Разделы 1 (первый абзац), 5. Заменить слова: "пищевое сырье" на "продовольственное сырье";

дополнить абзацем:

"Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением технологии FLASH изложен в обязательном приложении Д".

Пункт 4.1. Исключить слова: "или "Био-1" [23]".

Пункт 4.2. Исключить слова: "или "Евробио-ВТО" [24]".

Пункт 6.2.1 дополнить абзацем:

"6.2.1. Дополнительно готовят отрицательную контрольную пробу. Для этого в чистую стерильную микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см3 помещают 50 мм3 особо чистой воды по 4.30 и 400 мм3 буфера экстракции по 6.1.8. Дальнейшее приготовление и хранение отрицательной контрольной пробы - в соответствии с требованиями 6.2.2 - 6.2.6 настоящего стандарта <*>".

--------------------------------

<*> Отрицательную контрольную пробу по 6.2.1 подготавливают только при применении технологии FLASH (приложение Д).

Пункт 8.1. Исключить слова: "или "Био-1" [23]".

Приложение Д изложить в новой редакции:

Д.1. Сущность метода

Метод основан на технологии FLASH, то есть проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфической гибридизацией флуоресцентномеченых зондов в процессе амплификации и последующей детекции продуктов амплификации при помощи ПЦР-детектора "Джин". Чувствительность метода - не менее 100 копий ДНК на реакционный объем.

Д.2. Определения

Д.2.1. ПЦР-детектор "Джин": специализированный флуориметр, предназначенный для регистрации результатов ПЦР при использовании комплектов реагентов, основанных на принципах флуоресцентной детекции.

Д.3. Аппаратура, материалы и реактивы - в соответствии с разделом 4 настоящего стандарта со следующими дополнениями:

Д.3.1. Компьютерная программа "Gene" для учета и интерпретации результатов, полученных при помощи ПЦР-детектора "Джин" [23].

Д.3.2. ПЦР-детектор "Джин" [24] или ПЦР-детектор "Джин-4" [25].

Д.3.3. Четыре комплекта реагентов для ПЦР-амплификации ДНК в микроцентрифужных пробирках для амплификации - "СКАН-35S", "СКАН-gus", "СКАН-nos" и "СКАН-npt" [26], каждый из которых включает:

- 50 микроцентрифужных пробирок для амплификации, запечатанных парафином, содержащих по 20 мм3 смеси, включающей ПЦР-буфер, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, праймеры, флуоресцентномеченые зонды, внутренний контрольный образец ДНК;

- 500 мм3 раствора Taq-полимеразы - одна микроцентрифужная пробирка;

- 200 мм3 буферного раствора "ПЦР-буфер" - одна микроцентрифужная пробирка;

- 1,0 см3 минерального масла - одна микроцентрифужная пробирка;

- положительная контрольная проба ДНК, 150 мм3 - одна микроцентрифужная пробирка.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных в приложении Д и разделе 4 настоящего стандарта.

Д.4. Отбор проб

Отбор проб - в соответствии с требованиями раздела 5 настоящего стандарта.

Д.5. Подготовка к проведению анализа

Д.5.1. Приготовление растворов

Приготовление растворов осуществляется в соответствии с 6.1 настоящего стандарта.

Д.5.2. Приготовление пробы для анализа (выделение ДНК)

Приготовление пробы для анализа (выделение ДНК) - в соответствии с требованиями 6.2 настоящего стандарта

Д.6. Проведение анализа

Д.6.1. Растворы ДНК, подготовленные в соответствии с Д.5 и 6.2, анализируют при помощи комплектов для амплификации ДНК: "СКАН-35S", "СКАН-gus", "СКАН-nos" и "СКАН-npt" по Д.3.3.

Д.6.2. Маркируют микроцентрифужные пробирки с запечатанной парафином смесью для амплификации по Д.3.3 в количестве, соответствующем количеству анализируемых растворов ДНК. Дополнительно маркируют:

- две микроцентрифужные пробирки для ПЦР-амплификации ДНК маркируют как "К+" (положительный контроль);

- две микроцентрифужные пробирки для ПЦР-амплификации ДНК маркируют как "К-" (отрицательный контроль);

- две микроцентрифужные пробирки для ПЦР-амплификации ДНК маркируют как "ФОН".

Д.6.3. В промаркированные микроцентрифужные пробирки по Д.6.2, за исключением пробирок, промаркированных как "ФОН", не повреждая слой парафина, микродозатором по 4.12 настоящего стандарта вносят по 10 мм3 раствора Taq-полимеразы по Д.3.3, тщательно перемешанного на аппарате для встряхивания по 4.10 настоящего стандарта. В микроцентрифужные пробирки, промаркированные как "ФОН" по Д.6.2, микродозатором вносят по 10 мм3 ПЦР-буфера по Д.3.3.

