Н.Г. Осидзе, д-р биол. наук; В.И. Смоленский, канд. вет. наук

Настоящий стандарт распространяется на сельскохозяйственную, синантропную, дикую и экзотическую птицу и устанавливает методы лабораторной диагностики гриппа.

1.1. Для проведения исследований отбирают пробы патологического материала:

головной мозг и селезенку или гортанные и клоакальные смывы от больной птицы в первые два дня заболевания или от птицы в агональном состоянии. Патологический материал помещают в термос со льдом или раствор глицерина с массовой долей 50%, приготовленный на физиологическом растворе с pH 7,2 - 7,4;

сыворотку крови больной и переболевшей птицы в количестве 1 - 2 см³ (не менее 20 проб).

1.2. Пробы крови для определения антител в сыворотке берут стерильно из подкрыльцовой вены в пробирки, увлажненные физиологическим раствором. Кровь выдерживают до образования сгустка при комнатной температуре или термостате при 37 °C в течение 1 - 2 ч, затем осторожно обводят иглой или пастеровской пипеткой по стенке пробирки и оставляют на 16 - 18 ч при температуре 2 - 4 °C. Образовавшуюся прозрачную без гемолиза сыворотку отсасывают пипеткой в стерильные пробирки.

Для ретроспективной диагностики используют парные пробы сывороток крови, полученные от больных и подозреваемых в заболевании птиц в начале заболевания и через 4 - 10 сут.

1.3. Пробы патологического материала и сывороток крови доставляют в лабораторию в термосе со льдом. К пробам прилагают сопроводительный документ, содержащий сведения о клинике, эпизоотологии заболевания, а также данные о результатах вскрытия трупов.

1.4. До начала лабораторного исследования патологический материал хранят в рефрижераторе при температуре 2 - 4 °C не более 24 ч.

1.5. Сыворотку крови исследуют в течение 3 сут со дня взятия крови. В случае исследования сыворотки в более поздние сроки ее замораживают или консервируют путем добавления мертиолата натрия до концентрации 1:10000.

2.1. Метод выделения вируса

Сущность метода заключается в выделении вируса на эмбрионах кур и последующей его идентификации.

2.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Термостат с температурой нагрева 37 - 38 °C.

Центрифуга с частотой вращения 3000^-1.

Центрифужные стаканы вместимостью 50 - 100 см³.

Весы лабораторные с погрешностью взвешивания не более 0,1 г.

Размельчитель тканей.

Овоскоп.

Колбы конические стеклянные вместимостью 100 см³ по ГОСТ 1770.

Пробирки стеклянные вместимостью 10, 15, 20 см³ по ГОСТ 25336.

Пипетки пастеровские или пипетки стеклянные измерительные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см³ по ГОСТ 20292.

Ступка фарфоровая.

Шприцы с иглами.

Стекло кварцевое.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233, раствор с массовой долей 0,8% или другие дезинфицирующие средства.

Натрий лимонно-кислый 3-х замещенный по ГОСТ 22280, раствор с массовой долей 5%.

Йод по ГОСТ 4159, раствор с массовой долей 5% на физиологическом растворе.

Антибиотики - пенициллин и стрептомицин.

Среды питательные МПБ и МПА.

Парафин.

Развивающиеся эмбрионы кур 9 - 10-суточного возраста.

Эритроциты кур на физиологическом растворе, 0,7 и 1%-ная взвесь, которую готовят следующим образом: кровь берут у петухов или кур в возрасте старше 6 мес из подкрыльцовой вены в колбу с физиологическим раствором в равных объемах с раствором лимонно-кислого натрия.

Полученную кровь трижды отмывают физиологическим раствором, осаждая эритроциты центрифугированием с частотой вращения 1500^-1 в течение 10 мин. Из осадка эритроцитов готовят 0,7 или 1%-ную суспензию на физиологическом растворе и хранят не более 5 сут при температуре 4 °C.

