Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения".

1. Подготовлен ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации (ОАО "ВНИИС").

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность".

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 ноября 2010 г. N 364-ст.

4. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает ускоренный метод качественного определения (обнаружения) антибиотиков.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 53430-2009. Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализа

ГОСТ 12.1.004-91. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88. Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-2009. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75. Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80). Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80. Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 13928-84. Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовки их к анализу

ГОСТ 17206-96. Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26668-85. Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26669-85. Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26809-86. Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 28498-90. Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний.

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

Настоящий экспресс-метод устанавливает качественное определение (обнаружение) антибиотиков в пищевых продуктах, основанное на подавлении антибиотиком дегидрогеназной активности тест-культур в жидкой питательной среде.

4.1. Весы лабораторные с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания +/- 0,01.

4.2. Баня водяная с обогревом, поддерживающим температуру до 100 °C.

4.3. Термометр стеклянный жидкостный (нертутный) по ГОСТ 28498, с диапазоном измерения до 100 °C, ценой деления шкалы 1 °C.

4.4. Мясорубка или гомогенизатор.

4.5. Ножницы.

4.6. Чашки Петри по ГОСТ 25336.

4.7. Пробирки по ГОСТ 25336.

4.8. Центрифуга со скоростью вращения не менее 3000 об/мин.

4.9. Агар микробиологический по ГОСТ 17206.

4.10. Мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА).

4.11. Метиленовый синий, индикатор (0,5%-ный водный раствор).

4.12. Глюкоза 40%-ный раствор.

4.13. Тест-культуры.

5.1. Отбор проб продукции

Отбор проб - по ГОСТ Р 53430, ГОСТ 13928, ГОСТ 26668, ГОСТ 26669, ГОСТ 26809.

5.1.1. Подготовка проб к исследованию

5.1.1.1. Молоко и сливки жидкие (в сыром или пастеризованном виде)

Сырое молоко исследуют непосредственно в день отбора проб. До начала анализа пробы молока и сливок хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 1) °C. Затем отбирают пробу для анализа (не менее 10 см3) и помещают ее в пробирку.

5.1.1.2. Сухие молочные продукты (сухое молоко, сухие сливки, сухие детские молочные продукты, изготовленные на основе коровьего молока)

Непосредственно перед исследованием продукт подвергают восстановлению в кипяченой воде при температуре не более (45 +/- 1) °C. Пробу тщательно перемешивают, она не должна содержать нерастворенных частиц или комков. Из восстановленного продукта отбирают пробу для анализа в объеме не менее 10 см3 и переносят ее в пробирку.

5.1.1.3. Яйца, меланж

Яйца или меланж, предназначенные для исследования, предварительно нагревают на водяной бане при температуре (65 +/- 1) °C в течение 10 - 15 мин до коагуляции белка, затем содержимое яиц или меланж тщательно перемешивают и отбирают пробу для анализа массой не менее 10 г.

5.1.1.4. Мясо и субпродукты

Мясо и субпродукты (печень, почки, язык и т.д.) скота и птицы, предназначенные для исследования, измельчают ножницами или при помощи мясорубки или гомогенизатора, затем 10 г пробы мышечной ткани помещают в чашку Петри и дают стечь тканевому соку. Тканевый сок в объеме не менее 10 см3 переносят в пробирку.

5.1.2. Термическая обработка проб пищевых продуктов

Перед проведением исследования пробирку с пробой, отобранной по 5.1.1, помещают в водяную баню с температурой (60 +/- 1) °C. Время прогревания 30 мин отмечают от момента достижения постоянной температуры внутри пробирки.

5.1.3. Тест-культуры для определения антибиотиков

Тест-культурами служат вегетативные формы спорообразующих и неспорообразующих культур: Bacillus subtilis, вар. 6633; Bacillus subtilis, вар. L2; Bacillus mycoides 537; Micrococcus luteum ATCC 9341, обладающих высокой чувствительностью к антибиотикам.

Для пенициллина и стрептомицина используют следующие тест-культуры - Bacillus subtilis, вар. 6633; Baсillus mycoides 537 и Micrococcus luteum ATCC 9341, для тетрациклина - Bacillus subtilis, вар. L2.

Музейные штаммы вегетативных форм тест-культур хранят в пробирке со столбиком полужидкого 0,4%-го питательного агара.

5.1.3.1. Приготовление тест-культур

Вначале тест-культуру рассеивают на чашки Петри с 2%-ным мясо-пептонным агаром для получения отдельных колоний. Чашки ставят на (20 +/- 3) ч в термостат при температуре (37 +/- 1) °C. После чего мелкие колонии отсевают в пробирки с 2%-ным мясо-пептонным скошенным агаром и вновь инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение (20 +/- 3) ч.

