Настоящие методические рекомендации основаны на определении N-нитрозаминов (НА) в виде флуоресцирующих производных и предназначены для использования лабораториями санитарно-эпидемиологических станций и институтов гигиенического профиля для определения содержания НА в продовольственном сырье и различных пищевых продуктах. Чувствительность метода составляет 1,0 мкг НА в кг пищевого продукта и выше.

Метод определения содержания НА в продовольственном сырье и в пищевых продуктах состоит в следующем:

- выделение летучих НА путем перегонки с паром сначала из щелочного, затем из кислого растворов;

- экстракция хлористым метиленом НА из водного дистиллята;

- концентрирование экстракта пропусканием слабого тока инертного газа или на роторном испарителе;

- денитрозирование НА бромистоводородной кислотой;

- алкилирование образовавшихся аминов 8-метокси-5-хинолинсульфонилазиридином (КАЗ);

- разделение и количественное определение флуоресцирующих 8-метокси-5[N-(2-N-диалкилэтиламино)] хинолинсульфонамидных (КАЭ)-производных с помощью метода тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Идентификацию НА осуществляют сравнением подвижности в тонком слое силикагеля флуоресцирующих КАЭ-производных из образца с подвижностью соответствующих стандартных производных.

В основе количественного определения лежит визуальное сравнение интенсивности флуоресценции пятен КАЭ-производных из образца с интенсивностью флуоресцирующих пятен стандартных соединений. При необходимости возможно также количественное измерение величины флуоресценции КАЭ-производных на флуориметре-ЭФ-ЗМ.

1. Назначение и область применения

Метод предназначен для определения летучих с водяным паром НА в продовольственном сырье и в любых пищевых продуктах как растительного, так и животного происхождения.

2. Аппаратура, материалы и реактивы

2.1. Весы технические по ГОСТ 19491-74 и весы аналитические по ГОСТ 24104-80Е.

2.2. Шкаф сушильный, нагревательные приборы (электронагреватель по ГОСТ 13268-83Е, колбонагреватель или электроплитка по ГОСТ 14919-83Е).

2.3. Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76.

2.4. Насос водоструйный по ГОСТ 10696-75.

2.5. Контактные термометры по ГОСТ 9871-75Е.

2.6. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833) МРТУ 64-1-1080-63 или диагностическая лампа ОЛД-41.

2.7. Флуориметр ЭМ-ЗМ с фильтрами В₁-1, В₂-2.

2.8. Камера для ТСХ с притертыми крышками, например, стеклянные четырехугольные сосуды 195 x 195 x 200 мм завода "Дружная горка".

2.9. Пластинки для ТСХ "Силуфол" размером 15 x 15 см, ЧСФР.

2.10. Микрошприц МШ-10 на 10 мкл или калиброванные стеклянные капилляры.

2.11. Мясорубка или гомогенизатор по ГОСТ 15906-79.

2.12. Штативы Бунзена.

2.13. Бани глицериновые.

2.14. Дефлегматор елочный по ГОСТ 20729-75.

2.15. Цилиндры мерные на 50, 100, 200 мл по ГОСТ 1770-74Е.

2.16. Пипетки емкостью 1, 2 мл по ГОСТ 20292-74Е.

2.17. Колбы мерные или пробирки мерные емкостью 2, 5, 25, 50 мл по ГОСТ 1770-74Е.

2.18. Холодильник Либиха с алонжем по ГОСТ 9499-70.

2.19. Холодильник обратный по ГОСТ 23932-79Е и 25336-82Е.

2.20. Насадка для паровика изготовлена по эскизу (см. рис., поз. 8).

2.21. Колбы круглодонные на 1000 и 5 мл по ТУ 48-52.

2.22. Делительные воронки емкостью 5 и 250 мл по ГОСТ 23932-79Е и 25336-82Е.

2.23. Эксикатор.

2.24. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

2.25. Бромистоводородная кислота концентрированная (НВг) по ГОСТ 2062-67. 31%-ный раствор НВг в ледяной уксусной кислоте (НВг/АсОН) готовят: к 50 мл ледяной уксусной кислоты добавляют 100 мл НВг.

2.26. Кислота соляная по ГОСТ 3118-77, водный раствор 0,1 н.

2.27. Кислота серная по ГОСТ 4204-77, хч.

2.28. Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61-75.

2.29. Метилен хлористый, МРТУ 6-09-5362-68.

2.30. Натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201-79.

2.31. Натрий сернокислый пиро по ГОСТ 18344-78, хч.

2.32. Натрий хлористый по ГОСТ 4233-77.

2.33. Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, хч.

2.34. Гексан, МРТУ 6-09-2937-66, хч.

2.35. Бензол по ГОСТ 5955-75.

2.36. Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-74.

2.37. Аммиак водный по ГОСТ 3760-79.

2.38. Диметиламин хлоргидрат по ТУВЗ 30-65, ч.

2.39. Диэтиламин, ТУ 6-09-682706, хч.

2.40. Дипропиламин, ч.

2.41. Дибутиламин, ТУ 6-09-1802-72, хч.

2.42. Пиперидин, ТУ 1011-232-68, чда.

