Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения".

1. Разработан Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии).

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 470 "Молоко и продукты переработки молока".

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N 949-ст.

4. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Настоящий стандарт распространяется на составные молочные продукты и продукты детского питания на молочной основе (далее - продукт) и устанавливает определение массовой концентрации моно- и дисахаридов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Диапазон измерений массовой концентрации моно- и дисахаридов в продукте от 50,0 до 10000,0 мг/дм³.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) Вода для лабораторного анализа. Технические условия

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13928-84 Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные шкафы бытовые. Общие технические условия.

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 27752-88 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены термины, установленные нормативным правовым актом Российской Федерации [1], а также следующий термин с соответствующим определением:

3.1. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии: метод разделения компонентов продукта, основанный на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна, с использованием высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (до 1,8 мкм).

Метод основан на определении углеводов в фильтрате, полученном после удаления из пробы продукта жира и белка, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии при разделении на аминофазной колонке. Полученные результаты измерения сравнивают со значениями массовой концентрации моно- и дисахаридов в стандартных образцах, используя градуировочный график.

Пример хроматограммы молочного продукта представлен в Приложении А.

Хроматограф жидкостный высокоэффективный, включающий следующие элементы:

- колонку аминофазную длиной 300 мм, размером внутреннего диаметра 78 мм;

- предколонку длиной 300 мм, размером внутреннего диаметра 46 мм, заполненную катионом в гидрогенной форме;

- предколонку длиной 300 мм, размером внутреннего диаметра 46 мм, заполненную анионом в карбонатной форме;

- детектор высокочувствительный рефрактометрический с порогом шума не более единиц рефракции;

- мешалку магнитную;

- насос, способный пропускать раствор со скоростью 0,3 - 0,6 см³/мин, с пульсацией не более 1% при давлении на колонку от 1,5 до 4,0 МПа;

- термостат для хроматографических колонок, обеспечивающий поддержание температуры элюента (85 +/- 2) °C;

- устройство петлевое для ввода пробы рабочим объемом петли 0,020 см³;

- программу компьютерную для статистической обработки результатов типа "Мультихром", версия 1.5 и выше со встроенным интегратором.

Весы по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания +/- 0,001 г, +/- 0,2 мг.

Дозаторы пипеточные переменного объема дозирования в диапазоне 0,040 - 1,000 см³ с относительной погрешностью дозирования +/- 1%.

Микрошприц для ВЭЖХ вместимостью 0,100 см³.

Часы электронно-механические по ГОСТ 27752.

Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.

Баня ультразвуковая лабораторная рабочим объемом не менее 2 дм³.

Колбы мерные 1-50-2, 1-100-2, 1-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Цилиндры вместимостью 1-50-2, 1-100-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 1-1-2-10 по ГОСТ 29227.

Пипетки с одним делением 1(2)-2-5, 1(2)-2-10, 2-2-20 по ГОСТ 29169.

Колбы П-1-50-19/26 ТС (-1-25-19/26 ТС) по ГОСТ 25336.

Воронки В-56-80 ХС по ГОСТ 25336.

Насос водоструйный лабораторный по ГОСТ 25336.

Прибор для фильтрования стеклянный с фильтром с размером диаметра 0,45 мкм.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026, фильтры с размером диаметра 12,5 см.

Фильтры мембранные с размером диаметра пор не более 0,5 мкм.

Ацетат цинка двуводный, массовой долей основного вещества не менее 99,999%.

Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61.

Кислота фосфорновольфрамовая 24-водная.

Образцы стандартные углеводов массовой долей основного вещества не менее 99,0%.

Вода для лабораторного анализа первой степени чистоты (бидистиллированная) по ГОСТ Р 52501.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

Отбор проб - по ГОСТ 13928 и ГОСТ 26809.

7.1. Подготовка стандартного раствора углевода

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 75 мг соответствующего стандартного образца углевода с записью результата до четвертого знака после запятой и растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки.

Срок хранения раствора при температуре от 4 °C до 6 °C - не более 7 сут.

7.2. Реактив для предварительной обработки пробы

(91,00 +/- 0,01) г ацетата цинка двуводного, (54,60 +/- 0,01) г фосфорновольфрамовой кислоты 24-водной и 58,1 см³ ледяной уксусной кислоты аккуратно вносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³ и растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки.

