Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности" (ФГБНУ "ВНИМИ")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 12 ноября 2015 г. N 82-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2015 г. N 2085-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33526-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2016 г.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1. Область применения

Настоящий стандарт распространяется на молоко и продукты переработки молока (молоко (сырое, питьевое), сливки (сырые, питьевые), молочные продукты, молокосодержащие продукты, побочные продукты переработки молока, продукцию детского питания на молочной основе, сыр и сырные продукты, масло из коровьего молока и масляную пасту, консервы молочные, мороженое и смеси для мороженого и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии по определению остаточного содержания антибиотиков: левомицетина (хлорамфеникола), пенициллиновой группы, стрептомицина, тетрациклиновой группы.

Диапазон измерений массовых долей антибиотиков для левомицетина (хлорамфеникола) от 0,0001 млн^-1 (мг/кг) до 1,0 млн^-1 (мг/кг), для антибиотиков пенициллиновой и тетрациклиновой групп от 0,001 млн^-1 (мг/кг) до 1,0 млн^-1 (мг/кг), для стрептомицина от 0,005 млн^-1 (мг/кг) до 1,0 млн^-1 (мг/кг).

2. Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ИСО 5725-1-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения <1>

--------------------------------

<1> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002.

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике <2>

--------------------------------

<2> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты <3>

--------------------------------

<3> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009.

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 245-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия

ГОСТ 908-2004 Кислота лимонная моногидрат пищевая. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 5848-73 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия

ГОСТ 6552-80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 10652-73 Реактивы. Соль динатриевая этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, 2-водная (трилон Б). Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809.1-2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты

ГОСТ 26809.2-2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов на территории государства по соответствующему указателю стандартов, составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3. Сущность метода

Метод основан на экстракции антибиотиков из пробы продукта, очистке экстракта и определении антибиотиков в экстракте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием.

4. Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы

Хроматограф для проведения ВЭЖХ, включающий следующие элементы:

- колонка хроматографическая обращенно-фазная (250·4,6) мм, заполненная силикагелем с диаметром частиц сорбента 3 мкм;

- детектор спектрофотометрический или диодно-матричный с длиной волны детектирования 265 нм и 280 нм с погрешностью задания длины волны +/- 1 нм;

- петлевое устройство для ввода пробы с рабочим объемом петли 0,020 см³;

- насос высокого давления;

- регистрирующее устройство, позволяющее проводить измерения площади (или высоты) пика с погрешностью +/- 1%;

- программное обеспечение для статистической обработки полученных результатов измерений.

Устройство вакуумное для твердофазной экстракции.

Картридж для твердофазной экстракции объемом не более 6 см³, заполненный обращенно-фазным сорбентом с диаметром частиц не более 50 мкм.

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 или весы по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт, с пределом допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,5 мг и +/- 1,0 мг.

Анализатор потенциометрический (pH-метр) с диапазоном измерения 1 - 14 ед. pH, с пределом допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,01 ед. pH.

Центрифуга лабораторная с охлаждением, обеспечивающая скорость вращения не менее 15000 об/мин и диапазон температур охлаждения от 4 °C до 20 °C, с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см³ и микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 см³.

Модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и максимальной температурой термостатирования 40 °C.

Баня водяная термостатируемая.

Баня ультразвуковая с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм³.

Гомогенизатор роторный с четырехлопастным ножом, с угловой скоростью вращения ножей (1000 - 10000) мин^-1, включающий емкость вместимостью 1,0 дм³.

Встряхиватель лабораторный (вортекс) вибрационный для пробирок орбитального типа движения с амплитудой вращения гнезда 3 мм и скоростью вращения гнезда (150 - 2500) мин^-1.

Дозаторы механические переменного объема (0,1 - 3 мм³, 0,5 - 10 мм³, 20 - 200) мм³, 100 - 1000 мм³, 1 - 5 см³) с наконечниками.

Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 1-1-1-5, 1-1-1-10 по ГОСТ 29227.