Д.6.4. Во все микроцентрифужные пробирки по Д.6.3 микродозатором вносят по 20 мм3 минерального масла по Д.3.3, плотно закрывают пробирки крышками.

Д.6.5. В микроцентрифужные пробирки по Д.6.4, за исключением пробирок, промаркированных как "ФОН", "К-" и "К+", не повреждая слой парафина, микродозатором вносят по 5,0 мм3 анализируемого раствора ДНК по 6.2 настоящего стандарта.

Д.6.6. В микроцентрифужные пробирки, промаркированные как "ФОН" и "К-" по Д.6.4, не повреждая слой парафина, микродозатором вносят по 5,0 мм3 отрицательной контрольной пробы по 6.2 настоящего стандарта.

Д.6.7. В микроцентрифужные пробирки по Д.6.4, промаркированные как "К+", не повреждая слой парафина, микродозатором вносят по 5,0 мм3 положительной контрольной пробы из состава соответствующего комплекта реагентов для амплификации ДНК по Д.3.3.

Д.6.8. Все микроцентрифужные пробирки, подготовленные по Д.6.5 - Д.6.7, плотно закрывают крышками и центрифугируют на настольной микроцентрифуге по 4.8 настоящего стандарта при частоте вращения в течение 5 - 10 с и сразу же используют для проведения анализа.

Д.6.9. Все микроцентрифужные пробирки по Д.6.8 помещают в амплификатор ДНК по 4.3 настоящего стандарта и проводят ПЦР по программе, указанной в таблице Д.1. При запуске программы указывают объем реакционной смеси, равный 35 мм3.

Д.6.10. Все определения должен проводить квалифицированный, специально обученный персонал в соответствии с требованиями [22]. При проведении анализа каждую микроцентрифужную пробирку открывают только перед отбором или внесением анализируемой пробы, а по окончании манипуляции - сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно несколько микроцентрифужных пробирок с анализируемыми пробами и оставлять их открытыми длительное время. Каждую анализируемую пробу отбирают микродозатором с новым стерильным наконечником с фильтром по 4.14 настоящего стандарта.

Д.7. Обработка результатов анализа

Д.7.1. После прохождения реакции амплификации все микроцентрифужные пробирки по Д.6.9 помещают в ПЦР-детектор "Джин" по Д.3.2 для проведения регистрации результатов ПЦР. В соответствии с руководством по эксплуатации к ПЦР-детектору "Джин" проводят регистрацию результатов ПЦР (пороговые значения для продукта амплификации и для внутреннего контрольного образца указаны в инструкции к комплектам реагентов для амплификации ДНК).

Д.7.2. Учет и интерпретация результатов

Д.7.2.1. Учет и интерпретация результатов анализа осуществляется автоматически при помощи компьютерной программы "Gene" [23]. Результаты анализа отображаются на экране компьютера в виде таблицы (рисунок Д.1).

Д.7.2.2. За положительный результат принимают отображение символа "+" на красном фоне напротив обозначения анализируемой пробы в графе "Результат" таблицы. Положительный результат фиксируется в микроцентрифужных пробирках комплектов реагентов "СКАН-35S", "СКАН-nos", "СКАН-gus", "СКАН-npt" для анализируемых проб, содержащих нуклеотидные последовательности, характерные для промотора 35S, промотора nos, гена gus, гена nptII соответственно.

Д.7.2.3. За отрицательный результат принимают отображение символа "-" на зеленом фоне напротив обозначения анализируемой пробы в графе "Результат" таблицы. Отрицательный результат фиксируется в микроцентрифужных пробирках комплектов реагентов "СКАН-35S", "СКАН-nos", "СКАН-gus", "СКАН-npt" для проб, не содержащих нуклеотидные последовательности, характерные для промотора 35S, промотора nos, гена gus, гена nptII соответственно.

Пример оформления протокола испытания - в соответствии с приложением Г настоящего стандарта.

Д.7.2.4. За недостоверный результат принимают отображение символа "нд" на оранжевом фоне или символа "?" на желтом фоне (на рисунке Д.1 желтый фон отсутствует) напротив обозначения анализируемой пробы в графе "Результат" таблицы.

Это может быть вызвано несоблюдением условий анализа или несоблюдением условий выделения ДНК. В случае получения недостоверного результата определение повторяют.

Д.7.2.5. В случае отображения символа "+" на красном фоне напротив обозначения отрицательной контрольной пробы в графе "Результат" таблицы результаты анализа считают ложноположительными.

Причиной может быть загрязнение ГМИ реактивов и/или оборудования. В этом случае определение повторяют с заменой реактивов на свежеприготовленные.

Д.8. Требования безопасности

При проведении всех работ необходимо соблюдать требования техники безопасности в соответствии с разделом 9 настоящего стандарта".

Стандарт дополнить приложением - Е: