1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным унитарным предприятием "Российский научно-технический центр информации по стандартизации, метрологии и оценке соответствия" (ФГУП "СТАНДАРТИНФОРМ")

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 036 "Продукция специализированная пищевая".

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2019 г. N 1314-ст

4 Настоящий стандарт разработан с учетом основных нормативных положений стандарта ДИН ЕН 16923:2017 "Продукты пищевые. Определение токсинов T-2 и HT-2 в зерне и зерновых продуктах для детей грудного и младшего возраста методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) после очистки методом твердофазной экстракции (ТФЭ)" (DIN EN 16923:2017 "Foodstuffs - Determination of T-2 toxin and HT-2 toxin in cereals and cereal products for infants and young children by LC-MS/MS after SPE cleanup", NEQ)

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Токсин T-2 и его метаболит токсин HT-2 относятся к группе трихотеценовых микотоксинов, продуцируемых некоторыми видами семейства плесневых грибов рода фузариум. В основном заражаются злаки: кукуруза, пшеница, ячмень, овес и рожь.

ВНИМАНИЕ! Если выполняют какие-либо действия с опасными химическими веществами, то следует принять соответствующие меры предосторожности и защиты, а также необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.007, ГОСТ 12.1.004, ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.019, ГОСТ 12.4.009, ГОСТ 12.4.021.

ВНИМАНИЕ! При использовании настоящего стандарта могут применяться опасные вещества, действия и оборудование. Настоящий стандарт не решает все проблемы безопасности, связанные с его применением. Пользователь настоящего стандарта несет ответственность за принятие соответствующих мер по технике безопасности и охране здоровья, а также определяет необходимые ограничительные предписания перед его применением.

ВНИМАНИЕ! Известно, что токсин T-2 и его метаболит токсин HT-2 обладают канцерогенными свойствами.

Настоящий стандарт устанавливает метод определения токсинов T-2 и HT-2 посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, HPLC) в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (МС/МС) после очистки методом твердофазной экстракции (ТФЭ, SPE) в зерновых и пищевой продукции для питания детей раннего возраста на зерновой основе.

Метод валидирован для определения токсина HT-2 в овсяной муке с концентрацией 9,3 и 28,1 мкг/кг, в овсяных хлопьях с концентрацией 16,5 и 21,4 мкг/кг и в сухих завтраках (с содержанием овсяных хлопьев) с концентрацией 8,1 мкг/кг и для токсина T-2 в овсяной муке с концентрацией от 4,4 до 8,3 мкг/кг, в овсяных хлопьях с концентрацией от 4,9 до 6,6 мкг/кг, а также для сухих завтраков (с содержанием овсяных хлопьев) с концентрацией 3,5 мкг/кг.

Лабораторные исследования показали, что этот метод также применим к сильно разбухающим продуктам (овсяная каша на основе сухих зерновых культур и модифицированный крахмал). Однако эти продукты не были проверены в ходе валидации данного метода. Более подробное описание приведено в 6.3.

Данный метод допускается применять к побочным продуктам переработки овса с более высокой концентрацией токсинов T-2 и HT-2. В этом случае следует учитывать этапы разбавления.

Этот метод допускается применять к зерну и зерновым продуктам на основе пшеницы, ячменя и риса для питания детей раннего возраста. В этом случае необходимо проверить метод на всех продуктах в лабораторных условиях (внутренняя валидация). В ходе межлабораторных испытаний проверяется диапазон от 10 до 100 мкг/кг. Предварительные исследования показали, что этот метод охватывает весь диапазон концентраций, несмотря на то, что данный способ был применен только в диапазоне от 3 до 28,1 мкг/кг.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 28311 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 33303 Продукты пищевые. Методы отбора проб для определения микотоксинов

ГОСТ Р 52501 (ИСО 3696:1987) Вода для лабораторного анализа. Технические условия

ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 6995 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ ISO 7886-1 Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования

ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р ИСО 5725-1 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-2 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ Р ИСО 5725-3 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений

ГОСТ Р ИСО 5725-4 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений

ГОСТ Р ИСО 5725-5 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений

ГОСТ Р ИСО 5725-6 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

Токсины T-2 и HT-2 экстрагируют водным раствором ацетонитрила путем встряхивания вручную или перемешивания на лабораторном смесителе. Отфильтрованный и разбавленный экстракт очищают и концентрируют в колонке для твердофазной экстракции или в пропускной колонке. Содержание токсинов определяют методом ВЭЖХ в сочетании с тандемной масс-спектрометрией.

Если не указано иное, используют только химические чистые реактивы для анализа (ч.д.а) и воду 1-й степени чистоты в соответствии с ГОСТ Р 52501. Если не указано иное, чистота растворителей должна быть соответствующей степени чистоты для ВЭЖХ.

4.1 Ацетонитрил для ВЭЖХ.

4.2 Метанол по ГОСТ 6995, для ВЭЖХ.

4.3 Смесь растворителей. 20 частей ацетонитрила (4.1) смешивают с 80 частями воды (20 + 80, B + B).

4.4 Смесь для экстрагирования. 84 части ацетонитрила (4.1) смешивают с 16 частями воды (84 + 16, B + B).

4.5 Элюент для ВЭЖХ-МС/МС. Примеры элюентов, подходящих для систем ВЭЖХ-МС/МС, приведены в приложении А. Раствор фильтруют через мембранный фильтр (5.18).

4.6 Азот, чистота не менее 99,9%.

4.7 Уголь активированный для хроматографии на колонке (размер частиц: от 63 до 200 мкм).

4.8 Оксид алюминия (нейтральный, для жидкостной хроматографии).

4.9 Земля диатомитовая, мелкозернистая/измельченная (диатомит, кизельгур), например, Celite 545.

4.10 Агент силилирующий.

4.11 Циклогексан, чистый для анализа (дополнительно).

4.12 Получение разбавленного силилирующего агента (дополнительно), например, 50 см³ силилирующего агента (4.10) смешивают с 950 см³ циклогексана (4.11).

4.13 Кислота муравьиная, степень чистоты для ВЭЖХ.

4.14 Раствор аммиака, молярная концентрация c(NH₃) = 13400 моль/м³ или массовая концентрация p(NH₃) = 250 г/дм³.

4.15 Ацетат аммония (CH₃CO₂NH₄), степень чистоты для ВЭЖХ-МС/МС.

4.16 Материал, защищающий от засорения (препятствующий закупориванию), например промытый морской песок, стеклянные или полиэтиленовые шарики (дополнительно).

4.17 Основной раствор токсина T-2, массовая концентрация p = 100 мкг/см³, в ацетонитриле.

4.18 Основной раствор токсина HT-2, p = 100 мкг/см³, в ацетонитриле.

4.19 Раствор внутреннего стандарта меченого изотопом токсина [¹³C₂₄]-T-2, p = 25 мкг/см³, в ацетонитриле. В качестве [¹³C₂₄]-токсина-T-2 можно также использовать и другие внутренние стандарты токсина T-2, меченые изотопом.

4.20 Раствор внутреннего стандарта меченого изотопом токсина [¹³C₂₂]-HT-2, p = 25 мкг/см³, в ацетонитриле. В качестве [¹³C₂₂]-токсина-HT-2 можно также использовать и другие внутренние стандарты токсина HT-2, меченые изотопом.

4.21 Смесь основных растворов токсинов T-2 и HT-2, p = 500 нг/см³

Пипеткой отбирают по 25 мм³ основных растворов токсинов T-2 и HT-2 (4.17 и 4.18) в мерную колбу объемом 5 см³ и добавляют смесь растворителей до метки (4.3).

Раствор допускается хранить 12 мес при температуре минус 18 °C.

4.22 Смесь растворов внутренних стандартов токсинов, p = 1000 нг/см³

Растворы внутренних стандартов токсинов по 200 мм³ (4.19 и 4.20) разбавляют в мерной колбе объемом 5 см³ смесью растворителей (4.3).

Такой раствор допускается хранить 6 мес при температуре минус 18 °C.

4.23 Растворы градуировочные

Для градуировки измерительной системы готовят градуировочные растворы с массовой концентрацией от 5 до 100 нг/см³.

Градуировочные растворы приведены в таблице 1.

Применяют следующие лабораторные приборы:

5.1 Весы лабораторные по ГОСТ OIML R 76-1, предел погрешности: 0,01 г.

