по 8.3.3, нарушая поверхность капель для заполнения капилляров.

8.3.6 Аппликатор, наполненный образцами по 8.3.5, помещают в систему со стороны катода и проводят ИЭФ в автоматическом режиме на полиакриламидных гелях по программам в соответствии с таблицами 1 и (или) 2.

Выбор программы зависит от цели анализа: для выбора оптимального диапазона pH при измерении изоэлектрических точек используют широкий диапазон pH 3,0 - 9,0, для характеристики и анализа белков с небольшими различиями в изоэлектрической точке используют более узкие диапазоны: pH 5,0 - 9,0 и pH 4,0 - 6,5.

Программы проведения изоэлектрофокусирования в широком и узких диапазонах pH состоят из трех этапов:

- префокусирование (происходит формирование градиента pH);

- этап нанесения исследуемых образцов (белки вносятся в гель);

- этап разделения (белки мигрируют к своим изоэлектрическим точкам).

Этап фокусирования продолжается от 8 до 10 мин. Общее время ИЭФ составляет около 30 мин.

После окончания ИЭФ полиакриламидный гель помещают в камеру для окрашивания.

Полиакриламидные гели окрашивают в автоматическом режиме с применением красителя кумасси бриллиантового голубого в соответствии с таблицей 3 для образцов с высоким (от 20 до 50 нг/мкл) содержанием белка или с применением азотнокислого серебра в соответствии с таблицей 4 для образцов с низким содержанием белка (от 1 до 5 нг/мкл).

Растворы используют только один раз (за исключением фиксирующего раствора), не применяя циркуляцию. Приготовленные растворы, за исключением проявителя, стабильны 2 - 3 сут при температуре от 20 °C до 25 °C.

Окрашивание и обесцвечивание занимают от 30 до 35 мин. После консервирования полиакриламидные гели вынимают из системы и высушивают при температуре от 20 °C до 25 °C в течение 4 ч.

9.1 Полученную картину распределения белковых полос анализируемой пробы сравнивают с картиной распределения белковых полос референс-образца.

9.2 Строят графическую зависимость значений изоэлектрических точек стандартных белков от расстояния каждой белковой полосы до катода (см. приложение А.2).

9.3 Измеряют расстояние от катода до локализации белковых полос исследуемого образца и референс-образца и с помощью калибровочного графика, построенного по 9.2, находят соответствующие значения изоэлектрических точек белков.

Графическое построение и определение изоэлектрических точек может осуществляться с помощью компьютерной программы после переноса изображения распределения белковых полос с полиакриламидного геля на монитор компьютера с использованием систем видеодокументирования.

9.4 Совпадение картин распределения белковых полос и совпадение значений изоэлектрических точек маркерных белков анализируемого и референс-образцов свидетельствует об их идентичности и подтверждает правильность наименования анализируемого образца. Пример результата анализа и его компьютерной обработки для разных видов исследуемых объектов приведен в приложении А.

9.5 Для подтверждения результатов идентификации проводят параллельное разделение белковых полос как из одной пробы, так и из разных проб, полученных из двух-трех образцов анализируемого объекта.

9.6 Результаты анализа оформляют в виде протокола. Образцы протоколов приведены в приложении Б.

10.1 При выполнении всех работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007.

10.2 Помещение, в котором проводятся работы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.

10.3 При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.019. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

А.1 Пример фотографии распределения белковых полос на экране монитора компьютера приведен на рисунке А.1.

Примечание - На фотографии представлены следующие линии:

- 1 и 2 - анализируемый образец филе форели N 1;

- 3 и 4 - анализируемый образец филе форели N 2;

- 5 - референс-образец форели;

- 6 - стандартный набор белков.

А.2 График, полученный в результате разделения стандартных образцов, обработанный с помощью компьютерной программы, приведен на рисунке А.2.

А.3 Пример компьютерной обработки данных, полученных в результате анализа, приведен в таблице А.1.

А.4 Обобщение результатов анализа для определения вида анализируемого объекта по рисункам А.1, А.2 и таблице А.1.

А.4.1 В результате изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле выделенных белков светлой мышечной ткани двух исследованных образцов от разных производителей, имеющих одно торговое наименование, и референс-образца получены отличающиеся друг от друга картины распределения белковых полос.

А.4.2 У анализируемого образца N 1 локализация маркерных белков не совпадает с основными белковыми полосами референс-образца. Таким образом, можно сделать вывод, что образец N 1 не соответствует своему наименованию.

А.4.3 У анализируемого образца N 2 картина распределения маркерных белков и изоэлектрических точек полностью совпадают с локализацией основных белков референс-образца и их значениями pl. Наименование этого образца соответствует наименованию на этикетке.

МП

Заключение распространяется на образец, представленный на испытания.