2.43. Пирролидин, ТУ ЛРЗ 134-65, ч.

2.44. Азот газообразный особой чистоты.

2.45. 8-метокси-5-хинолинсульфонилазиридин. Институт биологической и медицинской химии АМН СССР гарантирует снабжение лабораторий СЭС необходимым количеством реактива.

Замечание. В работе рекомендуется использовать свежеперегнанные растворители.

3. Подготовка к анализу

3.1. Подготовка образца пищевого продукта.

50 - 100 г продукта, взвешенного с точностью до г, измельчают в мясорубке или гомогенизаторе. Навеску переносят в круглодонную колбу на 500 мл, соединенную с паровиком и прямым холодильником (см. рис.). К продукту добавляют 10 г хлористого натрия, 10 г сульфата натрия или магния, 5 - 10 мл 2 н раствора гидроокиси натрия до pH > 8, 25 - 100 мл дистиллированной воды в зависимости от влажности продукта и НА отгоняют с паром, собирая 150 мл дистиллята. Полученный дистиллят вновь переносят в перегонную колбу, добавляют 2 - 5 мл 2 н раствора серной кислоты до pH < 3, 10 г хлористого натрия или сульфата магния и НА отгоняют с водяным паром, собирая 100 мл дистиллята. Последний переносят в делительную воронку и НА экстрагируют хлористым метиленом 5 - 6 раз по 15 мл. Объединенные экстракты высушивают прокаленным сульфатом магния и затем концентрируют по 2 мл упариванием в токе азота при 30 °C или на роторном испарителе при Р = 30 мм рт. ст. и 25 °C. Количество экстракта делят на две равные части (раствор А и раствор Б).

Одну часть раствора (раствор А) денитрозируют добавлением 0,1 мл 31%-ного раствора HBr/AcOH и выдерживанием этого раствора в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего раствор упаривают на роторном испарителе досуха, Р = 10 - 15 мм рт. ст., T = 40 - 50 °C. К остатку добавляют 0,2 мл 1%-ного раствора углекислого кислого натрия, 0,1 мл спиртового раствора, содержащего 10 мкг КАЗ (концентрация рабочего раствора КАЗ 10 мг/100 мл спирта) и кипятят 30 мин. При определении содержания НА в солоде и пиве добавляют 1,5 мл рабочего раствора КАЗ. Реакционную смесь упаривают досуха и к остатку добавляют 0,1 мл этанола. Для анализа используют 10 - 20 мкл раствора. Полученные КАЭ-производные аминов, содержание которых эквивалентно количеству НА в пробе, анализируют методом ТСХ в сравнении со стандартами.

Для проведения "холостой пробы" ко второй части хлорметиленового экстракта (раствор Б) добавляют 0,1 мл рабочего раствора КАЗ, 0,2 мл 1%-ного раствора углекислого кислого натрия и кипятят 30 мин. Обрабатывают аналогично раствору А. Полученный спиртовой раствор анализируют методом ТСХ. Результаты "холостого опыта" учитывают при расчете содержания НА в продовольственном сырье и пищевых продуктах.

3.2. Приготовление стандартных растворов.

В круглодонные колбы на 50 мл помещают по 5 мл этанола, вносят соответствующие амины: диметиламин хлоргидрат (ДМА·HCl) - 5,5 мг, диэтиламин (ДЭА) - 5,1 мкл, дипропиламин (ДПА) - 5,2 мкл, дибутиламин (ДБА) - 5,35 мкл, пиперидин (Пип) - 4,3 мкл, пирролидин (Пир) - 4,15 мкл и в каждую колбу добавляют по 20 мг КАЗ. В колбу, содержащую ДМА HCl, прибавляют 9,6 мг углекислого кислого натрия и 5 мл воды. Смеси кипятят 30 мин с обратным холодильником, упаривают на роторном испарителе (Р = 10 - 16 мм рт. ст., Т = 40 - 50 °C) до 3 - 4 мл, содержимое колб переносят в мерные пробирки, реакционные колбы ополаскивают этанолом и объем доводят до метки 5 мл. Получают растворы с концентрацией C₁ = 1 мг/мл в пересчете на каждый НА. Для получения растворов рабочей концентрации С₂ = 0,1 мг/мл 2,5 мл каждого стандартного раствора с концентрацией C₁ переносят в мерные колбы на 25 мл и доводят до метки этанолом. Для получения смеси стандартов в мерную колбу на 25 мл помещают по 2,5 мл каждого раствора КАЭ-производного с концентрацией C₁ и раствор доводят до метки этанолом. Концентрация каждого стандартного производного в этой смеси тоже равна С'₂ = 0,1 мг/мл. Для получения смеси стандартов меньших концентраций С₃ и С₄ в мерные колбы на 25 мл помещают соответственно 2,5 и 1,25 мл стандартного раствора C'₂ и растворы доводят до метки этанолом. Концентрация каждого стандарта в этих смесях соответственно равна С₃ = 10 нг/мкл и С₄ = 5 нг/мкл.

4. Проведение анализа и обработка результатов

4.1. Тонкослойная хроматография.

4.1.1. Подготовка пластинок для хроматографического анализа.