5.2 Весы аналитические, предел погрешности: 0,1 мг.

5.3 Ванна ультразвуковая.

5.4 Шейкер лабораторный для пробирок.

5.5 Дозатор ручной, шприцы микромиллилитровые по ГОСТ ISO 7886-1 или пипетки, от 10 мм³ до 5 см³.

5.6 Дозатор по ГОСТ 28311, на 20 см³.

5.7 Колба Эрленмейера 250 см³ с пробкой или центрифужная пробирка на 250 см³.

5.8 Фильтр шприцевой (0,45 мкм) или центробежный фильтр (например, Durapore PVDF (0,45 мкм) или Millipore Ultrafree-MC, 0,5 см³, подходящие для центрифужных пробирок, например пробирка типа "Эппендорф".

5.9 Фильтр складчатый, размер пор от 4 до 7 мкм, диаметр 100 мм.

5.10 Центрифуга лабораторная.

5.11 Картриджи пустые объемом 6 см³ из полипропилена (PP) и пористые пластины из полиэтилена (PE) или обычные колонки твердофазной экстракции, например CHROMABOND Carbon/Alox/Celite, 6 см³, 500 мг.

5.12 Система для твердофазной экстракции.

5.13 Шейкеры лабораторные, например ротационные шейкеры.

5.14 Смеситель лабораторный, например Ultra Turrax.

5.15 Пробирки по ГОСТ 1770, подходящие для объема до 10,0 см³.

5.16 Пробирки силанизированные (дополнительно).

Заранее тщательно очищенные пробирки (5.15) заполняют до края разбавленным силилирующим агентом (4.12) и оставляют на 1 мин. Затем раствор реагента выливают из пробирки в специальную емкость, чтобы использовать повторно. Пробирки промывают сначала циклогексаном (4.11), а затем ацетонитрилом (4.1) или метанолом (4.2). Промывочные растворы допускается использовать многократно. Далее пробирки дважды промывают дистиллированной водой по ГОСТ 6709 и просушивают.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Surfasil представляет собой раствор силилхлорида, который, вступая в реакцию с водой, образует пары соляной кислоты. Поэтому после дериватизации пробирки никогда не следует промывать водой.

Если подтверждена пригодность несиланизированных сосудов, то можно использовать, например, пробирки из полипропилена.

5.17 Система для упаривания, например TurboVap LV Zymark или аналог.

5.18 Фильтр мембранный для водных растворов (размер пор 0,45 мкм).

5.19 Система ВЭЖХ-МС/МС, состоящая из перечисленных в 5.19.1 - 5.19.6 устройств.

5.19.1 Насос для ВЭЖХ.

5.19.2 Система ввода образцов.

5.19.3 Колонка хроматографическая, например октадецилсилан (ODS), который обеспечивает разрешение пиков токсинов T-2 и HT-2 более одного для распознавания от других сигналов, длина 150 мм, внутренний диаметр 2,00 мм, размер частиц 5 мкм, подходящая предколонка с обращенной фазой.

Также можно использовать колонки других размеров.

5.19.4 Термостат для колонок.

5.19.5 Масс-спектрометр тандемный (МС/МС).

5.19.6 Система обработки данных.

Перед началом анализа по ГОСТ 33303 или другим нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт, образец измельчается до однородного состояния, размер частиц не должен превышать 1 мм.

42 г активированного угля (4.7) смешивают с 30 г нейтрального оксида алюминия (4.8) и 18 г целита 545 (4.9) в стеклянной пробирке объемом 500 см³ (соотношение компонентов в смеси 7:5:3 - активированный уголь/оксид алюминия нейтральный/целит 545; м/м/м) до однородного состояния в шейкере (5.13) в течение 1 ч, 0,5 г однородной смеси переносят в пустые картриджи объемом 6 см³ с тремя пористыми пластинами из полиэтилена (2 пластины внизу и 1 вверху для покрытия).

В качестве альтернативы допускается также использовать доступные колонки для твердофазной экстракции. Должна быть проверена эффективность разделения этих колонок и при необходимости проведена процедура очистки.

