1. Разработан Институтом физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН и Институтом молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 447 "Биологическая безопасность пищевых продуктов, кормов и товаров народного потребления и методы ее контроля".

2. Утвержден и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 29 декабря 2003 г. N 403-ст.

3. Введен впервые.

Настоящий стандарт распространяется на пищевое сырье (в том числе посевной и посадочный материал), пищевые продукты, цветы (далее - продукт) и устанавливает метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с использованием биологического микрочипа.

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88. Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75. Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 1770-74. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3164-78. Масло вазелиновое медицинское. Технические условия

ГОСТ 4233-77. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9284-75. Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9805-84. Спирт изопропиловый. Технические условия

ГОСТ 12026-76. Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 12738-77. Колбы стеклянные с градуированной горловиной. Технические условия

ГОСТ 13646-68. Термометры стеклянные ртутные для точных измерений. Технические условия

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия

(абзац введен Изменением N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

ГОСТ 21400-75. Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 24104-2001. Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26678-85. Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81). Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ Р 51652-2000. Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия.

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1. Биологическая безопасность: в соответствии с Приложением А.

3.2. Генетически модифицированные источники: сырье и пищевые продукты (компоненты), используемые человеком в натуральном или переработанном виде, полученные из генетически модифицированных организмов или содержащие их в своем составе.

3.3. Генетически модифицированный организм: организм, генетический материал которого изменен с применением методов генной инженерии.

3.4. Генная инженерия: совокупность приемов, методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных нуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы.

3.5. Биологический микрочип: микроматрица с ячейками, в которых иммобилизован набор олигонуклеотидов.

3.6. Праймер: последовательность однотяжевой ДНК длиной до 25 нуклеотидов, применяемая для проведения асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции.

3.7. Асимметричная мультиплексная полимеразная цепная реакция: полимеразная цепная реакция, где в одной пробирке с участием нескольких пар праймеров одновременно амплифицируются разные последовательности анализируемой ДНК, причем количество одного из праймеров каждой пары в несколько раз превышает количество другого праймера.

4.1. Универсальный аппаратно-программный комплекс (УАПК) для анализа биологических микрочипов с компьютерной программой для анализа полученных результатов [1].

(п. 4.1 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

4.2. Хлороформ по ГОСТ 20015, х.ч.

(п. 4.2 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

4.3. Амплификатор ДНК типа "Терцик" под микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,2; 0,5 куб. см со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5 °С/с [2].

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

4.4. Термостат суховоздушный типа ТВ3-25 с рабочей температурой 37 °С, рабочий диапазон от 20 °С до 60 °С, точность поддержания температуры +/- 1 °С [3].

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

4.11. pH-метр с набором электродов, с погрешностью измерений +/- 0,1 pH.

4.12. Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5 - 10,0 куб. мм (шаг - 0,1 куб. мм, точность - +/- 2,5% - 10,0%, воспроизводимость - 3% - 7%); 5,0 - 50,0 куб. мм (шаг - 0,5 куб. мм, точность - +/- 2,0% - 5,0%, воспроизводимость - 2,5% - 5%); 20,0 - 200,0 куб. мм (шаг - 1,0 куб. мм, точность - +/- 1,5% - 2,0%, воспроизводимость - 2% - 3%); 100 - 1000 куб. мм (шаг - 5 куб. мм, точность - +/- 1,0% - 1,5%, воспроизводимость - 1% - 2%).

4.13. Штативы под микроцентрифужные пробирки типа RP-30 и RP-80 на 30 и 80 шт. [7].

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

4.14. Наконечники с фильтром для микродозаторов (микропипеток) с переменным объемом дозирования жидкостей до 10; 20; 200; 1000 куб. мм [8].

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

4.15. Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5 и 1,5 куб. см стерильные.

4.16. Пестик или палочка стеклянные по ГОСТ 21400 для микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 куб. см.

4.17. Цилиндры стеклянные мерные лабораторные по ГОСТ 1770 на 25, 100, 250 и 1000 куб. см.

4.18. Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические по ГОСТ 25336 вместимостью 50 - 1000 куб. см.

4.19. Пипетки стеклянные градуированные по ГОСТ 29227.