Пробирки мерные стеклянные П-1-10-0,1 ХС по ГОСТ 1770.

Цилиндр 1-25-1, 1-100-1, 1-250-2 по ГОСТ 1770.

Виалы (флаконы полипропиленовые) вместимостью 15 см³ и 50 см³ с герметично закрывающимися пластмассовыми крышками.

Колба Кн-1-250-24/29, Кн-1-500-24/29 ТС по ГОСТ 25336.

Стакан В-1-100, В-1-500, В-1-1000 ТС по ГОСТ 25336.

Воронка В-56-80 ХС по ГОСТ 25336.

Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Фильтр нейлоновый с размером пор 0,45 мкм.

Ацетон по ГОСТ 2603, ч.д.а.

Ацетонитрил, ч.д.а.

Бензилпенициллин, массовой долей основного вещества не менее 99%.

Демеклоциклин, массовой долей основного вещества не менее 90%.

Доксициклин, массовой долей основного вещества не менее 90%.

Кислота лимонная моногидрат пищевая по ГОСТ 908.

Кислота муравьиная по ГОСТ 5848, ч.д.а.

Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552, х.ч.

Метанол для хроматографии (метиловый спирт), х.ч.

Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный по ГОСТ 245, ч.д.а.

Окситетрациклина гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90%.

Соль динатриевая этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б) по ГОСТ 10652, х.ч.

Стрептомицина сульфат, массовой долей основного вещества не менее 96%.

Тетрациклина гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90%.

Хлорамфеникол (левомицетин), массовой долей основного вещества не менее 99%.

Хлортетрациклин гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90%.

Феноксиметилпенициллин, массовой долей основного вещества не менее 99%.

Вода для лабораторного анализа деионизированная, с удельным сопротивлением 28 Ом, степень чистоты 2 по ISO 3696.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерения, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

5. Отбор проб

Отбор проб - по ГОСТ 26809.1, ГОСТ 26809.2, а также другим нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.

Если определение не может быть проведено сразу после отбора проб, их хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более 48 ч.

6. Подготовка к проведению измерений

6.1 Приготовление растворов

6.1.1 Приготовление раствора лимонной кислоты молярной концентрации c(C₆H₈O₇·H₂O) = 0,1 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают (21,000 +/- 0,001) г лимонной кислоты, растворяют в небольшом количестве деионизированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки.

Раствор хранят при температуре (20 +/- 2) °C не более 1 мес.

6.1.2 Приготовление раствора натрия фосфорнокислого молярной концентрации c(NaH₂PO₄·2H₂O) = 0,2 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят (35,600 +/- 0,001) г натрия фосфорнокислого, растворяют в небольшом количестве деионизированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки.

Раствор хранят при температуре (20 +/- 2) °C не более 1 мес.

6.1.3 Приготовление буферного раствора

В конической колбе вместимостью 250 см³ смешивают 60 см³ раствора лимонной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм³ (6.1.1) и 40 см³ раствора натрия фосфорнокислого молярной концентрации 0,2 моль/дм³ (6.1.2), добавляют (37,200 +/- 0,001) г трилона Б, аккуратно перемешивают и измеряют значение pH полученного раствора. Значение pH должно составлять 4,0. При необходимости значение pH доводят до 4,0 ед. pH ортофосфорной кислотой.

Раствор хранят при температуре (20 +/- 2) °C не более 1 мес.

6.1.4 Приготовление растворов элюентов мобильной фазы А и Б

6.1.4.1 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 200 см³ деионизированной воды, добавляют 5 см³ муравьиной кислоты и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки, фильтруют через нейлоновый фильтр.

Раствор хранят при температуре (20 +/- 2) °C не более 1 мес.

6.1.4.2 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы Б в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 200 см³ метанола, добавляют 5 см³ муравьиной кислоты и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят метанолом до метки, фильтруют через нейлоновый фильтр.

Раствор хранят при температуре (20 +/- 2) °C не более 1 мес.

