Лабораторная диагностика инфекционного бронхита кур проводится разными путями.

I. Выделение вируса инфекционного бронхита на развивающихся эмбрионах кур.

II. Постановка биопробы на цыплятах.

III. Постановка реакции нейтрализации вируса на развивающихся эмбрионах кур.

IV. Постановка реакции диффузионной преципитации в агаровом геле.

V. Постановка реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

1. Для лабораторного исследования направляют живых больных цыплят. В лаборатории после их убоя отбирают следующий патологический материал: гортань, трахею и легкие.

2. Полученный патологический материал растирают с песком в ступке и готовят 10%-ную суспензию на мясопептонном бульоне (МПБ). Суспензию центрифугируют в течение 15 мин при 1500 об/мин. К надосадочной жидкости добавляют пенициллин и стрептомицин по 1000 ЕД на 1 мл суспензии и оставляют при 4 °C в холодильнике в течение 1...4 ч.

3. После указанной экспозиции суспензией заражают 10...15 девятидневных эмбрионов кур в дозе по 0,2 мл в аллантоисную полость. Зараженные эмбрионы помещают в термостат при температуре 37,5 °C и дважды в день овоскопируют.

4. Погибшие эмбрионы вскрывают в день гибели после охлаждения при 4 °C в течение 2...3 ч, а оставшиеся живыми на 10-й день инкубации охлаждают в холодильнике при температуре 4 °C и также вскрывают. При вскрытии учитывают изменения эмбрионов. Признаками поражения эмбрионов вирусом инфекционного бронхита кур считаются гибель эмбрионов, а также отставание их в росте, "карликовость" и скручивание в шар.

От павших эмбрионов (гибель в первые 24 ч считают неспецифической) и от эмбрионов, отставших в росте, собирают в стерильные пробирки аллантоисную жидкость и после проверки на отсутствие бактериальной загрязненности помещают ее в холодильник при -20 °C.

5. Полевые штаммы вируса при первых пассажах на эмбрионах кур могут не вызывать их гибели, а только приводить к незначительному отставанию в росте некоторых эмбрионов. Поэтому следует проводить на эмбрионах кур до 6...10 пассажей, используя для заражения аллантоисную жидкость от эмбрионов предыдущего пассажа. При наличии вируса инфекционного бронхита с каждым пассажем увеличивается количество павших и отставших в росте эмбрионов.

6. Специфичность вируса инфекционного бронхита кур определяют постановкой реакции нейтрализации на эмбрионах кур со специфическими противобронхитными сыворотками.

7. Биопробу проводят на цыплятах 10...25-дневного возраста из благополучного по инфекционному бронхиту птицехозяйства. Десяти цыплятам интратрахеально вводят по 0,3...0,5 мл суспензии, полученной, как указано в п. 2 настоящего наставления. За цыплятами устанавливают ежедневное наблюдение в течение 7 сут, отмечая признаки заболевания.

8. При наличии в исследуемом материале вируса инфекционного бронхита кур у цыплят через 18...48 ч после заражения появляются хрипы при дыхании и чихание, затем наступает угнетение (сонливость).

9. Реакцию нейтрализации для диагностики инфекционного бронхита кур применяют при исследовании сывороток крови больных и переболевших птиц с заведомо известным антигеном. При этом исследуют смесь сывороток не менее чем от 5 птиц; при идентификации выделенного вируса с помощью специфических противобронхитных сывороток.

10. Для постановки реакции нейтрализации требуется следующее: а) испытуемые или гипериммунные сыворотки; б) нормальные куриные и кроличьи сыворотки; в) вирус инфекционного бронхита кур или испытуемый вирус; г) мясопептонный бульон (МПБ); д) антибиотики пенициллин и стрептомицин; е) 9-дневные эмбрионы кур.

11. Всю работу по постановке реакции нейтрализации проводят в стерильном боксе с соблюдением правил асептики (см. табл. 36). В штативе расставляют несколько рядов стерильных пробирок, закрытых пробками, причем количество рядов должно соответствовать числу испытуемых и контрольных сывороток, а количество пробирок в ряду - числу разведений вируса.

Примечание. <*> По этой же схеме ставят реакцию нейтрализации при идентификации выделенного вируса, используя специфические сыворотки.

12. Перед постановкой реакции все сыворотки инактивируют в течение 30 мин на водяной бане при 58 °C, после чего к ним добавляют пенициллин и стрептомицин по 1000 ЕД на 1 мл. Затем стерильными градуированными пипетками разливают сыворотки в дозе по 0,5 мл в каждую пробирку.