4.20. Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

4.21. Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.

4.22. Кислота соляная концентрированная по ГОСТ 3118, х.ч.

4.23. Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.

4.24. Этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль дигидрат (ЭДТА) [9].

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

4.25. Трис(оксиметил)аминометан [10].

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

4.26. Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652, х.ч.

4.27. Спирт изопропиловый по ГОСТ 9805, х.ч.

4.28. Цетилтриметиламмоний бромид [11].

(п. 4.28 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

4.29. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

4.30. Вода особо чистая стерильная, не содержащая ДНК, РНК и дезоксирибонуклеаз.

4.31. Фермент термостабильный HotTaq-полимераза для ПЦР с "горячим стартом", оптимум активности при температуре 70 °С - 72 °С [12].

(п. 4.31 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

4.33. Буфер гибридизационный [13].

(п. 4.33 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

4.34. Баня водяная [18].

(п. 4.34 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

4.35. Раствор водный дезоксирибонуклеозидтрифосфатов: дАТФ, дГТФ, дУТФ, дЦТФ с молярной концентрацией по 2 мМ каждого [14].

(п. 4.35 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

4.36. Раствор флуоресцентного субстрата ФС [15].

(п. 4.36 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

4.39. Раствор водный праймеров "ПР-1" для амплификации соответствующих участков генома, включающий следующие пары праймеров [19]:

- праймеры для амплификации фрагмента гена RBCL, кодирующего большую субъединицу рибулозы-1,5-бифосфат карбоксилазы/оксигеназы (Асс. N Z95552, поз. 160 - 720);

- праймеры для амплификации фрагмента гена лектина LE1 (Асс. N K00821M30884, поз. 1080 - 1720);

- праймеры для амплификации фрагмента гена IVR1, кодирующего бета-фруктозидазу (Асс. N U16123, поз. 300 - 1090);

- праймеры для амплификации фрагмента 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты (Асс. N FM177585, поз. 3560 - 3870);

- праймеры для амплификации фрагмента 35S-терминатора вируса мозаики цветной капусты (Асс. N FM177585, поз. 1260 - 1590);

- праймеры для амплификации фрагмента 35S-промотора каулимовируса мозаики норичника (FMV, Асс. N X06166, поз. 6260 - 6630);

- праймеры для амплификации фрагмента терминатора гена белка теплового шока пшеницы (Асс. N X58279, поз. 10 - 210);

- праймеры для амплификации фрагмента маркерного гена BAR, определяющего устойчивость к фосфинотрицину (Асс. N AY310901, поз. 380 - 920);

- праймеры для амплификации фрагмента терминатора nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens (Асс. N FM177585, поз. 10 - 370).

(п. 4.39 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

4.40. Раствор водный праймеров "ПР-2" для амплификации соответствующих участков генома, включающий следующие пары праймеров [20]:

- праймеры для амплификации фрагмента гена фосфорилазы УДФ-глюкозы (UDP-GP) (Асс. N D00667, поз. 50 - 310);

- праймеры для амплификации фрагмента гена фосфат-синтазы риса (SPS) (Асс. N U33175, поз. 5910 - 6250);

- праймеры для амплификации фрагмента маркерного гена nptll из транспозона Tn5 бактериального происхождения (Асс. N EU886197, поз. 9792 - 10145);

- праймеры для амплификации фрагмента терминатора ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens (Асс. N AJ311872, поз. 5050 - 5240);

- праймеры для амплификации фрагмента терминатора гена RBCS гороха (Асс. N FM177582.1, поз. 5782 - 5920);

- праймеры для амплификации фрагмента промотора гена актина риса ACT1 (Асс. N S44221, поз. 12 - 380);

- праймеры для амплификации фрагмента маркерного гена gus из бактерии Escherichia coli (Асс. N EU503042, поз. 2770 - 3140).

(п. 4.40 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

4.41. Биологический микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидами, назначение которых приведено в таблице 1 (название олигонуклеотида соответствует изображенному на рисунке 1) [21]:

Обозначение ячеек приведено в соответствии с назначением иммобилизованного в ней зонда, указанного в таблице 1.

