Возбудитель относится к группе герпес, содержит ДНК, его размер 250 нм.

Материал для исследования: трупы кур, паренхиматозные органы, трахеи, гортани, выделения из трахеи и гортани, сыворотка крови.

Микроскопические исследования: мазки-соскобы с конъюнктивы, гортани и трахеи павших или клинически больных кур в ранней стадии заболевания высушивают на воздухе, фиксируют спирт-эфиром в течение 20 мин и окрашивают раствором краски Гимза (1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды) при 37 °C в течение 2 ч или при комнатной температуре 12 ... 18 ч. Затем мазки промывают водой, обесцвечивают, быстро погружая в метиловый спирт, снова промывают водой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Ацидофильные включения обнаруживают в ядрах клеток. Ядро с включениями увеличено, с более темной окраской - стенки ядра. Цитоплазма пораженной клетки - голубая, ядро - темно-фиолетовое, а включение - красное с розовым оттенком. Вокруг включения наблюдается неокрашенная зона. Включения имеют разнообразную форму (круглую, вытянутую, треугольную).

Выделение вируса инфекционного ларинготрахеита на куриных эмбрионах. При вскрытии павших или вынужденно убитых кур отбирают пораженные гортань, трахею, конъюнктиву. Собранный материал гомогенизируют с физиологическим раствором в разведении 1:10, центрифугируют при 1 ... 1,5 тыс. об/мин в течение 10 мин. Далее к надосадочной жидкости добавляют антибиотики по 1000 ЕД (стрептомицина и пенициллина) на 1 мл суспензии. Материал выдерживают в течение 3 ... 12 ч при температуре 2 ... 4 °C и заражают им 9 ... 12-дневных куриных эмбрионов.

Эмбрионы заражают нанесением суспензии на хорионаллантоисную мембрану в дозе 0,2 мл по принятой методике. Зараженных эмбрионов помещают в термостат при температуре 37 °C на 5 ... 6 сут, при этом их ежедневно просматривают на овоскопе. Всех погибших эмбрионов вскрывают в день гибели, а оставшихся живыми - на 5-й день после заражения, предварительно охладив их в течение 2 ... 3 ч при температуре 4 °C. В стерильные пробирки с растертым стеклом отдельно помещают измененные хорионаллантоисные оболочки вместе с эмбриональной жидкостью. Из каждого эмбриона делают высевы одновременно на МПА и МПБ.

Пораженные вирусом хорионаллантоисные оболочки после бактериологического контроля тщательно гомогенизируют в пробирках со стеклом. Гомогенат из отдельных пробирок объединяют в общий флакон, а затем расфасовывают по 1 ... 2 мл в ампулы, которые хранят при температуре 10 ... 12 °C. Вирус инфекционного ларинготрахеита вызывает на 4 ... 5-й день инкубации на хорионаллантоисной мембране зараженных куриных эмбрионов появление многочисленных беловатых узелков или крупных некротических очагов с зоной отека на месте введения.

Специфичность вируса инфекционного ларинготрахеита определяют постановкой биопробы и реакцией нейтрализации на куриных эмбрионах с заведомо позитивными сыворотками.

Биопробу ставят на восприимчивой птице 30 ... 40-дневного возраста нанесением вирусного материала по 0,5 мл на слизистую трахеи и слегка ее скарифицируя, а на 3 ... 5-месячной птице - путем нанесения вируса на слизистую клоаки.

За птицей устанавливают ежедневное наблюдение в течение 10 ... 14 сут, отмечая клинические признаки болезни (кашель, хрипы, поражение гортани, ринит). У птиц, зараженных в клоаку, учитывают наличие "клоачной пробы".

От павших и клинически больных кур в ранней стадии заболевания делают мазки-соскобы со слизистой пораженной трахеи, конъюнктивы. Мазки окрашивают краской Гимзы (1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды) при 37 °C в течение 2 ч или при комнатной температуре в течение 12 ... 18 ч. После этого мазки промывают водой, обесцвечивают (быстрым погружением мазка в метиловый спирт), промывают водой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Ацидофильные включения обнаруживают в ядре пораженной клетки. Обычно ядро с включением увеличено, с более темной окраской стенки. Цитоплазма зараженной клетки окрашивается в голубой цвет, ядро - в темно-фиолетовый, а включения - в красный с розовым оттенком. Вокруг включения наблюдается неокрашенная зона. Включения имеют разнообразную форму (круглую, вытянутую, треугольную).

Для исключения вируса оспы кур, вызывающего на хорионаллантоисной мембране поражения, сходные с поражениями вирусом инфекционного ларинготрахеита, заражают цыплят 30 ... 60-дневного возраста (ранее не привитых против оспы птиц) в гортань, перьевые фолликулы голени и гребешок. Оспенная реакция у зараженной птицы проявляется на 6 ... 8-й день припуханием и покраснением фолликул и образованием ложных дифтеритических наложений в ротовой полости. При вирусоскопии по Морозову в мазках из развившихся фолликул обычно обнаруживают оспенные элементарные тельца.

Постановка реакции нейтрализации вируса инфекционного ларинготрахеита кур. Реакцию нейтрализации при диагностике на инфекционный ларинготрахеит с испытуемыми сыворотками от переболевшей птицы применяют для установления природы наблюдавшейся инфекции, дифференциальной диагностики атипичных случаев заболевания, проявляющихся клиническими признаками поражения респираторных органов.