2.1.2. Подготовка к исследованию.

2.1.2.1. Обработка органов патологического материала

Патологический материал стерильно извлекают из глицеринового раствора, трехкратно ополаскивают стерильным физиологическим раствором и гомогенизируют с помощью размельчителя тканей или размельчают в ступке с кварцевым стеклом. Гомогенат разводят 1:10 стерильным физиологическим раствором и центрифугируют с частотой вращения 1500 - 2000^-1 в течение 15 мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильные пробирки, добавляют 1000 ед/см³ стрептомицина и выдерживают при комнатной температуре 60 мин.

2.1.3. Проведение исследования

Для исследования одной пробы материала (надосадочная 10%-ная суспензия) заражают не менее 10 эмбрионов. Перед заражением эмбрионы предварительно овоскопируют, отмечая границу пуги и участок между кровеносными сосудами для прокола скорлупы и инокуляции исследуемого материала. Скорлупу со стороны пуги и место прокола дезинфицируют раствором йода и фламбируют. В центре воздушного пространства и в месте введения исследуемого материала делают пробойником отверстия, затем через боковое отверстие вводят 0,2 см³ исследуемого материала на глубину 2 - 3 мм в аллантоисную полость. Одновременно делают его высевы по 0,2 см³ на питательные среды МПБ и МПА, которые помещают в термостат при 37 - 38 °C. Контролем служат 5 незараженных эмбрионов. После заражения эмбрионов отверстия в скорлупе заливают парафином. Зараженные и контрольные эмбрионы инкубируют в термостате в течение 24 - 96 ч при температуре 37 - 38 °C и относительной влажности 60 - 70%. В процессе инкубации эмбрионы овоскопируют два раза в сутки, погибшие - сохраняют в холодильнике при 4 °C. Через 96 ч инкубации все эмбрионы вскрывают после предварительного охлаждения в холодильнике при 4 °C в течение 10 - 12 ч.

Перед вскрытием эмбрионов скорлупу обрабатывают йодом и фламбируют и из каждого эмбриона отдельно собирают экстраэмбриональную жидкость в стерильные пробирки, которую высевают на МПБ и МПА и проверяют на гемагглютинирующую активность вируса в капельной реакции гемагглютинации (РГА). Реакцию ставят на стекле путем смешивания равных капель экстраэмбриональной жидкости с 1%-ной взвесью эритроцитов кур. При отрицательной РГА образцы экстраэмбриональной жидкости в количестве 1 - 2 см³ от каждого зараженного эмбриона (не менее 5 эмбрионов) объединяют и вновь заражают не менее 10 эмбрионов.

Выделение вируса проводят в течение 3-х пассажей на куриных эмбрионах, проверяя в каждом пассаже экстраэмбриональную жидкость на наличие гемагглютининов в капельной РГА. Если титры гемагглютининов низкие, проводят еще 2 - 3 дополнительных пассажа.

2.1.4. Обработка результатов

Результат исследования пробы патологического материала считают отрицательным, если в трех дополнительных пассажах не будет обнаружено гемагглютинации эритроцитов.

При наличии гемагглютинации эритроцитов проводят идентификацию выделенного вируса.

2.2. Метод постановки реакции гемагглютинации

Сущность метода заключается в способности вируса гриппа птиц агглютинировать эритроциты кур.

2.2.1. Аппаратура, материалы и реактивы

2.2.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы - по п. 2.1.1 и дополнительно:

микротитратор типа Такачи или аналогичный;

микропипетки;

панели из плексигласа.

2.2.2. Проведение исследования

Готовят двукратные разведения вирусосодержащего материала (надосадочную жидкость, полученную после обработки патологического материала как указано в п. 2.1.2.1.) от 1:2 до 1:1024. Для этого в ряд лунок панелей из плексигласа наливают физиологический раствор в объеме 0,2 см³. В первую лунку вносят 0,2 см³ вируса, трехкратно пипетируют и переносят 0,2 см³ во вторую лунку и т.д. до требуемого разведения. Из последней лунки 0,2 см³ удаляют в дезинфицирующий раствор. В каждую лунку добавляют по 0,2 см³ 1%-ной суспензии куриных эритроцитов. Панели встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.