6.1.5 Приготовление 50%-ного раствора метанола

В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают 25,0 см³ метанола, добавляют небольшое количество деионизированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки. Колбу помещают на ультразвуковую баню на 5 мин.

Срок хранения раствора в темной посуде при температуре (4 +/- 2) °C - не более 1 мес.

6.1.6 Приготовление градуировочных растворов

6.1.6.1 Приготовление основных градуировочных растворов

6.1.6.1.1 В мерную пробирку вместимостью 10 см³ помещают по 10 мг доксициклина, окситетрациклина гидрохлорида, тетрациклина гидрохлорида и хлортетрациклина гидрохлорида, взвешенных с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5 см³ метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.2 В мерную пробирку вместимостью 10 см³ помещают 10 мг стрептомицина сульфата, взвешенного с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5 см³ метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.3 В мерную пробирку вместимостью 10 см³ помещают 10 мг хлорамфеникола (левомицетина), взвешенного с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5 см³ метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.4 В мерную пробирку вместимостью 10 см³ помещают по 10 мг феноксиметилпенициллина, бензилпенициллина, взвешенных с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5 см³ метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.5 Массовая концентрация каждого антибиотика в растворах по 6.1.6.1.1 - 6.1.6.1.4 составляет 1 мг/см³ (или 1000 мг/дм³).

Уточненное значение концентрации антибиотика рассчитывается с учетом содержания основного вещества.

6.1.6.1.6 Раствор антибиотика массовой концентрации 0,1 мг/см³ (или 100 мг/дм³) готовят из раствора антибиотика массовой концентрации 1 мг/см³ (6.1.6.1.5) путем его разведения метанолом в 10 раз.

Растворы хранят при температуре минус (20 +/- 2) °C не более 3 мес.

Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 20 мин, но не более 2 ч.

6.1.6.2 Приготовление градуировочных образцов

Для построения градуировочного графика готовят серию градуировочных образцов в количестве не менее пяти с массовыми концентрациями антибиотиков в диапазоне от 0,001 мг/дм³ до 1 мг/дм³ (для левомицетина в диапазоне от 0,00015 мг/дм³ до 0,1 мг/дм³) путем разбавления метанолом основных градуировочных растворов антибиотиков, приготовленных по 6.1.6.1.

6.1.6.3 Приготовление раствора внутреннего стандарта демеклоциклина

В мерную пробирку вместимостью 10 см³ помещают 10 мг демеклоциклина, взвешенного с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5 см³ метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

Массовая концентрация раствора внутреннего стандарта демеклоциклина в растворе составляет 1 мг/см³ (уточненное значение концентрации внутреннего стандарта рассчитывается с учетом содержания основного вещества).

Путем нескольких разбавлений доводят массовую концентрацию раствора внутреннего стандарта демеклоциклина до значения 1 мкг/см³. Раствор с данной концентрацией используют для внесения в исследуемые образцы.

Раствор хранят при температуре минус (20 +/- 2) °C не более 3 мес.

Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 20 мин.

6.2 Подготовка хроматографической системы

6.2.1 Включают хроматограф. Подготовку хроматографа к работе осуществляют в соответствии с Руководством по эксплуатации прибора.

6.2.2 Устанавливают следующие условия хроматографирования:

- скорость потока элюента - 0,1 см³/мин;

- объем вводимой пробы - 20 мм³;

- температура хроматографирования - (30 +/- 1) °C;

- длина волны детектирования 280 нм.

Разделение проводят в режиме градиентного элюирования: с 0% до 55% мобильной фазы Б (6.1.4.2) за 25 мин.

6.2.3 Перед каждым измерением для оценки работы хроматографа проводят контрольное измерение, вводя в хроматограф образец с известным значением содержания антибиотика. В качестве такого образца может служить раствор антибиотика, приготовленный из реактива антибиотика с известным содержанием антибиотика.

6.3 Построение градуировочной характеристики

6.3.1 Для построения градуировочной зависимости анализируют серию градуировочных образцов, приготовленных по 6.1.6.2, в условиях, описанных в 6.2 и 7.

6.3.2 Используя программное обеспечение, прилагаемое к хроматографу, строят график зависимости массовой концентрации антибиотика от отношения площади хроматографического пика антибиотика к площади пика внутреннего стандарта.

Градуировочная характеристика считается приемлемой, если рассчитанное значение квадрата коэффициента корреляции для градуировочной характеристики каждого антибиотика составит не менее 0,98.

6.3.3 Градуировку проводят не реже одного раза в месяц, а также при изменении условий хроматографического анализа, при смене колонки, при замене реактивов или несоответствии результатов метрологическим требованиям.

6.4 Подготовка проб продуктов

6.4.1 Пробы молока и жидкой молочной продукции перемешивают путем перевертывания емкости с пробами не менее трех раз.

Пробы продуктов освобождают от упаковки, нагревают до температуры (20 +/- 2) °C, аккуратно перемешивают и сразу же проводят измерение.

6.4.2 Пробы продуктов, содержащие ароматизаторы, пищевкусовые добавки (кофе, какао, фруктово-ягодный или овощной наполнитель и т.д.), образующие с продуктом однородную структуру, а также неотделяемые пищевкусовые компоненты (например, кокосовую стружку), полностью освобождают от упаковки (при наличии), помещают в лабораторный стакан вместимостью 500 - 1000 см³ и нагревают на водяной бане до температуры (32 +/- 2) °C, после чего полностью переносят в стакан гомогенизатора и гомогенизируют в течение 1 - 3 мин при частоте вращения ножей от 2000 об/мин до 5000 об/мин до получения однородной массы. Затем пробу переносят в колбу вместимостью 500 см³ с притертой пробкой и охлаждают до температуры (20 +/- 2) °C. Пробу для анализа отбирают сразу же после гомогенизации во избежание ее расслоения.

6.4.3 Пробы творога, творожных продуктов и творожных полуфабрикатов нагревают до температуры (20 +/- 2) °C, растирают в фарфоровой ступке до получения однородной консистенции и переносят в колбу вместимостью 500 см³ с притертой пробкой.

6.4.4 Пробы сухих молочных продуктов растирают в ступке, тщательно перемешивая.

6.4.5 Пробы мороженого освобождают от глазури и вафель, оставляют при комнатной температуре для отепления. Затем отделяют фрукты, орехи, изюм и другие отделяемые компоненты. При подготовке мороженого с наполнителями, обладающими текучестью (мягкая карамель, сироп, крем-брюле и т.д.), полностью растаявшее мороженое переносят в стакан гомогенизатора вместимостью от 500 см³ до 1000 см³ и гомогенизируют в течение 1 - 3 мин при частоте вращения ножей от 1000 об/мин до 5000 об/мин до получения однородной массы. Затем пробу переносят в колбу вместимостью 500 см³ с притертой пробкой и охлаждают до температуры (20 +/- 2) °C. Пробу для анализа отбирают сразу же после гомогенизации во избежание ее расслоения.

6.4.6 Пробу сыра и сырного продукта измельчают на металлической терке с мелкой перфорацией и аккуратно перемешивают в ступке.

6.4.7 Пробу масла, масляной пасты помещают в стакан вместимостью 100 см³, расплавляют на водяной бане при температуре (60 +/- 2) °C и перемешивают до получения однородной эмульсии.

6.4.8 Подготовка проб продуктов для хроматографирования

6.4.8.1 В стакан вместимостью 100 см³ помещают (5,000 +/- 0,001) г продукта, подготовленного по 6.4.2 - 6.4.6. Добавляют 20 см³ раствора элюента мобильной фазы А (6.1.4.1) и аккуратно перемешивают. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, ополаскивая стакан раствором элюента мобильной фазы А (6.1.4.1). Объем раствора доводят раствором элюента мобильной фазы А (6.1.4.1) до метки.

