1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Министерством высшего и среднего специального образования СССР.

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 25 марта 1988 г. N 754.

3. ВЗАМЕН ГОСТ 9.052-75.

4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

5. Ограничение срока действия снято по протоколу N 3-93 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 5-6-93)

6. ПЕРЕИЗДАНИЕ.

Настоящий стандарт распространяется на масла и смазки и устанавливает методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов:

1 - для установления грибостойкости масел и смазок при отсутствии минеральных и органических загрязнений;

2 - для установления грибостойкости смазок в условиях, имитирующих минеральные загрязнения;

3 - для установления грибостойкости масел в условиях, имитирующих минеральные загрязнения;

4 - для установления грибостойкости масел и смазок в условиях, имитирующих минеральные и органические загрязнения.

Смазки, применяемые для оптических приборов, испытывают только методом 1.

Методы применяют при испытании масел и смазок, к которым в стандартах или технических условиях предъявляют требования грибостойкости.

1.1. Сущность метода заключается в выдерживании образцов, зараженных водной суспензией спор грибов, в условиях, оптимальных для развития грибов, без дополнительного источника минерального и органического питания.

1.2. Отбор образцов

1.2.1. Масла и смазки отбирают по ГОСТ 2517 массой 10 - 15 г.

1.2.2. Образцами являются масла и смазки в состоянии поставки, без специальной очистки и стерилизации.

1.2.3. Количество параллельных образцов должно быть не менее пяти.

1.3. Виды грибов

1.3.1. Для испытаний применяют чистые культуры следующих видов плесневых грибов:

Aspergillus niger van Tieghem

Penicillium chrysogenum Thom

Penicillium cyclopium Westling

Scopulariopsis brevicaulis (Sacc.) Bainier

Paecilomyces varioti Bainier

1.3.2. Культуры грибов получают в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, поддерживают периодическим пересевом и выращивают непосредственно перед испытаниями.

1.3.3. Пересев, выращивание и хранение культур грибов - по ГОСТ 9.048.

1.4. Аппаратура, материалы и реактивы - по ГОСТ 9.048.

1.5. Подготовка к испытаниям

1.5.1. Посуду и материалы готовят по ГОСТ 9.048.

1.5.2. Среды для выращивания, хранения культур грибов и для испытаний готовят по ГОСТ 9.048.

Рецептура сред приведена в таблице.

1.5.3. Чистые культуры грибов пересевают и выращивают по ГОСТ 9.048, используя грибы, приведенные в п. 1.3.1.

1.5.4. Для размещения образцов масел в чашку Петри наливают 20 - 30 см³ среды 3 и дают ей застыть. В застывшей среде просверливают пять лунок глубиной около 5 мм с помощью стерильного сверла диаметром 10 мм и наливают образцы масел на 1 мм ниже уровня среды.

Образцы смазок наносят на предметные стекла, покрывая всю поверхность слоем 1,5 - 2,0 мм, и помещают в чашки Петри.

1.5.5. Контроль жизнеспособности спор грибов проводят по ГОСТ 9.048.

Для контроля жизнеспособности спор грибов в чашку Петри наливают среду 1 или 4 в количестве 20 - 30 см³ и дают ей застыть.

1.6. Проведение испытаний

1.6.1. Водную суспензию спор грибов готовят по ГОСТ 9.048, используя грибы, выращенные, как указано в п. 1.5.3.

1.6.2. Предметные стекла в чашках Петри, чашки Петри с образцами масел помещают в бокс. Поверхность образцов заражают водной суспензией спор грибов с помощью пульверизатора, не допуская слияния капель.

1.6.3. Образцы масел и смазок после заражения выдерживают 1 - 2 ч при температуре (25 +/- 10) °C.

1.6.4. Предметные стекла в чашках Петри и чашки Петри с зараженными образцами и средами помещают в эксикатор, на дно которого налита вода. Эксикатор устанавливают в термостат с температурой (29 +/- 2) °C.