Контролем служат две лунки с эритроцитами и физиологическим раствором в равных объемах по 0,2 см³ каждого. Реакцию гемагглютинации и реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) ставят также с использованием микротитраторов или микропипеток в объеме 0,025 см³ в плексигласовых панелях с лунками с 0,7%-ной суспензией эритроцитов.

2.2.3. Обработка результатов

Наличие на дне и стенках лунок осадка эритроцитов в виде опрокинутого "зонтика" свидетельствует о положительной РГА. При отрицательной реакции в опыте и контроле эритроциты образуют на дне лунки диск с ровными краями.

Титром вируса считают предельное разведение его, при котором наблюдается полная агглютинация эритроцитов, что соответствует одной агглютинирующей единице (1 АЕ).

2.3. Метод идентификации вируса

Сущность метода заключается в способности специфических антител нейтрализовать гемагглютинирующую активность вируса в реакции торможения гемагглютинации со специфическими гриппозными сыворотками.

2.3.1. Аппаратура, материалы и реактивы

2.3.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы - по п. 2.2.1 и дополнительно:

набор сухих инактивированных антигенов вируса гриппа тринадцати серологических вариантов и гипериммунных сывороток для диагностики гриппа птиц;

аппарат Киппа;

баня водяная;

мел или мрамор;

кислота соляная по ГОСТ 3118 с массовой долей 30%.

2.3.2. Проведение исследования

После определения титра исследуемого вируса в количественной РГА по п. 2.2.1 ставят РТГА. Вначале устанавливают рабочую дозу вируса (4 АЕ), для чего вирус разводят физиологическим раствором во столько раз, сколько получится от деления на 4 обратного значения гемагглютинирующего титра вируса. Например: если титр вируса 1:256, то рабочее разведение будет 256 : 4 = 64, т.е. в 0,2 см³ разведенного 1:64 вируса будет содержаться 4 АЕ. Для его приготовления в данном примере берут 63 см³ физиологического раствора и 1 см³ исходного вируса.

Перед постановкой основного опыта проверяют правильность выбора 4 АЕ. Для этого на панели в четыре лунки наливают по 0,2 см³ физиологического раствора, затем в первую лунку добавляют 0,2 см³ 4 АЕ вируса и после пипетирования 0,2 см³ переносят во вторую лунку, затем в третью и т.д. Из четвертой лунки 0,2 см³ разведенного вируса удаляют в дезинфицирующий раствор. Таким образом, в первой лунке должно быть 2 АЕ, во второй - 1 АЕ, в третьей - 0,5 АЕ, в четвертой - 0,25 АЕ. После этого в каждую лунку добавляют по 0,2 см³ 1%-ной суспензии эритроцитов. Панель встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. При правильном определении рабочей дозы (4 АЕ) в первой и второй лунках должна быть полная агглютинация, в третьей - частичная агглютинация, в четвертой - четко выраженный диск ("пуговица") осевших эритроцитов.

Если в третьей лунке оказывается полная агглютинация, то это означает, что выбранная доза вируса содержит не 4 АЕ, а больше. В этом случае доза должна быть уменьшена. И наоборот, отсутствие агглютинации во второй и частично в третьей лунках свидетельствует о недостаточности вируса. Увеличивают или уменьшают рабочую дозу, добавляя соответственно вирус или физиологический раствор и затем повторно проверяют правильность выбора 4 АЕ.