Готовят разведения вируса от 1:10 до 1:1 000 000 на МПБ и после того, как испытуемые и контрольные сыворотки разлиты по пробиркам, добавляют к ним по 0,5 мл соответствующего разведения вируса.

13. Смесь встряхивают и оставляют в холодильнике при температуре 4 °C на 1 ч.

14. После этого смесь инокулируют в аллантоисную полость 9-дневных эмбрионов кур в дозе по 0,2 мл. Каждой смесью заражают по 4 эмбриона. Смесь вируса с нормальной сывороткой инокулируют в последнюю очередь, а до этого хранят в холодильнике.

15. Зараженные эмбрионы инкубируют при 37,5 °C, дважды в день овоскопируют и павших вскрывают. Гибель в течение 24 ч после заражения считают неспецифической. На 10-й день инкубации оставшиеся живые эмбрионы вскрывают и регистрируют поражения.

16. Реакция нейтрализации считается положительной, если нет гибели эмбрионов и при вскрытии живых эмбрионов не будет обнаружено изменений, характерных для поражения вирусом инфекционного бронхита, т.е. размножение вируса будет подавлено антителами.

17. Учет реакции нейтрализации на эмбрионах кур проводят по следующей схеме (табл. 37).

Результаты реакции нейтрализации на эмбрионах кур выражают индексом нейтрализации.

Титр вируса инфекционного бронхита - это доза вируса, которая вызывает специфические поражения и смерть у 50% зараженных эмбрионов кур (ИД₅₀). Индекс нейтрализации - разность логарифмических показателей титров вируса в присутствии нормальной и испытуемой сывороток. Обычно он выражается в виде антилогарифма.

18. Следует считать индексы нейтрализации от 1 до 9 отрицательными, от 10 до 49 - сомнительными, а от 50 и выше - положительными.

19. Расчет индекса нейтрализации проводится по методу Рида и Менча.

20. Реакцию диффузионной преципитации применяют для ретроспективной диагностики инфекционного бронхита, для обнаружения вируса с заведомо известными антисыворотками, а также для дифференциальной диагностики респираторных инфекций, используя при этом гипериммунные преципитирующие сыворотки (куриные).

21. Для постановки реакции преципитации в агаровом геле требуется следующее: а) испытуемые сыворотки; б) преципитирующие сыворотки; в) нормальные сыворотки (куриные); г) вируссодержащие антигены; д) нормальные антигены; е) агаровые пластинки.

22. Преципитирующие сыворотки получают путем гипериммунизации кур вирусом инфекционного бронхита. В качестве вируссодержащего антигена служат хорионаллантоисные оболочки эмбрионов кур, зараженных вирусом инфекционного бронхита. Нормальные сыворотки получают от здоровой, не болевшей инфекционным бронхитом птицы, а нормальные антигены - от незараженных эмбрионов кур.

23. Агаровую среду готовят по следующей прописи: к 985 мл дистиллированной воды добавляют 15 г отечественного агара и 78,8 г хлорида натрия. Смесь автоклавируют в течение 20 мин и фильтруют через вату, после чего устанавливают с помощью 1 н. NaOH, pH 7,0. Агар разливают во флаконы, стерилизуют текучим паром в аппарате Коха и хранят при 4 °C.

24. Флаконы с агаром, не снимая пробки, разогревают на водяной бане и тотчас же разливают в стерильные обезжиренные плоскодонные чашки Петри. Высота агарового слоя - 0,5 см.

25. После того как агар застынет перед постановкой реакции, в нем делают с помощью трубочек или штампов лунки округлой формы в виде звеньев, состоящих из шести лунок по периферии и одной центральной в каждом звене. Диаметр лунок - 0,6 см, расстояние между краями лунок одного звена должно быть 0,4...0,5 см. Агаровые пыжи извлекают иглой. После извлечения пыжей дно каждой лунки заливают каплей расплавленного агара для предупреждения подтекания ингредиентов под агар.

26. В центральную лунку вносят вируссодержащий антиген, а в периферийные - испытуемые сыворотки. Для контроля вируссодержащий антиген проверяют в реакции преципитации с заведомо положительными и отрицательными сыворотками. Кроме того, параллельно в этой же чашке в другом звене лунок ставят контрольную реакцию с испытуемыми сыворотками и нормальным антигеном.

27. После заливки антигена и сывороток чашки накрывают крышками и оставляют при комнатной температуре на 24...48 ч. Специфические линии преципитации появляются между лунками с антигеном и с сыворотками через 24...48 ч, а иногда - к 72-му часу.