Микробную взвесь готовят путем смыва физиологическим раствором суточной культуры со скошенного агара. Важно, чтобы смыв культур был абсолютно гомогенным и не содержал комочков.

Срок хранения полученной взвеси в холодильнике при температуре (4 +/- 1) °C - 7 дн.

5.1.3.2. "Рабочая доза" тест-культур

"Рабочая доза" тест-культуры - наибольшее разведение суспензии, вызывающее обесцвечивание метиленового синего в определенное время в термостате при температуре (37 +/- 1) °C. При этом учитывают, что время обесцвечивания метиленового синего обратно пропорционально количеству клеток тест-культуры в смыве. Время постановки реакции равно одному часу. Оно выявляет в суспензиях различной плотности одну и ту же клеточную нагрузку для каждой тест-культуры. "Рабочую дозу" тест-культур устанавливают по дегидрогеназной активности клеток.

5.1.3.3. Приготовление "рабочей дозы" тест-культуры

Полученную взвесь тест-культуры (5.1.3.1) титруют путем последовательных разведений в 1 см3 питательного бульона в соотношении 1:2. Пробирки с тест-культурой встряхивают и помещают на 3 ч в термостат при температуре (37 +/- 1) °C. Затем для создания условий, близких к анаэробным, в каждую пробирку вносят по 2 см3 растопленного и охлажденного до температуры (45 +/- 1) °C 1%-ного питательного агара с метиленовым синим и глюкозой (оба ингредиента асептично вносят в растопленный 1%-ный питательный агар из расчета: на 100 см3 среды 0,4 см3 0,5%-ного водного раствора метиленового синего и 1 см3 40%-ного раствора глюкозы). Пробирки встряхивают и вновь инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение 1 - 2 ч, после чего учитывают результат (таблица 1).

Дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культур восстанавливают метиленовый синий в анаэробных условиях, и содержимое пробирок, имеющее синий цвет, обесцвечивается. Разведение тест-культуры в последней пробирке с обесцвеченным метиленовым синим (+) принимают за "рабочую дозу". Функциональная активность дегидрогеназ тест-культур стабилизируется через сутки после получения смыва, который хранится в холодильнике в течение одной недели. Поэтому "рабочую дозу" первый раз определяют через сутки, а затем - через три дня.

Максимальное разведение тест-культур, вызывающее полное обесцвечивание метиленового синего и выявленное через один час инкубации в термостате при температуре 37 °C, принимают за "рабочую дозу".

В среднем, "рабочую дозу" тест-культур определяют:

6.1. Подготовленные к исследованию анализируемые пробы по 5.1.1 в объеме 0,5 см3 вносят в пробирки с таким же (0,5 см3) объемом мясо-пептонного бульона и тщательно перемешивают. Во все пробирки добавляют 0,5 см3 взвеси, содержащей двойную "рабочую дозу" тест-культуры, т.е. предпоследнее разведение, вызывающее обесцвечивание метиленового синего через 1 ч (5.1.3.3).

Последняя пробирка не содержит испытуемого субстрата и служит контролем ферментативной активности тест-культуры.

Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 3-часовую экспозицию тест-культуры с испытуемым субстратом.

После этого в каждую пробирку вносят по 2 м3 растопленного и охлажденного до температуры (45 +/- 1) °C мясо-пептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок смешивают и вновь инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение 1 - 2 ч.

6.2. Учет результатов определения антибиотиков

6.2.1. При отсутствии в испытуемых пробах антибиотика дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культур не нарушаются и восстанавливают (т.е. обесцвечивают) в анаэробных условиях метиленовый синий.

6.2.2. В контрольной пробирке, где отсутствует анализируемая проба, также происходит обесцвечивание в течение 1 - 2 ч наблюдения в термостате при температуре (37 +/- 1) °C (контроль ферментативной активности бактериальных клеток тест-культуры).

6.2.3. При наличии антибиотика в анализируемой пробе дыхательные ферменты бактериальных клеток блокируются, метиленовый синий не восстанавливается, цвет остается синим.

При выполнении работ необходимо соблюдать следующие требования:

- помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с ГОСТ 12.4.021;

- содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005;

- безопасность при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007;

- требования безопасности при работе в микробиологической лаборатории с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) по документу, утвержденному в установленном порядке;

- требования техники безопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009.