Пластинку "Силуфол" размером 15 x 15 см помещают в камеру для хроматографии, в которую предварительно наливают смесь бензол-этилацетат-уксусная кислота (100:50:1) (система 1). Развитие хроматограммы проводят до достижения растворителем верхнего края пластинки. Затем пластинку извлекают из камеры, сушат 10 мин на воздухе, помещают в сушильный шкаф и активируют при 110 - 120 °C в течение часа. Для анализа требуется несколько пластинок, которые после активирования до использования хранят в закрытом эксикаторе над хлористым кальцием.

4.1.2. Проведение тонкослойной хроматографии, идентификация НА и количественное определение.

На расстоянии 3 см от нижнего края пластинки проводят карандашом тонкую горизонтальную линию, на которую с интервалом в 1,3 см наносят 10 точек. В первую точку наносят 10 - 20 мкл исследуемого раствора А, во вторую - 10 - 20 мкл раствора Б, в последующие 6 точек - по 1 мкл каждого стандартного раствора КАЭ-производных с концентрацией С₂, а в 9 и 10 точки наносят по 4 мкл растворов С₃ и С₄.

При определении содержания НА в солоде и пиве в 9 и 10 точки наносят соответственно 1 и 3 мкл раствора С₁. Пластинку поворачивают на 180° и помещают в хроматографическую камеру с системой 1. Развитие хроматограммы проводят до достижения верхнего края пластинки. Пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе 15 мин, срезают 2 см ниже фронта, тем самым удаляя избыток реагента и липофильные примеси, переворачивают на 180° и помещают в хроматографическую камеру со смесью ацетонитрил - 25%-ный аммиак (9:1) (система 2). Уровень растворителя должен быть примерно на 1 см ниже нанесенных пятен. Развитие хроматограммы проводят до достижения растворителем верхнего края пластинки. Пластинку сушат на воздухе и вновь помещают в хроматографическую камеру с системой 1. Хроматографируют в том же направлении, сушат и рассматривают в УФ-свете (лампа ОЛД-41 или прибор для флуоресцентного анализа витаминов, модель 833). Сравнивая подвижность флуоресцирующих производных, которые обнаружены в образце, с подвижностью соответствующих КАЭ-производных стандартов, осуществляют идентификацию НА.

Сравнивая интенсивность флуоресценции различных количеств стандартных НА с интенсивностью флуоресценции образца и "холостого опыта", определяют количество НА в пробе. При этом содержание НА в пробе рассчитывают по следующей формуле:

где К - количество НА в продовольственном сырье или пищевом продукте, мкг/кг,

N - количество НА в пробе с учетом "холостого опыта", мкг,

П - навеска продукта, кг,

V₁ - объем анализируемой пробы, мкл,

V₂ - объем нанесенной пробы, мкл,

1,2 - коэффициент, характеризующий степень денитрозирования НА, выход на стадии получения флуоресцентного производного, а также полноту извлечения НА.

При необходимости количественное определение содержания НА в продовольственном сырье и пищевых продуктах проводят на флуориметре. На двух или более пластинках (в зависимости от вязкости анализируемого раствора) на расстоянии 3 см от нижнего края пластинки наносят полосой в 6 - 7 см весь (100 мкл) анализируемый раствор и на тех же пластинках полосой в 3 - 4 см наносят по 100 мкл растворов стандартов с концентрацией, которая обнаружена в пробе. Аналогично наносят пробы "холостого опыта". Хроматографируют как описано выше, п. 4.1.2. Пластинки высушивают на воздухе, рассматривают в УФ-свете, отмечают иглой или карандашом флуоресцирующие зоны исследуемого раствора и стандартов, объединяют их вместе с каждой пластинки, разрезают на мелкие кусочки, помещают в колбочки на 10 мл, заливают 4 мл 1 н раствора HCl и, периодически встряхивая, выдерживают 30 мин при комнатной температуре. Раствор осторожно сливают в чистые колбочки (если попадают частицы силикагеля, пробы фильтруют), ополаскивают силикагель 3 раза по 1 мл 1 н HCl, и промывные воды объединяют с основным раствором. Аналогично поступают с каждой флуоресцирующей зоной образца, стандартов и "холостого опыта".

Величину флуоресценции полученных растворов (по 7 мл каждого) измеряют на электронном флуориметре ЭФ-ЗМ (прибор для определения витаминов) со светофильтрами: первичный - B₁ - 1, вторичный - B₂ - 2. Количество НА в образце рассчитывают по формуле:

где К - количество соответствующего НА в продовольственном сырье или пищевом продукте, мкг/кг

П - количество НА стандарта, мкг,

М - навеска продукта, кг,

Ф₁ - флуоресценция НА образца за вычетом флуоресценции "холостого опыта",

Ф₂ - флуоресценция соответствующего НА стандарта,

1,2 - коэффициент, характеризующий полноту извлечения НА, степень денитрозирования и выход на стадии получения флуоресцентного производного.

Статистическая обработка результатов анализа продовольственного сырья и пищевых продуктов показала, что относительное стандартное отклонение колеблется от 0,2 до 0,3 (при п = 6, P = 0,90).