1. Разработан и внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 "Комбикорма, БВД, премиксы", АООТ "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (АООТ "ВНИИКП").

2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 25 декабря 1997 г. N 426.

3. Введен впервые.

Настоящий стандарт распространяется на зерно (пшеницу, кукурузу, ячмень, овес), продукты его переработки (муку, крупу, отруби и др.), комбикорма и устанавливает метод определения содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) с использованием жидкостного хроматографа "Милихром".

Сущность метода заключается в экстракции дезоксиниваленола (вомитоксина) из испытуемой пробы смесью ацетонитрила с водой, очистке экстракта на двух последовательных колонках с активированным углем и количественном определении дезоксиниваленола (вомитоксина) с помощью жидкостного хроматографа "Милихром" со спектрофотометрическим детектором на ультрафиолетовую область (далее с УФ-детектором) в двухволновом режиме.

Пределы определения в пробе - 0,2 - 4,0 мг/кг, в растворе - 1 - 20 нг/мкдм3.

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия

ГОСТ 5556-81 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия

ГОСТ 6995-77 Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 13586.3-83 Зерно. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26312.1-84 Крупа. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 27668-88 Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб

ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Весы лабораторные общего назначения 3-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104.

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 20 г по ГОСТ 24104.

Мельница лабораторная электрическая типа ЭМ-3А, обеспечивающая измельчение пробы до прохода без остатка через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, обеспечивающий частоту встряхивания 200 колебаний в минуту.

Хроматограф жидкостный "Милихром" с УФ-детектором со спектральным диапазоном 190 - 360 нм, обеспечивающий одновременное измерение на не менее двух длинах волн, уровень шумов не более единиц оптической плотности (е. о. п.).

Спектрофотометр типа СФ-26, СФ-46 со спектральным диапазоном 186 - 1100 нм, основная погрешность измерений коэффициента пропускания не более 1%, градуировки длин волн в УФ-области - не более 0,1 нм.

Колонка аналитическая хроматографическая для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) размером 80 x 2 мм, заполненная сорбентом диабонд С 16 с эффективностью не ниже 5000 теоретических тарелок (далее - т. т.).

Колонки хроматографические для жидкостной хроматографии (ЖХ) размером 100 x 5 мм с оттянутым концом и шарообразной верхней частью вместимостью 25 см3.

Баллон с азотом.

Сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Испаритель ротационный марки ИР-2М или насос водоструйный.

Колбы мерные 1(2)-25(50, 100)-2 по ГОСТ 1770.

Цилиндры мерные 1(3)-25(100, 250) по ГОСТ 1770.

Колбы 0-25(50)-14/23 ТС по ГОСТ 25336.

Пробирки типа П1 по ГОСТ 25336.

Пипетки 1-1-2-0,5(1, 2, 5, 10) по ГОСТ 29227.

Колбы плоскодонные конические с притертыми стеклянными или полиэтиленовыми пробками вместимостью 500 см3.

Склянки из темного стекла с притертыми пробками.

Уголь активированный марки ФАС размером частиц от 0,08 до 0,10 мм по НД [1].

Фильтры бумажные обеззоленные марки ФОМ по НД [2].

Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556.

Метанол-яд по ГОСТ 6995.

Ацетонитрил для хроматографии с содержанием основного вещества не менее 99,5% (оптическая плотность ацетонитрила при длине волны 210 нм относительно воды должна быть не более 0,3 е. о. п.)

Дезоксиниваленол (вомитоксин) кристаллический массовой долей основного вещества не менее 90%.

Вода бидистиллированная электрическим сопротивлением не менее 12 МОм.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.

4.1. Отбор проб по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 13586.3, ГОСТ 26312.1, ГОСТ 27668.

Масса средней пробы исследуемого продукта должна быть не менее 2 кг.

4.2. Подготовка пробы к испытанию

Из средней пробы исследуемого продукта методом квартования выделяют часть пробы массой не менее 100 г и измельчают на лабораторной мельнице до такого состояния, чтобы она проходила без остатка через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Выделенную часть размолотой пробы тщательно перемешивают.

Выделенную часть пробы муки используют для анализа без предварительного размалывания.

4.3. Приготовление элюирующих растворов

Приготавливают смеси ацетонитрила и воды в объемных соотношениях: 0,05:1; 0,125:1; 0,5:1; 1:1.