Биологический микрочип представляет собой пластиковую подложку, выполненную в формате предметного стекла по ГОСТ 9284, на поверхности которой в определенном порядке расположена 31 ячейка полиакриламидного геля в форме полусферы диаметром 100 мкм (обозначены кружками на рисунке 1). 22 из них содержат индивидуальный ковалентно иммобилизованный олигонуклеотид (перечень и назначение олигонуклеотидов приведены в таблице 1). Пять ячеек с индексом "О" не содержат перечисленных индивидуальных ковалентно иммобилизованных олигонуклеотидов и выполняют роль отрицательного контроля гибридизации. Четыре ячейки с индексом "М" содержат ковалентно связанный флуоресцентный краситель и предназначены для автоматического вычисления интенсивности флуоресценции ячеек биологического микрочипа после гибридизации. Поверхность биологического микрочипа должна быть закрыта специальной составной крышкой с отверстиями, которая вместе с подложкой образует гибридизационную камеру, предназначенную для проведения реакции гибридизации анализируемых ПЦР-продуктов с иммобилизованными на биологическом микрочипе олигонуклеотидами и исключающую возможность испарения реакционной смеси в процессе гибридизации. Диагностическая специфичность при идентификации растительной ДНК сои, картофеля, кукурузы, риса составляет не менее 95%.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше.

(п. 4.41 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

Отбор проб проводят по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевого сырья (в том числе посевного и посадочного материала), пищевых продуктов, цветов.

6.1. Приготовление растворов

6.1.1. Приготовление раствора NaOH концентрации 40 г/куб. дм

В стеклянную плоскодонную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 100 куб. см помещают 4,0 г сухой гидроокиси натрия по ГОСТ 4328 и растворяют в 100 куб. см особо чистой стерильной воды по 4.30. После охлаждения раствора до комнатной температуры его переливают в специальную щелочеустойчивую пластиковую плотно закрывающуюся емкость. Срок хранения при комнатной температуре - не более одного года.

6.1.2. Приготовление раствора ЭДТА концентрации 74,4 г/куб. дм

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

В стеклянную плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 7,44 г ЭДТА по 4.24, растворяют в 80 куб. см особо чистой стерильной воды при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке [6]. Затем раствором NaOH по 6.1.1 доводят pH раствора до 8,0. Полученный раствор переливают в мерную колбу по ГОСТ 12738 вместимостью 100 куб. см и особо чистой стерильной водой доводят объем этого раствора до метки. Срок хранения в холодильнике по ГОСТ 26678 при температуре 4 °С - 5 °С - не более 6 мес.

(в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

6.1.3. Приготовление 70%-ного раствора этилового спирта

В мерную колбу вместимостью 200 куб. см по ГОСТ 12738 вносят 140 куб. см 96%-ного этилового спирта высокой степени очистки по ГОСТ Р 51652, добавляют 52 куб. см особо чистой стерильной воды и перемешивают. Срок хранения при температуре 4 °С - 5 °С - не более 6 мес.

6.1.4. Приготовление раствора Трис-HCl массовой концентрации 242,2 г/куб. дм

В колбу вместимостью 100 куб. см помещают 24,22 г трис(оксиметил)аминометана по 4.25 [10] и растворяют приблизительно в 80 куб. см особо чистой стерильной воды. Концентрированной соляной кислотой по ГОСТ 3118 доводят pH раствора до 7,5 ед. pH, а объем - до 100 куб. см особо чистой стерильной водой.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 6 мес.

(п. 6.1.4 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

6.1.5. Приготовление раствора NaCl массовой концентрации 146,2 г/куб. дм

В плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 14,62 г хлористого натрия по ГОСТ 4233, растворяют в 70 - 80 куб. см особо чистой стерильной воды, затем полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и особо чистой стерильной водой доводят объем раствора до метки.

Срок хранения при комнатной температуре - не более одного года.

(п. 6.1.5 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

6.1.6. Приготовление ЦТАБ-буфера

В стеклянную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 2,0 г сухого цетилтриметиламмония бромида по 4.28 [11], далее добавляют 5 куб. см раствора Трис-HCl, приготовленного по 6.1.4, 56 куб. см раствора NaCl, приготовленного по 6.1.5, и 10 куб. см раствора ЭДТА, приготовленного по 6.1.2. Объем раствора доводят до 100 куб. см особо чистой стерильной водой. Перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения соли.