Затем колбы с раствором помещают в ультразвуковую баню на 15 мин, охлаждают до температуры (20 +/- 2) °C. Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр. В случае получения непрозрачного раствора допускается его центрифугирование при скорости вращения 15000 об/мин в течение 5 мин.

6.4.8.2 В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают (5,000 +/- 0,001) г масла, пасты масляной, подготовленных по 6.4.7, и добавляют 35 см³ раствора элюента мобильной фазы А (6.1.4.1). Колбу помещают в ультразвуковую баню на 15 мин, охлаждают до температуры (20 +/- 2) °C. Объем раствора доводят раствором элюента мобильной фазы А (6.1.4.1) до метки. Полученную смесь центрифугируют при скорости вращения 15000 об/мин в течение 5 мин. Для анализа используем водную фракцию.

6.5 Подготовка проб для определения антибиотиков тетрациклиновой группы

В полипропиленовый флакон (виалу) вместимостью 15 см³ помещают (1,000 +/- 0,001) г пробы продукта, подготовленной по 6.4.1, или 10,0 см³ пробы продукта, подготовленной по 6.4.8, добавляют 0,1 см³ раствора внутреннего стандарта (6.1.6.3). Затем добавляют 3 см³ ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин. Оставляют на 15 мин в горизонтальном положении. Далее виалу с образцом помещают в центрифугу, предварительно охлажденную до температуры 4 °C, и центрифугируют при скорости вращения 4000 об/мин в течение 20 мин.

Полученную водную фракцию переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см³ и упаривают до 1 см³ на нагревательном модуле в токе азота под вакуумом при температуре (40 +/- 1) °C. К полученному остатку добавляют 3 - 5 см³ буферного раствора (6.1.3), аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят буферным раствором (6.1.3) до метки и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин.

6.6 Подготовка проб для определения левомицетина, стрептомицина и антибиотиков пенициллиновой группы

В полипропиленовый флакон (виалу) вместимостью 15 см³ помещают (1,000 +/- 0,001) г пробы продукта, подготовленной по 6.4.1, или 10,0 см³ пробы продукта, подготовленной по 6.4.8. Затем добавляют 3 см³ ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин. Оставляют на 15 мин в горизонтальном положении. Далее виалу с образцом помещают в центрифугу, предварительно охлажденную до температуры 4 °C, и центрифугируют при скорости вращения 4000 об/мин в течение 20 мин.

Полученную водную фракцию переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см³ и упаривают до 1 см³ на нагревательном модуле в токе азота под вакуумом при температуре (40 +/- 1) °C. К полученному остатку добавляют 3 - 5 см³ буферного раствора (6.1.3), аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят буферным раствором (6.1.3) до метки и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин.

6.7 Проведение твердофазной экстракции

Для проведения твердофазной экстракции картридж для ТФЭ предварительно кондиционируют 6 см³ 50%-ного раствора метанола и уравновешивают 6 см³ деионизированной воды. Затем вносят пробу продукта, подготовленную по 6.5 или 6.6, и вновь промывают 6 см³ деионизированной воды. Антибиотики элюируют с сорбента при помощи 6 см³ раствора элюента мобильной фазы Б (6.1.4.2). Полученный элюат упаривают на нагревательном модуле досуха в токе азота под вакуумом при температуре (40 +/- 1) °C, затем растворяют раствором элюента мобильной фазы Б (6.1.4.2) до 0,5 см³, после чего используют для хроматографирования.

7. Условия проведения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:

8. Проведение измерений

8.1 Хроматографирование градуировочных растворов и анализируемой пробы продукта проводят в идентичных условиях.

8.2 Проводят два последовательных измерения. Подготовленную по 6.7 пробу вводят в колонку хроматографа и проводят хроматографический анализ в условиях, указанных в 6.2.2.

Если содержание антибиотиков в анализируемой пробе превышает значение максимального градуировочного уровня, то анализируемую пробу разводят в 10 или более раз мобильной фазой А и проводят повторные измерения.