28. Учет и оценку реакции диффузионной преципитации проводят по степени выраженности преципитационных полос, а именно: отсутствие полос - отрицательная реакция (-), едва видимые полосы (+), слабовыраженные полосы (++), отчетливо видимые полосы (+++) и резко выраженные полосы (++++), при этом положительной реакцией считают с оценкой на (+++) и (++++).

29. При идентификации вируса в среднюю лунку помещают исследуемый антиген, а в периферические лунки - гипериммунные преципитирующие сыворотки. Параллельно ставят контроль: испытуемый антиген + нормальная сыворотка.

Оценку реакции проводят по тем же критериям.

30. Реакцию непрямой гемагглютинации применяют для ретроспективной диагностики инфекционного бронхита кур; и для ее постановки требуется следующее: а) плексигласовые доски с лунками для РГА; б) 0,9%-ный раствор хлористого натрия; в) буферные солевые растворы с pH 6,4 и 7,2; г) нормальная сыворотка кролика; д) формалин, содержащий не менее 37% формальдегида; е) водорастворимый танин; ж) эритроциты барана; з) гипериммунная куриная сыворотка к вирусу инфекционного бронхита; и) нормальная куриная сыворотка; к) вирус инфекционного бронхита.

31. Вирус инфекционного бронхита получают на 8...10-дневных куриных эмбрионах. С этой целью берут известный штамм вируса инфекционного бронхита (типа Массачусетс или Коннектикут) и вводят в аллантоисную полость развивающихся куриных эмбрионов в дозе 0,2 мл. Зараженные эмбрионы помещают в термостат при 37,5 °C и инкубируют в течение 2...3 сут. После этого их помещают в холодильник при 4 °C на 12 ч для охлаждения. Охлажденные эмбрионы вскрывают и от них собирают экстраэмбриональную жидкость, которую проверяют на стерильность и хранят в замороженном состоянии в течение месяца.

32. Фосфатные буферные растворы готовят на 0,9%-ном растворе хлористого натрия путем смешивания 0,15 М раствора NaH₂PO₄ (безводный, 21,3 г на 1 л) и 0,15 М раствора Na₂HPO₄ (23,39 г на 1 л). Растворы смешивают в вышеуказанных количествах (табл. 38).

Примечание. После смешивания общий объем доводят до 200 мл путем добавления физраствора.

33. Для получения эритроцитов берут кровь здорового барана, дефибринируют, фильтруют через три слоя марли и центрифугируют. Осадок эритроцитов трижды промывают физиологическим раствором, pH 7,2.

34. Для формалинизации эритроцитов готовят на физиологическом растворе, pH 7,2, 10%-ную взвесь эритроцитов и 5%-ный раствор формалина и смешивают их в равных объемах. Смесь выдерживают в течение суток в термостате при 37 °C. При этом необходимо несколько раз встряхивать. Через 24 ч смесь центрифугируют, осадок эритроцитов пятикратно отмывают физиологическим раствором и в виде 10%-ной взвеси в физрастворе с добавлением формалина 1:1000 хранят при 4 °C в течение 11 мес.

35. Обработку эритроцитов проводят танином, хорошо растворяющимся в воде. С этой целью готовят основное разведение танина 1:100 на бидистиллированной воде. Основной раствор танина можно хранить при 4 °C в течение 1 мес. Из основного разведения готовят рабочее разведение танина 1:20 000 на фосфатном буфере, pH 7,2. Затем к осадку формалинизированных эритроцитов добавляют рабочее разведение танина в соотношении 1:10. Смесь выдерживают на водяной бане при 37 °C в течение 15 мин, за этот период ее встряхивают 3...4 раза. Танизированные эритроциты отмывают от избытка танина фосфатным буфером, pH 7,2, и хранят в виде 10%-ной взвеси в буферном растворе до 1 мес.

36. Формалинизированные и танизированные эритроциты сенсибилизируют вирусом инфекционного бронхита. С этой целью вируссодержащую аллантоисную жидкость оттаивают (размораживают), центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость смешивают с осадком формалинизированных и танизированных эритроцитов в соотношении 1:10 (одна часть осадка эритроцитов и 10 частей вируссодержащей жидкости). Сюда же добавляют четырехкратный объем фосфатного буфера, pH 6,4. Смесь выдерживают на водяной бане при 37 °C в течение 15 мин. За этот период ее встряхивают 3...4 раза.