25,0 г однородного и мелко измельченного образца (6.1) взвешивают в химическом стакане/колбе Эрленмейера объемом 250 см³ или центрифужной пробирке объемом 250 см³ (5.7) с ценой деления 0,1 г, добавляют 100 см³ экстракционной смеси (4.4) и закрывают пробку. Смесь встряхивают вручную или на шейкере (5.13) в течение 1 ч при комнатной температуре.

В качестве альтернативного способа извлечения также используют лабораторный смеситель (5.14). В этом случае смесь перемешивают до однородного состояния в течение 3 мин с высокой скоростью.

После экстракции чуть больше 10 см³ экстракта фильтруют через складчатый фильтр (5.9) в стеклянную пробирку. Это количество центрифугируют в течение 10 мин при комнатной температуре при 2500 g. Удаляют 10 см³ надосадочной жидкости.

Для сильно набухающих пищевых продуктов, в которых содержание влаги в экстракционной среде увеличивается до 200%, навеску пробы уменьшают до 50% от описанного количества. Для предотвращения комкования набухающего материала добавляют, например, морской песок (4.16) в объеме, подходящем для массы образца.

Изменение объема и/или массы учитывают при окончательном расчете.

Подготовленную колонку с 0,5 г активированного угля/оксида алюминия/целита (6.2) помещают в систему для твердофазной экстракции (5.12) и подставляют пробирку (5.15) для сбора элюата. В колонку твердофазной экстракции добавляют 5,0 см³ экстракта (6.3) и собирают полученный элюат. При этом создают небольшое разрежение, чтобы скорость элюирования достигала от 1 до 2 капель в секунду. Картридж снова промывают 5 см³ экстракционной смеси (4.4) и также собирают элюат.

25 мм³ смеси растворов внутренних стандартов токсинов (4.22) добавляют к объединенным элюатам и высушивают до сухого состояния в атмосфере азота (4.6) в системе для упаривания (5.12) (30 мин при 45 °C и давлении газа 68 947,6 Па).

Остаток повторно растворяют в 500 мкл смеси растворителей (4.3), энергично встряхивая на лабораторном шейкере в течение 60 с (5.4). При необходимости выполняют процедуру в течение 5 мин в ультразвуковой ванне (5.3) при комнатной температуре. Для удаления имеющихся микрочастиц раствор фильтруют через шприцевой фильтр (5.8) или центробежный фильтр (0,45 мкм, 0,5 см³) при минимуме 10 000 g и получают пробу для ввода.

При необходимости допускается прервать очистку образца. Экстракты образцов (сгущенные до сухого состояния) хранятся без потери аналита в течение нескольких дней при температуре 4 °C и примерно две недели при температуре минус 18 °C.

Если содержание аналитов превышает диапазон градуировки, то остаток следует растворить в смеси растворителей объемом более 500 мм³.

В зависимости от системы ВЭЖХ-МС/МС вводят пробу в объеме от 10 до 25 мм³ в соответствии с 6.4.

Применяемую систему измерения настраивают, отмеряя нужный объем аналитов и подбирая оптимальные параметры разделения и обнаружения. В приложении Б приведены некоторые примеры хроматограмм на рисунках Б.1 - Б.4, а в приложении А приведены примерные параметры.

Применяемые измерительные системы должны соответствовать требованиям, представленным в таблице 2.

Токсины T-2 и HT-2 идентифицируют в результате сравнения времени удерживания основного раствора и раствора исследуемого образца.

Аналит распознают на основе не менее двух массовых переходов. Кроме того, время удерживания (пики в обоих массовых переходах) и относительная площадь двух пиков должны совпадать с аналогичными данными стандартного вещества.

В качестве внутреннего стандарта при количественном определении токсинов T-2 и HT-2 используют соответствующий внутренний стандарт, меченый изотопом. Многоточечную градуировку выполняют с помощью внутреннего стандарта, например в соответствии с таблицей 1.

Для линейной регрессии рассматривают графическую зависимость отношения площади пиков всех аналитов и отношения соответствующей концентрации. Массовую концентрацию каждого токсина в пробе получают из линейной регрессии, выраженной в нг/мл, по уравнению

где A_a - площадь пика аналита в градуировочном растворе (4.23);

A_ВЭ - площадь пика внутреннего стандарта в градуировочном растворе (4.23);

A_cal - наклон калибровочной прямой, определяемой градуировочными растворами (4.23);

p_a - концентрации массы аналитов в градуировочных растворах (4.23), нг/см³;

p_ВЭ - концентрация внутреннего стандарта в градуировочном растворе (4.23), равная 50 нг/см³;

b_cal - точка пересечения градуировочных прямых, определяемая градуировочными растворами (4.23).