9. Обработка результатов измерений

9.1 Обработка результатов измерений содержания антибиотиков тетрациклиновой группы, полученных с применением внутреннего стандарта

Определение содержания антибиотиков тетрациклиновой группы выполняют с помощью программного обеспечения, прилагаемого к хроматографу. С помощью программы обработки спектров вычисляют отношение площади пика определяемого антибиотика к площади пика внутреннего стандарта. Затем, используя программу обработки данных, рассчитывают содержание соответствующего антибиотика в подготовленной пробе.

9.2 Обработка результатов измерений содержания антибиотиков пенициллиновой группы, левомицетина (хлорамфеникола) и стрептомицина

Определение содержания антибиотиков выполняют с помощью программного обеспечения, прилагаемого к хроматографу. Используя градуировочный график, рассчитывают значение массовой концентрации соответствующего антибиотика в подготовленной пробе.

9.3 Массу пробы продукта, взятую для разведения, m, г, вычисляют по формуле

где m₁ - масса пробы продукта, подготовленная по 6.4.2 - 6.4.7, взятая для анализа и отобранная по 6.4.9, г;

V₂ - объем пробы, подготовленный по 6.4.8 и взятый для анализа (6.5 - 6.6), см³, (V₂ = 10 см³);

V₁ - общий объем раствора, полученный при разведении пробы продукта согласно 6.4.8, см³, (V₁ = 50 см³).

9.4 Массовую долю антибиотика в продукте X, млн^-1 (мг/кг), вычисляют по формуле

где C - массовая концентрация антибиотика, найденная по градуировочному графику, мг/дм³;

V₃ - объем элюата после выпаривания по 6.7, см³;

m - масса пробы продукта, подготовленная по 6.4.1 и отобранная для анализа (6.5 - 6.6) или определенная по формуле (1), г.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух последовательных измерений, выполненных в условиях повторяемости (ГОСТ ИСО 5725-1, пункт 3.14), если соблюдается условие приемлемости по 10.1.

9.5 Контроль точности результатов измерений

Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих метода определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока при P = 0,95 приведены в таблице 1.

10. Проверка приемлемости результатов измерений

10.1 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости

Проверку приемлемости результатов определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока, полученных в условиях повторяемости (два последовательных определения, n = 2), проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.2.2).

Результаты измерений считаются приемлемыми при условии:

где X₁, X₂ - значения результатов двух последовательных измерений содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока, полученных в условиях повторяемости, млн^-1 (мг/кг);

X_ср - среднеарифметическое значение двух последовательных измерений содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока, млн^-1 (мг/кг);

r_отн - предел повторяемости (сходимости), значение которого приведено в таблице 1, %.

Если данное условие не выполняется, то проводят повторные измерения и проверку приемлемости результатов измерений в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.2.2).

10.2 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Проверку приемлемости результатов определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока, полученных в условиях воспроизводимости (в двух лабораториях, m = 2), проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6 (подпункт 5.3.2.1).

Результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости, считаются приемлемыми при условии:

где X'₁, X'₂ - значения двух результатов определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока, полученных в двух лабораториях в условиях воспроизводимости, млн^-1 (мг/кг);

R_отн - предел воспроизводимости, значение которого приведено в таблице 1, %;

X_ср - среднеарифметическое значение результатов определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока, полученных в условиях воспроизводимости, млн^-1 (мг/кг).

Если данное условие не выполняется, то выполняют процедуры в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.3.3).

11. Оформление результатов

Результат определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока представляют в документах, предусматривающих его использование в виде:

где X_ср - среднеарифметическое значение результатов двух последовательных определений, млн^-1 (мг/кг);

- границы относительной погрешности измерений, % (таблица 1).

12. Требования безопасности

При выполнении работ необходимо соблюдать следующие требования:

- помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005;

- требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007;

- требования техники безопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009.

13. Требования к оператору

Выполнение измерений может проводить специалист, имеющий специальное образование, освоивший метод и уложившийся в норматив проверки приемлемости результатов измерений при выполнении процедуры проверки приемлемости результатов измерений.