1.6.5. Образцы выдерживают в термостате 56 сут.

1.6.6. Через 3 - 7 сут после начала испытаний осматривают контрольную чашку Петри. Если на поверхности среды развитие грибов не наблюдается, споры грибов считают нежизнеспособными. Испытания прекращают и повторяют их на новых образцах с вновь приготовленной суспензией спор из новой партии грибов.

1.6.7. Через 28 сут производят промежуточный осмотр образцов. Испытания образцов, на которых обнаруживают развитие грибов, прекращают.

1.6.8. По окончании испытаний предметные стекла в чашках Петри и чашки Петри извлекают из эксикатора и осматривают образцы.

1.7. Обработка результатов

1.7.1. Образцы смазок и масел осматривают под микроскопом при 50 - 60-кратном увеличении.

1.7.2. Масла и смазки считают грибостойкими при отсутствии развития грибов на всех испытанных образцах.

2.1. Сущность метода заключается в выдерживании образцов, зараженных суспензией спор грибов в водном растворе минеральных солей, в условиях, оптимальных для развития грибов, на среде с дополнительным источником минерального питания.

2.2. Отбор образцов - по п. 1.2.

2.3. Виды грибов - по п. 1.3.

2.4. Аппаратура, материалы и реактивы - по ГОСТ 9.048.

2.5. Подготовка к испытаниям - по пп. 1.5.1 - 1.5.3, 1.5.5.

2.5.1. Для размещения образцов смазок среду 2 наливают в чашку Петри в количестве 20 - 30 см³ и дают ей застыть.

2.6. Проведение испытаний

2.6.1. Суспензию спор грибов в среде 5 готовят по ГОСТ 9.048.

2.6.2. Смазки наносят скальпелем в количестве пяти образцов размером 10·10 мм толщиной 1,5 - 2,0 мм на поверхность среды в чашку Петри, подготовленную, как указано в п. 2.5.1.

2.6.3. Дальнейший порядок проведения испытаний соответствует требованиям пп. 1.6.2 - 1.6.4.

2.6.4. Образцы выдерживают в течение 28 сут.

2.6.5. Дальнейший порядок проведения испытаний - по пп. 1.6.6 - 1.6.8 с промежуточным осмотром образцов через 14 сут.

2.7. Обработка результатов - по пп. 1.7.1, 1.7.2.

3.1. Сущность метода заключается в выдерживании образцов, зараженных суспензией спор грибов в водном растворе минеральных солей, в условиях, оптимальных для развития грибов, на среде с дополнительным источником минерального питания.

3.2. Отбор образцов - по п. 1.2.

3.3. Виды грибов - по п. 1.3.

3.4. Аппаратура, материалы и реактивы - по ГОСТ 9.048.

3.5. Подготовка к испытаниям - по пп. 1.5.1 - 1.5.3 и 1.5.5.

3.5.1. Для размещения образцов масел готовят пробирки с 2 - 3 см³ суспензии спор грибов в среде 5.

3.5.2. Контролем служит суспензия спор грибов в среде 5.

3.6. Проведение испытаний

3.6.1. Суспензию спор грибов в среде 5 готовят по ГОСТ 9.048.

3.6.2. Образцы масел в количестве 2 см³ вносят не менее чем в пять пробирок, приготовленных, как указано в п. 3.5.1.

3.6.3. Пробирки помещают в наклонном положении под углом 30° и выдерживают в термостате при температуре (29 +/- 2) °C.

3.6.4. Пробирки с образцами выдерживают в термостате 10 сут.

3.6.5. Через 5 и 7 сут осматривают образцы. Допускается отбирать пробы минеральной среды из пробирок для оценки грибостойкости биолюминесцентным методом, при этом пробирки с образцами выдерживают в термостате 3 и 5 сут.

При появлении признаков развития грибов в образцах испытания прекращают.