4.4. Приготовление исходного раствора дезоксиниваленола (вомитоксина)

Навеску кристаллического дезоксиниваленола (вомитоксина) массой (10 +/- 0,01) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем раствора бидистиллированной водой до метки.

Для определения массовой концентрации дезоксиниваленола (вомитоксина) в исходном растворе 3 см3 исходного раствора переносят в пробирку. Растворитель испаряют в токе азота или при вакууме с помощью водоструйного насоса при нагревании не выше 60 °C досуха. К остатку добавляют 3 см3 метилового спирта и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 218 нм в кюветах толщиной просвечиваемого слоя 10 мм относительно метилового спирта.

Массовую концентрацию дезоксиниваленола (вомитоксина) в исходном растворе , нг/мкдм3, вычисляют по формуле

где D - оптическая плотность исходного раствора дезоксиниваленола (вомитоксина), е. о. п.;

296 - молекулярная масса дезоксиниваленола (вомитоксина), г;

4500 - коэффициент молярной экстинкции дезоксиниваленола (вомитоксина), дм3/моль x см;

- коэффициент пересчета г в нг;

- коэффициент пересчета дм3 в мкдм3.

4.5. Приготовление градуировочных растворов дезоксиниваленола (вомитоксина)

В мерные колбы вместимостью 100 см3 переносят исходный раствор дезоксиниваленола (вомитоксина) в объемах, указанных в таблице 1. Объем жидкости в колбах доводят до метки дистиллированной водой.

Градуировочные растворы хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном месте при температуре около 0 °C не более года.

4.6. Подготовка колонок для жидкостной хроматографии (ЖХ) для очистки экстракта

На дно двух хроматографических колонок (ЖХ) помещают промытые ацетонитрилом ватные тампоны. В одну колонку вносят (0,2 +/- 0,05) г (далее колонка 1), в другую - (0,1 +/- 0,05) г (далее колонка 2) активированного угля. Уплотняют при осторожном постукивании до высоты слоя, не изменяющейся при дальнейшее постукивании.

4.7. Кондиционирование ВЭЖХ колонки

Перед первыми анализами колонку кондиционируют, проводя 3 - 4 холостых опыта, т.е. проводят градиентное элюирование по 5.3 без введения в колонку пробы.

4.8. Градуировка прибора

Для градуировки прибора в колонку (ВЭЖХ) вводят по 4 мкдм3 градуировочных растворов и проводят хроматографирование по 5.3. Каждый градуировочный раствор вводят 3 раза. Для каждого пика определяют время удерживания (, мин), измеряют высоту пика (, мм) или е. о. п.

По полученным результатам устанавливают время удерживания дезоксиниваленола (вомитоксина) и погрешность времени удерживания. Среднее время удерживания , мин, вычисляют по формуле

где - время удерживания для i-го градуировочного раствора, мин;

n - количество введенных в хроматограф градуировочных растворов (n = 9).

Среднее квадратическое отклонение значения времени удерживания S, мин, вычисляют по формуле

Границы абсолютной погрешности значения времени удерживания , мин, вычисляют по формуле

где t - критерий Стьюдента для числа степеней свободы f = n - 1 (P = 0,95). Записывают интервал, в котором могут находиться с вероятностью P = 0,95 значения времени удерживания дезоксиниваленола (вомитоксина) от до .

По результатам хроматографирования градуировочных растворов определяют значение градуировочного коэффициента. Для этого сначала вычисляют для каждого градуировочного раствора значение градуировочного коэффициента , нг/мм или нг/е. о. п., по формуле

где - масса дезоксиниваленола (вомитоксина), введенная в хроматограф с i-ым градуировочным раствором, нг (по данным таблицы 1);

- высота пика i-го градуировочного раствора, мм или е. о. п.

Среднее арифметическое значение градуировочного коэффициента , нг/мм или нг/е. о. п., вычисляют по формуле

где n - количество градуировочных растворов, введенных в хроматограф (n = 9).

Значение градуировочного коэффициента контролируют не реже одного раза в месяц. Для этого вводят в хроматограф один из градуировочных растворов и вычисляют для него градуировочный коэффициент . Если при этом , прибор не подлежит переградуировке. В противном случае прибор должен быть отградуирован заново согласно 4.8.