Концентрацию массы аналита в растворе образца , нг/см³, вычисляют по формуле

где - площадь (аналитический сигнал) аналита в исследуемом растворе образца;

- площадь (аналитический сигнал) внутреннего стандарта в исследуемом растворе образца;

- концентрация массы внутреннего стандарта в исследуемом растворе образца, 50 нг/см³.

Массовую долю аналита w_a, мкг/кг, вычисляют по формуле

где V_ex - объем раствора для экстракции, равный 100 см³;

V_im - объем смеси растворителей, используемых для повторного растворения сгущенной пробы, равный 0,5 см³;

m_s - масса навески, равная 25 г;

V_аликв - аликвотная доля экстракта опытного образца, равная 5 см³.

Межлабораторное испытание для определения точности метода приведено подробно в приложении В. Значения, полученные в результате подобного межлабораторного испытания, не обязательно применимы к диапазонам концентраций и матрицам, которые отличаются от приведенных в приложении В.

Абсолютная разница двух единичных результатов, полученных одним исследователем на одинаковых образцах на одном и том же оборудовании в течение минимального отрезка времени, будет превышать предел повторяемости r в таблицах 3 и 4 не чаще, чем в 5% случаев.

Абсолютная разница двух единичных результатов, полученных одним исследователем на одинаковых образцах, будет превышать предел воспроизводимости R в таблицах 3 и 4 не чаще, чем в 5% случаев (согласно ГОСТ Р ИСО 5725-1, ГОСТ Р ИСО 5725-2, ГОСТ Р ИСО 5725-3, ГОСТ Р ИСО 5725-4, ГОСТ Р ИСО 5725-5, ГОСТ Р ИСО 5725-6).

Протокол испытаний должен содержать следующие минимальные данные:

- необходимые сведения для идентификации опытного образца (вид, происхождение, наименование);

- ссылку на настоящий стандарт;

- дату и способ отбора проб (если известен);

- дату поступления пробы;

- дату проведения испытания;

- результаты испытания и единицы, в которых они указаны;

- все особые признаки, установленные во время испытания;

- все рабочие операции, не установленные этим методом или рассматриваемые как необязательные и которые могут повлиять на результаты.

Эти и все другие хроматографические настройки в А.2.1, А.3.1 и А.4.1 следует рассматривать как ориентировочные значения. Точные условия для проведения хроматографии зависят от самой лаборатории, и поэтому допускается небольшое отличие параметров. Измерение эталонных растворов должно подтвердить пригодность аналитических растворов.

Схема градиента приведена в таблице А.1.

Параметры источника и общие настройки масс-спектрометра (см. таблицу А.2).

Все последующие параметры детектора и параметры в А.2.2, А.3.2 и А.4.2 можно рассматривать в качестве ориентировочных значений. Точные условия для проведения измерений зависят от прибора, и поэтому допускается небольшое отличие параметров. Измерение стандартных растворов должно подтвердить пригодность аналитических растворов.

Специфические условия масс-спектрометрии приведены в таблице А.2.

Потенциал столкновения на выходе из ячейки

Схема градиента приведена в таблице А.3.

Параметры источника и специфические настройки масс-спектрометрии (см. таблицу А.4):

Схема градиента приведена в таблице А.5

Параметры источника и общие настройки масс-спектрометрии (см. также таблицу А.6):

Параметры источника и специфические настройки масс-спектрометрии (см. таблицу А.7):

Данный метод разработан рабочей группой "Микотоксины" Федерального ведомства по защите прав потребителей и безопасности пищевых продуктов (BVL). Он был проверен в ходе межлабораторных испытаний в 14 лабораториях на пробах овсяной муки, овсяных хлопьев и сухих завтраков с овсяными хлопьями. Данные в таблицах В.1, В.2 получены в ходе межлабораторного испытания в соответствии с серией стандартов ГОСТ Р ИСО 5725.