3.6.6. По окончании испытаний пробирки с образцами извлекают из термостата и осматривают невооруженным глазом или с помощью лупы при 2,5 - 5,0-кратном увеличении.

3.7. Обработка результатов

3.7.1. Масла считаются грибостойкими, если отсутствует развитие грибов на всех испытанных образцах (отсутствует пленка на границе раздела среда-масло, в пробирках среда прозрачна и не пигментирована, нет осадка).

3.7.2. Масла считаются не стойкими к плесневым грибам, если на образцах наблюдается развитие грибов, признаком которого служит образование пленки на границе раздела среда-масло, помутнение и пигментация среды, образование осадка.

3.7.3. Допускается оценивать грибостойкость масел биолюминесцентным методом, приведенным в приложении.

4.1. Сущность метода заключается в выдерживании образцов, зараженных суспензией спор грибов в водном растворе минеральных солей, в условиях, оптимальных для развития грибов, на среде с дополнительным источником минерального и органического питания.

4.2. Отбор образцов - по п. 1.2.

4.3. Виды грибов - по п. 1.3.

4.4. Аппаратура, материалы и реактивы - по ГОСТ 9.048.

4.5. Подготовка к испытаниям - по пп. 1.5.1 - 1.5.3, 1.5.5.

4.5.1. Для размещения образцов смазок готовят чашки Петри, как указано в п. 2.5.1, используя среду 1 или 4.

4.5.2. Для размещения образцов масел готовят лунки, как указано в п. 1.5.4, используя среду 1 или 4.

4.6. Проведение испытаний - по п. 2.6.

4.6.1. Образцы выдерживают в термостате в условиях, приведенных в п. 1.6.4, 14 сут.

4.6.2. Промежуточный осмотр образцов производят через 7 сут после начала испытаний.

4.7. Обработка результатов - по пп. 1.7.1 и 1.7.2.

Сущность метода заключается в определении количества внутриклеточной аденозин-5'-трифосфорной кислоты динатриевой соли (АТФ) в минеральной среде после испытания масел на грибостойкость (п. 3.6.5) с помощью специфической ферментативной хемилюминесцентной реакции с использованием люциферин-люциферазной системы светляков. Интенсивность излучаемого свечения прямо пропорциональна концентрации АТФ. Концентрация АТФ пропорциональна количеству живых клеток, так как ее содержание во всех типах живых клеток примерно одинаково и составляет 1 - 10 мг/г сухого веса. Этот факт является основой биолюминесцентного метода определения биомассы.

Хемилюминометр медицинский ДЛИ 31.560.000, предназначенный для измерения интенсивности сверхслабого свечения в области спектра 400 - 600 нм. Допускается использовать другие приборы аналогичного назначения, обеспечивающие измерение световых потоков от 10⁴ до 10⁸ квант/с.

Весы для статического взвешивания по ГОСТ 29329.

Термостат, обеспечивающий температуру нагрева до 200 °C.

Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 16317.

Дозатор для отбора проб 0,1 см³.

Лабораторный pH-метр.

Пробирки стеклянные по ГОСТ 25336.

Колбы цилиндрические мензурные вместимостью 25 см³ по ГОСТ 1770.

Пипетки вместимостью 1, 10 см³.

Аденозин-5'-трифосфорной кислоты динатриевая соль, 3-водная (АТФ).

Люцифераза светляков.

Люциферин.

Диметилсульфоксид (ДМСО), х.ч.

Трис-(оксиметил)-аминометан, х.ч.

Кислота уксусная, х.ч. по ГОСТ 61.

Магний сернокислый, 7-водный, х.ч. по ГОСТ 4523.

Соль динатриевая этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, 2-водная (трилон Б) (ЭДТА) по ГОСТ 10652.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

2.1. Стерилизуют посуду по ГОСТ 9.048.