2.3.3. Для постановки основного опыта в ряд лунок, начиная со второй, наливают по 0,2 см³ физиологического раствора. Затем в первую и вторую лунки добавляют по 0,2 см³ специфической сыворотки. Во второй лунке смесь пипетируют и переносят 0,2 см³ в третью лунку и т.д. до требуемого разведения. После этого во все лунки вносят по 0,2 см³ рабочего разведения вируса (4 АЕ). Панели встряхивают и после 30-минутного контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют по 0,4 см³ 1%-ной суспензии эритроцитов.

Для точности учета РТГА ставят контроль:

сыворотки (0,2 см³ сыворотки + 0,2 см³ физиологического раствора и 0,4 см³ 1%-ной суспензии эритроцитов);

эритроцитов на спонтанную агглютинацию (0,2 см³ физиологического раствора +/- 0,2 см³ 1%-ной суспензии эритроцитов).

2.3.4. Обработка результатов

РТГА считают положительной, а идентификацию вируса завершенной, если специфическая сыворотка тормозит гемагглютинирующую активность вируса не менее 1/4 - 1/8 титра, указанного на этикетке ампулы (флакона).

2.4. Метод выявления специфических антител

Сущность метода заключается в обнаружении специфической способности антител сыворотки крови больных и переболевших птиц подавлять гемагглютинирующую активность вируса в РТГА. С этой целью исследуют в РТГА с диагностическими антигенами вируса гриппа не менее 20 проб сыворотки крови от каждой обследуемой партии птиц.

2.4.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Аппаратура, материалы и реактивы - по пп. 2.1.1, 2.3.1 и дополнительно:

глицерин,

лед сухой.

2.4.2. Подготовка к исследованию

Исследуемые сыворотки предварительно разводят в соотношении 1:5 дистиллированной водой. Для удаления термолабильных ингибиторов сыворотки прогревают в водяной бане при 60 °C в течение 30 мин. В ампулы (флаконы) с антигенами добавляют физиологический раствор (pH 7,2 - 7,4) согласно "Наставлению по применению набора антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц".

2.4.3. Проведение исследования

Вначале готовят двухкратное разведение сыворотки на физиологическом растворе, начиная с разведения 1:5. Далее ставят РТГА, как указано в п. 2.3.

При обнаружении в сыворотке крови титров антител 1:10 и выше, ее освобождают от неспецифических термостабильных ингибиторов с целью подтверждения наличия специфических антител к вирусу гриппа. Для удаления термостабильных ингибиторов через разведенную и прогретую сыворотку крови пропускают углекислый газ из аппарата Киппа или добавляют кусочки сухого льда. Обработку сыворотки ведут в течение 2 - 3 мин. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием в течение 10 мин с частотой вращения 1500^-1. Надосадочную жидкость исследуют в РТГА.

2.4.4. Обработка результатов

Титром антител в сыворотке считают ее последнее разведение, давшее полную задержку гемагглютинации с исследуемым антигеном.

Выявление титра антител 1:10 и выше, но не менее, чем в 30% исследованной сыворотки является основанием для постановки диагноза, который должен быть подтвержден положительным результатом вирусологических исследований.

2.5. Метод ретроспективной диагностики

Сущность метода заключается в обнаружении достоверного прироста уровня специфических антител, обусловленного естественным развитием гриппозной инфекции в организме зараженных птиц.

2.5.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Аппаратура, материалы и реактивы - по п. 2.2.1.1.

2.5.2. Проведение исследований

Исследуют парные сыворотки, полученные в первые 1 - 2 сут в начале заболевания и через 4 - 10 сут после первого взятия крови. Сыворотку крови освобождают от ингибиторов как указано в п. 2.4 РТГА ставят с выделенным вирусом или с антигенами диагностического набора по пп. 2.3 и 2.4 с учетом эпизоотической обстановки по циркуляции того или иного серологического варианта вируса гриппа.

2.5.3. Обработка результатов

Четырехкратное и более увеличение титров антител в парных сыворотках является основанием для установления положительного диагноза.