Срок хранения при комнатной температуре - не более одного года.

(п. 6.1.6 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

6.1.7 Приготовление ЦТАБ-раствора

В стеклянную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,5 г сухого цетилтриметиламмония бромида по 4.28 [11] и добавляют 1,6 куб. см раствора NaCl, приготовленного по 6.1.5. Объем раствора доводят до 100 куб. см особо чистой стерильной водой.

Срок хранения при температуре 4 °С - 5 °С - не более месяца, в морозильной камере по ГОСТ 26678 при температуре минус 20 °С - до одного года.

(п. 6.1.7 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

6.1.8. Приготовление разведенного раствора NaCl

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 48 куб. см раствора NaCl, приготовленного по 6.1.5, и особо чистой стерильной водой доводят объем раствора до метки. Срок хранения при комнатной температуре - не более 6 мес.

(п. 6.1.8 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

6.1.9. Раствор Taq-полимеразы по 4.31 хранят при температуре минус 20 °С не более шести месяцев. Не допускается хранение раствора Taq-полимеразы ниже температуры минус 23 °С.

(п. 6.1.9 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

6.2. Приготовление пробы для анализа (выделение ДНК)

6.2.1. Две параллельные пробы анализируемого продукта массой около 100 мг каждая помещают в две чистые стерильные микроцентрифужные пробирки по 4.15 вместимостью 1,5 куб. см, добавляют по 500 куб. мм ЦТАБ-буфера, приготовленного по 6.1.6, перемешивают на аппарате для встряхивания по 4.10 [6] в течение 2 мин. и выдерживают 15 - 20 мин. при температуре 65 °С в термостате для микропробирок.

(п. 6.2.1 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

6.2.4. Верхнюю жидкую фазу из смеси, полученной по 6.2.3, аккуратно отбирают микродозатором в чистые микроцентрифужные пробирки, не захватывая промежуточную или нижнюю фазу. В пробирки добавляют два объема ЦТАБ-раствора, приготовленного по 6.1.7, аккуратно перемешивают, переворачивая пробирки вручную, и выдерживают 60 мин. при комнатной температуре.

(п. 6.2.4 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

6.2.6. Надосадочную жидкость, полученную по 6.2.5, отбирают микродозатором и переносят в чистые микроцентрифужные пробирки, добавляют равный объем изопропилового спирта по 4.27, аккуратно перемешивают содержимое пробирок вручную и выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре.

(п. 6.2.6 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

6.2.8. Полученную надосадочную жидкость вновь тщательно удаляют, а осадок ДНК подсушивают при комнатной температуре до полного удаления этилового спирта, но не более 30 мин.

(п. 6.2.8 введен Изменением N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

6.2.9. Осадок ДНК, полученный по 6.2.8, перерастворяют в 40 - 50 куб. мм особо чистой стерильной воды. Полученный раствор ДНК используют для проведения амПЦР.

Срок хранения раствора ДНК при температуре минус 20 °С - до одного года.

(п. 6.2.9 введен Изменением N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

6.3. Подготовка асимметричной мультиплексной ПЦР

6.3.1. Приготовление реакционной смеси для амПЦР <*>

6.3.1.1. Готовят две микроцентрифужные пробирки вместимостью по 1,5 куб. см и маркируют их "М1" и "М2".

В пробирку "М1" микродозатором вносят (из расчета на каждую анализируемую пробу): 2,5 куб. мм 10х буфера реакционного для ПЦР по 4.32; 2,5 куб. мм смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов по 4.35 [14], 2 куб. мм фермента Taq-полимеразы по 4.31 [12] (концентрацией 5 Ед. акт/куб. мм) <*>, 1 куб. мм флуоресцентного субстрата ФС по 4.36 [15], а также 1 куб. мм водного раствора праймеров "ПР-1" по 4.40 [19].

--------------------------------

<*> Срок хранения Taq-полимеразы после разведения при температуре от 2 °С до 8 °С - не более 2 ч.