2.2. Готовят раствор АТФ 1 ммоль/дм³: 13,8 мг АТФ помещают в мерную колбу вместимостью 25 см³, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения. Раствор АТФ 1 ммоль/дм³ разливают на порции объемом 1 см³ и хранят при температуре минус 20 °C. В замороженном виде раствор АТФ допускается хранить не более 3 мес.

2.3. Готовят стандартный раствор АТФ 10 мкмоль/дм³: порцию раствора АТФ 1 ммоль/дм³ (по п. 2.2) размораживают, отбирают с помощью дозатора 0,1 см³ раствора и помещают его в пробирку, содержащую 10 см³ дистиллированной воды. Раствор АТФ 10 мкмоль/дм³ готовят непосредственно перед применением.

2.4. Готовят 20%-ный раствор уксусной кислоты: 10 см³ уксусной кислоты разбавляют 40 см³ дистиллированной воды.

2.5. Готовят 0,1 моль/дм³ трис-ацетатный буферный раствор с pH - 7,6, содержащий 10 ммоль/дм³ сернокислого магния, 2 ммоль/дм³ ЭДТА: в мерную колбу вместимостью 50 см³ загружают 0,605 г трис-(оксиметил)-аминометана, 0,123 г сернокислого магния, 0,036 г ЭДТА, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения. Затем все содержимое колбы переносят в стакан вместимостью 100 см³ и титруют 20%-ным раствором уксусной кислоты до pH - 7,8.

2.6. Готовят раствор люциферазы: 10 мг люциферазы растворяют в 10 см³ 0,1 моль/дм³ трис-ацетатном буферном растворе (п. 2.5). Приготовленный раствор люциферазы хранят во льду.

2.7. Готовят раствор люциферина: 3 мг люциферина растворяют в 10 см³ 0,1 моль/дм³ трис-ацетатного буферного раствора (п. 2.5).

2.8. Готовят экстракт клеток: отбирают из пробирок с образцами после выдержки их в термостате 3 и 5 сут (п. 3.6.5) пробу минеральной среды объемом 0,1 см³ и добавляют ее в пробирку к 0,9 см³ диметилсульфоксида (ДМСО). Смесь перемешивают встряхиванием в течение 1 - 2 мин. Экстракт пригоден для анализа в течение 1 сут.

3.1. Помещают в кювету люминометра с помощью дозатора последовательно 0,1 см³ раствора люциферина, 0,1 см³ раствора люциферазы, 0,7 см³ трис-ацетатного буферного раствора и регистрируют интенсивность фонового свечения I_фон в милливольтах.

3.2. Добавляют в ту же кювету дозатором 0,1 см³ экстракта клеток (п. 2.8), перемешивают и регистрируют сигнал интенсивности люминесценции I₁.

3.3. Добавляют в ту же кювету 0,02 см³ стандартного раствора АТФ (п. 2.3) и регистрируют сигнал интенсивности люминесценции I₂.

4.1. Интенсивность люминесценции образца (I_обр) в милливольтах вычисляют по формуле

4.2. Интенсивность люминесценции стандартного раствора АТФ (I_ст) в милливольтах вычисляют по формуле

4.3. Концентрация АТФ [АТФ]_обр в микромолях в образце вычисляют по формуле

где V - объем экстракта клеток, равный 0,1 см³;

V₁ - объем реакционной смеси до добавления стандартного раствора АТФ, равный 1 см³;

V₂ - объем реакционной смеси после добавления стандартного раствора АТФ, равный 1,02 см³;

V_ст - объем добавленного стандартного раствора АТФ, равный 0,02 см³;

[АТФ]_ст - концентрация АТФ в стандартном растворе, равная 10 мкмоль;

10 - коэффициент, учитывающий разбавление пробы образца при экстракции клеток диметилсульфоксидом в 10 раз.

При упрощении формула (3) приобретает вид:

4.4. Масла являются грибостойкими, если концентрация АТФ меньше или равна 10^-7 моль, масла не грибостойки, если концентрация АТФ в образцах больше 10^-7 моль.