Срок хранения реактива при температуре от 4 °C до 6 °C - не более 10 сут.

7.3. Подготовка градуировочных растворов

Градуировочные растворы, содержащие 250, 500, 750 и 1000 мг углевода на 1000 см³ обезжиренного пастеризованного молока, готовят, добавляя 5, 10, 15 и 20 см³ соответственно стандартного раствора углевода, подготовленного по 7.1, к обезжиренному пастеризованному молоку, не содержащему данного углевода.

В четыре мерные колбы вместимостью 50 см³ помещают по 15 см³ обезжиренного пастеризованного молока.

7.3.1. Градуировочный раствор А, содержащий 250 мг углевода на 1000 см³ продукта

7.3.1.1. В первую мерную колбу, содержащую 15 см³ молока, помещают 5 см³ стандартного раствора углевода (по 7.1) и перемешивают. Мерным цилиндром добавляют 15 см³ бидистиллированной воды и вновь перемешивают.

7.3.1.2. Затем с помощью пипетки добавляют 5,5 см³ реактива для предварительной обработки образца по 7.2 и перемешивают. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки и перемешивают. Оставляют на 1 ч при температуре (23 +/- 2) °C и фильтруют через бумажный фильтр с размером диаметра 12,5 см, отбрасывая первые 5 см³ фильтрата.

7.3.2. Градуировочный раствор Б, содержащий 500 мг углевода на 1000 см³ продукта

Во вторую мерную колбу, содержащую 15 см³ молока, помещают 10 см³ стандартного раствора углевода по 7.1 и перемешивают. Добавляют 10 см³ бидистиллированной воды, используя мерный цилиндр, и перемешивают. Далее - по 7.3.1.2.

7.3.3. Градуировочный раствор В, содержащий 750 мг углевода на 1000 см³ продукта

В третью мерную колбу, содержащую 15 см³ молока, помещают 15 см³ стандартного раствора углевода по 7.1 и перемешивают. Добавляют 5 см³ бидистиллированной воды, используя мерный цилиндр, и перемешивают. Далее - по 7.3.1.2.

7.3.4. Градуировочный раствор Г, содержащий 1000 мг углевода на 1000 см³ продукта

В четвертую мерную колбу, содержащую 15 см³ молока, помещают 20 см³ стандартного раствора углевода по 7.1 и перемешивают. Добавляют 5 см³ бидистиллированной воды, используя мерный цилиндр, и перемешивают. Далее - по 7.3.1.2.

7.3.5. Все растворы готовят перед определением.

7.4. Подготовка элюента

Дегазацию растворенного в элюенте воздуха проводят с помощью водоструйного или вакуумного насоса, обрабатывая бидистиллированную воду ультразвуком в течение 30 с при комнатной температуре. По возможности избегают вспенивания элюента.

Элюент готовят в день определения.

7.5. Подготовка анализируемой пробы продукта

7.5.1. Пробу продукта нагревают до температуры (20 +/- 2) °C и аккуратно перемешивают. Если жир не растворился, пробу постепенно нагревают до температуры (40 +/- 2) °C, аккуратно перемешивают переворачиванием (не допуская вбивания воздуха) и быстро охлаждают до температуры (20 +/- 2) °C.

7.5.2. (15,000 +/- 0,001) г подготовленной по 7.5.1 пробы помещают в мерную колбу вместимостью 50 см³. Мерным цилиндром приливают 20 см³ бидистиллированной воды. Добавляют 5,5 см³ реактива для предварительной обработки пробы по 7.2 и перемешивают. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор оставляют на 1 ч при температуре (23 +/- 2) °C, затем фильтруют через бумажный фильтр, отбрасывая первые 5 см³ фильтрата.

7.6. Подготовка хроматографа

Установку, включение и подготовку хроматографа к работе выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации прибора.

7.6.1. Условия хроматографирования

- скорость потока - 0,3 - 0,6 см³/мин;

- температура - 85,0 °C;

- подвижная фаза: бидистиллированная вода;

- детектор: рефрактометрический.