5.1. Экстракция дезоксиниваленола (вомитоксина) из исследуемого продукта

Навеску исследуемого продукта массой (25 +/- 0,05) г помещают в колбу с притертой пробкой вместимостью 500 см3, приливают 20 см3 бидистиллированной воды и затем 105 см3 ацетонитрила. Колбу закрывают пробкой и встряхивают на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный складчатый фильтр в колбу с притертой пробкой.

5.2. Очистка экстракта

5 см3 фильтрата (5.1) переносят в колонку 1 (ЖХ) (4.6) и элюируют в остродонную колбу вместимостью 50 см3 со скоростью не более 0,5 см3/мин. С целью ускорения элюирование можно проводить с помощью вакуума водоструйного насоса. Не допуская осушения сорбента, через колонку пропускают 15 см3 ацетонитрила, собирая элюат в ту же остродонную колбу.

По окончании элюирования из колбы с помощью ротационного вакуумного испарителя при температуре не более 60 °C полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку добавляют 1 см3 бидистиллированной воды. Колбу закрывают пробкой и ее стенки осторожно споласкивают находящейся в ней жидкостью. Содержимое колбы с помощью пипетки переносят в колонку 2 (4.6). Стенки колбы повторно обмывают 1 см3 бидистиллированной воды, которую также переносят в колонку 2. Колонку 2 промывают 2 см3 бидистиллированной воды и элюат отбрасывают.

Из колонки 2 дезоксиниваленол элюируют 7,5 см3 ацетонитрила в остродонную колбу вместимостью 25 см3. Собранный элюат упаривают досуха с помощью ротационного вакуумного испарителя. Остаток растворяют в 0,2 см3 метилового спирта. Полученный раствор используют для хроматографического анализа (далее - испытуемый раствор).

5.3. Выполнение измерений

5.3.1. Условия проведения измерений

Измерения проводят в следующих условиях:

а) разделение компонентов проводят на колонке размером 80 x 2 мм;

б) сорбент - диабонд С 16 с эффективностью не менее 5000 т. т.;

в) рабочие длины волн УФ-детектора - 230 и 276 нм (230 нм - опорная длина волны, 276 нм - длина волны для контроля чистоты экстракта);

г) скорость элюирования - 100 мкдм3/мин.

Элюирование проводят в градиентном режиме. Для этого в шприце насоса готовят элюент с переформированным градиентом. Насос устанавливают в перевернутое положение и набирают последовательно:

600 мкдм3 воды;

500 мкдм3 раствора ацетонитрил - вода (0,05:1);

600 мкдм3 раствора ацетонитрил - вода (0,125:1);

100 мкдм3 раствора ацетонитрил - вода (0,5:1);

100 мкдм3 раствора ацетонитрил - вода (1:1);

700 мкдм3 ацетонитрила;

д) объем анализируемого раствора - 4 мкдм3;

е) чувствительность - 0,1 е. о. п. при 100 милливольтах шкалы самописца.

На приборе устанавливают следующие параметры:

количество образцов - 3;

объем ступеней, мкдм3: 1-600, 2-500, 3-600, 4-100, 5-100, 6-700;

объем регенерации, мкдм3 - 200, буфера - 15, пробы - 4, буфера - 10;

расход элюента - 100 мкдм3/мин;

скорость набора - 800 мкдм3/мин.

5.3.2. Проведение измерений испытуемого раствора

Допускается проведение анализа методом внешнего стандарта.

Если прибор предварительно отградуирован по 4.8, в колонку хроматографа вводят три раза по 4 мкдм3 испытуемого раствора, полученного по 5.2. По показаниям прибора при двух длинах волны - 230 и 276 нм оценивают чистоту испытуемого раствора согласно инструкции к прибору. Идентификацию пика дезоксиниваленола (вомитоксина) проводят по времени удерживания (t), которое должно находиться в интервале, установленном при градуировке: . Измеряют высоту пиков дезоксиниваленола (вомитоксина).

Если прибор предварительно не градуировали, в колонку хроматографа вводят три раза по 4 мкдм3 испытуемого раствора и градуировочных растворов. Измеряют высоту пиков дезоксиниваленола (вомитоксина) испытуемого раствора и того градуировочного раствора, высота пиков которого наименее отличается от высоты пиков испытуемого раствора.