Сенсибилизированные эритроциты двукратно отмывают физиологическим раствором, содержащим 1% нормальной кроличьей сыворотки. Сенсибилизированные эритроциты в виде 1,5%-ной взвеси в физиологическом растворе с 1%-ной нормальной кроличьей сывороткой хранят при 4 °C в течение 1 мес.

37. Нормальную кроличью сыворотку получают из крови кролика, которую берут из сердца. Сыворотка не должна иметь следов гемолиза эритроцитов. Кроличью сыворотку инактивируют в водяной бане при 56 °C в течение 30 мин и истощают формалинизированными и танизированными эритроцитами. С этой целью к 10 объемам сыворотки добавляют 1 объем осадка эритроцитов, тщательно перемешивают и выдерживают на водяной бане при 37 °C в течение 30 мин, затем центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 15 мин, сливают и хранят в течение 3 мес.

38. В главный опыт реакции непрямой гемагглютинации берут эритроциты, которые дают равномерную гомогенную взвесь без наличия гемолиза и спонтанной агглютинации.

Реакцию ставят на плексигласовых досках. Из испытуемых сывороток готовят последовательно двукратные разведения на физиологическом растворе, содержащем 1% нормальной кроличьей сыворотки, в объеме 0,2 мл. Для этого в каждую лунку наливают 0,2 мл физиологического раствора с 1% нормальной кроличьей сыворотки. В первую лунку вносят 0,2 мл испытуемой сыворотки, тщательно перемешивают и 0,2 мл смеси переносят в следующую лунку и т.д. Из последней лунки после тщательного перемешивания 0,2 мл смеси удаляют в дезраствор.

В каждую лунку с соответствующим разведением сыворотки добавляют по 0,2 мл 1,5%-ной взвеси формалинизированных, танизированных и сенсибилизированных вирусом эритроцитов и тщательно перемешивают.

Реакцию выдерживают при комнатной температуре в течение 3...4 ч.

При постановке реакции включают следующие контроли: а) контроль формалинизированных, танизированных и сенсибилизированных эритроцитов - 0,2 мл физиологического раствора, содержащего 1% нормальной кроличьей сыворотки, + 0,2 мл 1,5%-ной взвеси формалинизированных, танизированных и сенсибилизированных эритроцитов; б) отрицательный контроль - заведомо отрицательная сыворотка + 0,2 мл 1,5%-ной взвеси формалинизированных, танизированных и сенсибилизированных эритроцитов; в) положительный контроль - заведомо положительная сыворотка 0,2 мл + 0,2 мл 1,5%-ной взвеси формалинизированных, танизированных и сенсибилизированных эритроцитов.

39. Реакцию учитывают в том случае, когда контроли 1, 2 - отрицательны, а контроль 3 - положителен.

Учет реакции производят через 3...4 ч после постановки опыта и оценивают по 4-балльной системе (в крестах).

Реакция характеризуется появлением осадка эритроцитов в виде зонтика с ровными или зубчатыми краями и обозначается 4 крестами (++++). Если зонтик покрывает 2/3 дна лунки, ставят 3 креста (+++), если покрывает 1/2 дна лунки, то ставят 2 креста (++).

При агглютинации эритроцитов испытуемыми сыворотками в разведении 1:16 и выше (с оценкой не ниже чем на 3 креста) реакцию считают положительной, в разведении 1:8 - сомнительной и ниже чем 1:8 - отрицательной. Отрицательная реакция характеризуется выпадением эритроцитов в осадок в виде маленькой пуговицы с ровными краями.

40. Все этапы работ по диагностике инфекционного бронхита кур, проводимые в соответствии с разделами I, II, III, IV и V, заносят в специальный журнал.

Дифференциальный диагноз. Инфекционный бронхит необходимо дифференцировать от других вирусных заболеваний, протекающих с поражением респираторного тракта (микоплазмоз, инфекционный ларинготрахеит, оспа, ньюкаслская болезнь).

Для выделения микоплазм делают посевы на специальные питательные среды согласно наставлению по лабораторной диагностике микоплазмоза, утвержденному Главветупром Минсельхоза СССР.

Инфекционный ларинготрахеит дифференцируют путем заражения эмбрионов кур на хорионаллантоисную оболочку и постановки реакции нейтрализации согласно наставлению по лабораторной диагностике инфекционного ларинготрахеита, утвержденному Главветупром Минсельхоза СССР.

Оспу дифференцируют путем постановки биопробы на цыплятах.

Для исключения ньюкаслской болезни ставят реакцию гемагглютинации (РГА). Вирус ньюкаслской болезни обладает гемагглютинирующими свойствами. Специфичность РГА подтверждается реакцией гемагглютинации со специфической сывороткой (1).