Для этого проводят типизирование выделяемых штаммов вируса инфекционного ларинготрахеита, используя различные гипериммунные кроличьи сыворотки.

Для постановки реакции нейтрализации требуется следующая лабораторная посуда и компоненты: пробирки Флоринского, бактериологические пробирки, резиновые пробки N 12 и 14, градуированные пипетки, штативы 100- и 40-гнездные, антибиотики (пенициллин и стрептомицин), 9 ... 12-дневные куриные эмбрионы.

В штативе расставляют несколько рядов стерильных пробирок, закрытых стерильными пробками, причем количество рядов должно соответствовать числу испытуемых сывороток, а количество пробирок в одном ряду - числу разведений вируса.

Сухими стерильными пипетками в стерильные пробирки разливают испытуемые сыворотки в дозе 0,5 мл в каждую пробирку. Параллельно для контроля разливают нормальную сыворотку (кроличья или куриная в той же дозе). Предварительно все сыворотки инактивируют при 56 °C 30 мин. После того как испытуемые сыворотки разлиты, к ним и контрольным сывороткам добавляют в разном объеме (по 0,5 мл) разведения вируса: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10 000. Вирус можно добавлять одной пипеткой при условии, если начинать разливать с наибольшего разведения.

Реакцию нейтрализации вируса инфекционного ларинготрахеита кур ставят по таблице 45.

Обозначения: (+) - поражения хорионаллантоисной оболочки, характерные для вируса инфекционного ларинготрахеита; (-) - отсутствие поражений хорионаллантоисной оболочки.

Смесь встряхивают и помещают в холодильник при температуре 2 ... 4 °C на 1 ... 2 ч. После этого смесь инокулируют на хорионаллантоисную оболочку 10 ... 12-дневных куриных эмбрионов в дозе по 0,2 мл. Каждым разведением смеси вируса с сывороткой заражают по 4 эмбриона. Зараженные куриные эмбрионы инкубируют при температуре 37 °C. На 5-й день после заражения эмбрионы вскрывают и регистрируют специфические поражения хорионаллантоиса.

Реакция нейтрализации на куриных эмбрионах считается положительной, если в эмбрионе (инокулированном смесью вируса с гипериммунной сывороткой) не будут обнаружены фокусы поражения на хорионаллантоисе, т.е. размножение вируса будет подавлено антителами. Результаты реакции нейтрализации выражаются индексом нейтрализации. Реакцию нейтрализации на куриных эмбрионах учитывают по таблице 46.

Титр вируса инфекционного ларинготрахеита - это доза, которая вызывает специфическое поражение хорионаллантоисной оболочки у 50% зараженных куриных эмбрионов (ИД₅₀). Индекс нейтрализации представляет собой разность логарифмических показателей титров вируса в присутствии нормальной и иммунной сывороток.

Как видно из таблицы 46, разность логарифмических показателей титра вируса в присутствии нормальной и гипериммунной кроличьих сывороток была равна 3. Найденное по таблице 2 антилогарифмов число и будет индексом нейтрализации. В данном случае оно равно 1000. Следует считать индексы нейтрализации 1 ... 9 отрицательными, 10 ... 49 - сомнительными, а от 50 и выше - положительными.

Для определения индекса нейтрализации необходимо предварительно освоить метод статистического учета результатов титрования вируса инфекционного ларинготрахеита на хорионаллантоисе куриного эмбриона.

Ниже приводится пример статистической обработки одного опыта титрования штамма вируса инфекционного ларинготрахеита (табл. 47).

При титровании вируса процент инфекционности его возрастает прямо пропорционально не абсолютным величинам испытуемых доз, а их логарифмам.

Титр вируса вычисляют по следующей формуле:

где X - титр вируса; Y - процент инфекционности при высшей критической дозе; Z - процент инфекционности при низшей критической дозе; .

В нашем примере титр вируса инфекционного ларинготрахеита равен 3,5 в 0,1 мл или 4,5 в 1 мл.

Реакция преципитации в агаровом геле. В реакции используют пластинки с луночками и чашки Петри. Агар готовят по общепринятой методике. Луночки заполняют антигенами и сыворотками по 0,2 мл каждую. В одну луночку в каждой чашке наливают сыворотку, а в остальные - различные антигены, в том числе один контрольный (нормальная аллантоисная жидкость, взвесь незараженной хорионаллантоисной мембраны, раствор, на котором приготовлен антиген).

Чашки оставляют при комнатной температуре или в термостате при 37 °C и ежедневно в течение 3 сут наблюдают за появлением линий преципитации.

Метод флуоресцирующих антител. Мазки-отпечатки из пораженного хорионаллантоиса, культуры ткани фибробластов куриного эмбриона, мазки со слизистой трахеи, конъюнктивы больной птицы окрашивают по общепринятой методике специфическими иммунофлуоресцентными сыворотками.

Результаты иммунофлуоресценции оценивают в крестах в зависимости от интенсивности свечения и количества флуоресцирующих клеток. Положительная иммунофлуоресценция в мазках от больной птицы наблюдается в остром периоде заболевания, когда обнаруживают внутриядерные включения и можно выделить вирус на куриных эмбрионах (1).