6.1. В том случае, когда одновременно с испытуемыми растворами хроматографируют и градуировочные растворы, массовую долю дезоксиниваленола (вомитоксина) X, нг/г, в испытуемой пробе вычисляют по формуле

где - масса дезоксиниваленола (вомитоксина), введенная в хроматограф с i-ым градуировочным раствором, высота пика которого наименее отличается от высоты пика испытуемого раствора, нг (определяется по данным таблицы 1);

- среднее арифметическое значение трех измерений высоты пиков испытуемого раствора, мм или е. о. п.;

- среднее арифметическое значение трех измерений высоты пиков i-го градуировочного раствора, мм или е. о. п.;

0,2 - объем испытуемого раствора дезоксиниваленола (вомитоксина) из образца, см3;

4 - объем испытуемого раствора, введенный в хроматограф, мкдм3;

125 - объем экстракта испытуемой пробы, см3;

5 - объем экстракта испытуемой пробы, взятый для очистки, см3;

25 - масса навески испытуемой пробы, г;

87 - степень извлечения дезоксиниваленола (вомитоксина) из пробы, %;

1000 - коэффициент пересчета см3 в мкдм3.

6.2. Массовую долю дезоксиниваленола (вомитоксина) X, нг/г, в испытуемой пробе с использованием градуировочного коэффициента вычисляют по формуле

где K - градуировочный коэффициент, нг/мм или нг/е. о. п.

6.3. При анализе каждой испытуемой пробы выполняют два параллельных определения, начиная со взятия навески испытуемой пробы по 5.1.

Если расхождение между результатами параллельных определений не превышает , где , и - результаты первого и второго параллельных определений и их среднее арифметическое соответственно, то среднее арифметическое X принимают за результат анализа. В противном случае анализ повторяют. Значение норматива (d) приведено в таблице 2.

По полученному результату анализа и значению относительной погрешности (, таблица 2) рассчитывают абсолютную погрешность , нг/г, по формуле

Результат анализа представляют в виде: при P = 0,95. Числовое значение результата анализа и его погрешность должны оканчиваться цифрой одного и того же разряда.

Внутренний оперативный контроль (ВОК) точности анализов включает контроль сходимости, воспроизводимости и точности результатов анализов. При превышении нормативов ВОК точности проводят повторные анализы. При повторном превышении указанных нормативов анализы приостанавливают, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

7.1. Сходимость параллельных определений контролируют для каждой анализируемой пробы согласно 6.3.

7.2. Для проведения ВОК воспроизводимости используют рабочие пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, получая два результата анализа в разных лабораториях или в одной, причем в этом случае максимально варьируют условия проведения анализа, т.е. используют разные наборы мерной посуды, анализы выполняют в разные дни или два различных аналитика.

Воспроизводимость контрольных анализов, а также воспроизводимость результатов анализа рабочих проб, выполненных за период, в течение которого условия проведения анализа принимают за стабильные и соответствующие условиям проведения контрольных анализов, признают удовлетворительной, если , где , и - результаты анализа одной и той же пробы, полученные при варьирующих условиях в одной лаборатории или разных лабораториях, и их среднее арифметическое значение соответственно; D - значение норматива ВОК воспроизводимости (таблица 2).

Периодичность проведения ВОК воспроизводимости не реже одного раза в две недели.

7.3. Для проведения ВОК точности используют рабочие пробы с известной добавкой дезоксиниваленола (вомитоксина). Пробу делят на две равные части, первую из которых анализируют в соответствии с методикой, а во вторую вводят известную добавку дезоксиниваленола (вомитоксина), а затем анализируют в соответствии с методикой. Добавка должна составлять 50 - 150% содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) в анализируемой пробе. Результаты получают по возможности в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.

Точность контрольных анализов признают удовлетворительной, если , где , и C - результаты контрольных анализов пробы с известной добавкой, без добавки и значение добавки соответственно; K - значение норматива ВОК точности при использовании метода добавок (таблица 2).

Контроль точности анализа проводят не реже одного раза в месяц, а также при смене реактивов и после длительного перерыва в работе.

7.4. Результаты ВОК заносят в специальный журнал контроля.

[1] ТУ 6-16-3096-89 Уголь активированный

[2] ТУ 6-09-1678-86 Фильтры обеззоленные (белая, красная, синяя ленты)