В пробирку "М2" микродозатором вносят (из расчета на каждую анализируемую пробу): 2,5 куб. мм 10х буфера реакционного для ПЦР по 4.32; 2,5 куб. мм смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов по 4.35 [14], 2 куб. мм фермента Taq-полимеразы по 4.31 [12] (концентрацией 5 Ед. акт/куб. мм) <*>, 1 куб. мм флуоресцентного субстрата ФС по 4.36 [15], а также 1 куб. мм водного раствора праймеров "ПР-2" по 4.41 [20].

Смесь разбавляют особо чистой стерильной водой до объема 20 куб. мм (из расчета на одну анализируемую пробу) и осторожно перемешивают в течение 3 - 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены. Общий объем реакционных смесей в микропробирках "М1" и "М2" для амПЦР готовят с учетом числа анализируемых проб и двух контрольных проб: положительный контроль (заведомо трансгенная ДНК по 4.37) и отрицательный контроль (заведомо нетрансгенная ДНК по 4.38).

(п. 6.3.1.1 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

6.3.2. Все этапы амПЦР должен проводить квалифицированный, специально обученный персонал в соответствии с требованиями [22]. Для проведения амПЦР допускается использовать только стерильную лабораторную посуду и новые стерильные микроцентрифужные пробирки. При проведении амПЦР каждую микроцентрифужную пробирку открывают только перед отбором или внесением анализируемой пробы, а по окончании манипуляции сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно несколько микроцентрифужных пробирок с анализируемыми пробами и оставлять их открытыми длительное время. Каждую анализируемую пробу отбирают микродозатором с новым стерильным наконечником с фильтром.

7.1. Проведение асимметричной мультиплексной ПЦР

7.1.4. В две другие микроцентрифужные пробирки микродозатором вносят по 5 куб. мм раствора заведомо трансгенной ДНК (положительный контроль).

(п. 7.1.4 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

7.1.5. Затем еще в две другие микроцентрифужные пробирки микродозатором вносят по 5 куб. мм раствора заведомо нетрансгенной ДНК (отрицательный контроль).

(п. 7.1.5 введен Изменением N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

7.1.6. Все микроцентрифужные пробирки со смесями, подготовленными по 7.1.3 - 7.1.5, помещают в амплификатор ДНК и проводят амПЦР по программе, указанной в таблице 2.

(п. 7.1.6 введен Изменением N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

7.2. Гибридизация на биологическом микрочипе

7.2.1. Для проведения этапа гибридизации готовят N + 2 микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,5 или 1,5 куб. см (N - количество анализируемых проб, две другие пробирки нужны для анализа положительного и отрицательного контроля).

7.2.3. Из каждой микроцентрифужной пробирки микродозатором отбирают по 34 куб. мм гибридизационной смеси (для каждого биологического микрочипа), полученной по 7.2.2. Смесь вносят через любое из двух отверстий гибридизационной камеры, после чего оба отверстия закрывают крышкой. Гибридизацию проводят в термостате по 4.4 [3] при температуре 37 °С. Минимальное время гибридизации составляет 3 ч. Допускается гибридизация в течение ночи, но не более 16 - 18 ч.

7.2.4. После окончания гибридизации крышку реакционной камеры открывают и микродозатором отбирают гибридизационную смесь из камеры микрочипа. В любое из двух отверстий камеры вносят 34 куб. мм дистиллированной воды по ГОСТ 6709, предварительно прогретой до температуры 37 °С. Воду выдерживают в реакционной камере биологического микрочипа в течение 1 минуты, затем отбирают. Процедуру повторяют, после чего составную крышку отсоединяют от подложки. Подложку последовательно промывают дистиллированной водой по ГОСТ 6709, этиловым спиртом по 4.26, дистиллированной водой по ГОСТ 6709 и высушивают при комнатной температуре.

Схема метода идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения приведена в Приложении Б.

(п. 7.2 в ред. Изменения N 2, утв. Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст)

8.1. Результаты гибридизации регистрируют с помощью универсального аппаратно-программного комплекса для анализа биочипов (УАПК) [1]. Инсталляция и эксплуатация комплекса осуществляется в соответствии с руководством по эксплуатации УАПК.