7.6.2. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика измеряют площади пиков, соответствующие массовым концентрациям углеводов в градуировочных растворах. Каждый градуировочный раствор хроматографируют не менее трех раз. Измерения выполняют последовательно, начиная с растворов с наименьшей массовой концентрацией определяемого вещества.

Полученные при хроматографировании значения не должны отклоняться от стандартных более чем на 5,00%.

По полученным данным, используя программные обеспечения к приборам, рассчитывают коэффициенты регрессии a и b прямой .

Градуировочный график строят с учетом вычисленных значений уравнения:

где Y - площадь пика углеводов;

a и b - коэффициенты регрессии;

- массовая концентрация углеводов в градуировочном растворе, мг/см³.

7.6.3. Градуировку проводят не реже 1 раза в квартал, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок или ремонте хроматографа.

При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:

Для проведения измерений применяют бидистиллированную воду, которую готовят следующим образом: дистиллированную воду фильтруют через мембранный фильтр (размер диаметра пор не более 0,5 мкм), затем кипятят для удаления растворенного воздуха и охлаждают до комнатной температуры.

9.1. Дегазация анализируемой пробы

В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают 3 см³ фильтрата по 7.5. Дегазацию растворенного в фильтрате воздуха проводят с помощью вакуумного насоса, обрабатывая ультразвуком в течение 30 с при комнатной температуре. По возможности избегают вспенивания.

9.2. В инжектор хроматографа вводят от 0,01 до 0,03 см³ тщательно отмеренного дегазированного фильтрата со скоростью потока 0,3 - 0,6 см³/мин.

Плоттер выбирают так, чтобы минимальная высота пика углевода составляла около 5 мм для градуировочного раствора А.

Массовую концентрацию углеводов в анализируемой пробе продукта C, мг/дм³, вычисляют по формуле

где - объем анализируемой пробы после разбавления по 7.5, см³;

- концентрация углевода, рассчитанная по градуировочному графику (7.6.2), мг/дм³;

- объем анализируемой пробы, взятой для анализа по 9.2, см³.

Вычисления проводят до второго десятичного знака. За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости по разделу 11.

Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.

11.1. Метрологические характеристики метода определения массовой концентрации моно- и дисахаридов

Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих метода определения массовой концентрации моно- и дисахаридов при P = 0,95 приведены в таблице 1.

11.2. Проверка приемлемости результатов определений, полученных в условиях повторяемости

Проверку приемлемости результатов определений массовой концентрации моно- и дисахаридов, полученных в условиях повторяемости (два параллельных определения, n = 2), проводят с учетом требований ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.2.2).

Результаты измерений считаются приемлемыми при условии:

где - значения двух параллельных определений, полученных в условиях повторяемости, мг/дм³;

- среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, мг/дм³;

- пределы повторяемости (сходимости), значения которых приведены в таблице 1, %.

Если данное условие не выполняется, то проводят повторное определение и проверку приемлемости результатов определений в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.2.2).

11.3. Проверка приемлемости результатов определения, полученных в условиях воспроизводимости

Проверку приемлемости результатов определений массовой концентрации моно- и дисахаридов, полученных в условиях воспроизводимости (в двух лабораториях, m = 2), проводят с учетом требований ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.3.2.1).

Результаты определений, выполненные в условиях воспроизводимости, считаются приемлемыми при условии:

где - результаты определений, полученные в двух лабораториях в условиях воспроизводимости, мг/дм³;

- пределы воспроизводимости, значения которых приведены в таблице 1, %;

- среднеарифметическое значение результатов определений, выполненных в условиях воспроизводимости, мг/дм³.

Если данное условие не выполняется, то процедуры повторяют в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.3.3).

Результат измерений массовой концентрации моно- и дисахаридов в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

где - границы относительной погрешности измерений, % (таблица 1);

- среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, мг/дм³.

При выполнении работ необходимо соблюдать следующие требования:

- помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с требованиями ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных требованиями ГОСТ 12.1.005;

- требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.007;

- требования техники безопасности при работе с электроустановками в соответствии с требованиями ГОСТ Р 12.1.019.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения в соответствии с требованиями ГОСТ 12.4.009.

А.1. Пример хроматограммы определения массовой концентрации моно- и дисахаридов в молочном продукте приведен на рисунке А.1.