8.2. Производят запуск программного обеспечения, поставляемого вместе с комплексом (файл imageware.exe). При запуске на мониторе появляется схема биочипа с указанием отдельных ячеек и обозначением находящихся в них зондов. Названия зондов соответствуют указанным в таблице 1 и на рисунке 1.

8.3. Биологический микрочип после проведения гибридизации, промывки, удаления гибридизационной камеры, ополаскивания и высушивания помещают в держатель УАПК "лицевой" стороной (содержащей гелевые ячейки) вверх.

8.4. Нажимают пиктограмму с надписью "Пуск" в верхней части диалогового окна "Снимок". При этом происходит возбуждение флуоресценции ячеек биочипа лазерами с длиной волны 640 нм, захват флуоресцентного изображения, его обработка и выдача отчета о присутствии в исследуемом образце ДНК растительного происхождения, идентификации видоспецифичной ДНК (соя, кукуруза, картофель, рис) и наличии/отсутствии генетических элементов, используемых как детерминанты трансгенности. Применение универсального аппаратно-программного комплекса (УАПК) для анализа биологических микрочипов [1] позволяет автоматизировать все этапы регистрации и интерпретации результатов и получать заключение о наличии/отсутствии ДНК растительного происхождения в исследуемом образце, а также о наличии/отсутствии генетических детерминант трансгенности.

8.5. Анализ биологических микрочипов с прогибридизованными ПЦР-продуктами, полученными при амплификации ДНК, выделенной из различных образцов, начинают с регистрации и интерпретации гибридизационных картин положительного (заведомо трансгенной ДНК) и отрицательного контроля (заведомо нетрансгенной ДНК).

8.6. Результат анализа ДНК сои, содержащей трансгенные элементы, с использованием гибридизации на биочипе, представлен в Приложении В.

8.7. В случае, если при использовании заведомо нетрансгенной ДНК регистрируют сигнал в ячейках, содержащих олигонуклеотиды, комплементарные последовательностям фрагментов векторных конструкций и маркерных генов, это свидетельствует о получении ложноположительного результата. При этом результаты анализа остальных исследуемых образцов не учитываются. Причиной может быть загрязнение (контаминация) ГМИ реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором соляной кислоты по ГОСТ 3118 (0,1 моль/куб. дм), заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ. В случае отсутствия сигналов в ячейках, содержащих зонды, специфичные к различным генетическим детерминантам трансгенности, при использовании заведомо нетрансгенной ДНК, делают заключение об отсутствии контаминации и проводят анализ образцов ДНК согласно протоколу.

8.8. Отсутствие флуоресцентных сигналов в ячейках, содержащих олигонуклеотиды, специфичные к гену RBCL, при использовании нетрансгенной растительной ДНК свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. При этом результаты анализа остальных исследуемых образцов не учитываются. Причиной могут быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР или несоблюдение условий проведения амПЦР и/или гибридизации на биологическом микрочипе. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ. Наличие сигнала в ячейках, содержащих олигонуклеотиды, специфичные к ДНК растительного происхождения, при использовании заведомо нетрансгенной ДНК, свидетельствует об эффективно проведенной амПЦР и гибридизации на биочипе. При этом анализ образцов ДНК проводят далее согласно протоколу.

9.1. При выполнении всех работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007.

9.2. Помещение, в котором проводятся работы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.

9.3. При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.019. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

Биологическая безопасность: защищенность человека, общества и окружающей среды от негативного воздействия токсических, аллергенных, канцерогенных, мутагенных биологических веществ и соединений, содержащихся в природных или генно-инженерно-модифицированных биологических объектах и полученных из них продуктах.

А - схема биологического микрочипа для идентификации генетически модифицированного источника растительного происхождения;

Б - гибридизационная картина на биологическом микрочипе флуоресцентных продуктов амПЦР анализируемой ДНК сои, содержащей 35S-промотор, терминатор nos. Стрелками обозначены ячейки, в которых образовались совершенные гибридизационные дуплексы;

В - распределение нормированных сигналов ячеек биологического микрочипа. Жирным шрифтом выделены ячейки, в которых образовались совершенные гибридизационные дуплексы.