Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены".

1. Подготовлен ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС").

2. Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335).

3. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (Протокол N 51 от 1 октября 2012 г.).

За принятие проголосовали:

4. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1760-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31748-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5. Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международному стандарту ISO 16050:2003 Foodstuffs - Determination of aflatoxin B₁, and the total content of aflatoxins B₁, B₂, G₁ and G₂ in cereals, nuts and derived products - High-performance liquid chromatographic method (Продукты пищевые. Определение афлатоксина B₁ и общего содержания афлатоксинов B₁, B₂, G₁ и G₂ в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии).

При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта, выделены курсивом.

Международный стандарт разработан техническим комитетом по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).

Перевод с английского языка (en).

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий стандарт, и международных стандартов, на которых даны ссылки, имеются в национальных (государственных) органах по стандартизации указанных выше государств.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 53162-2008.

6. Введен впервые.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в указателе "Национальные стандарты".

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в указателе "Национальные стандарты", а текст изменений - в информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе "Национальные стандарты".

Предел количественного определения афлатоксина B₁ и суммы афлатоксинов B₁, B₂, G₁ и G₂ - 8 мкг/кг.

Данный метод применим в отношении кукурузы с содержанием 24,5 мкг/кг, арахисового масла с содержанием 8,4 мкг/кг и сырых арахисовых орехов с содержанием 16 мкг/кг общей суммы афлатоксинов.

Метод допускается использовать для масличных культур, сушеных фруктов и продуктов их переработки.

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

Анализируемый образец экстрагируют смесью метанола и воды. Экстракт образца фильтруют, разбавляют водой и вводят в колонку для аффинной хроматографии, содержащую антитела, специфичные для афлатоксинов B₁, B₂, G₁ и G₂. Афлатоксины выделяют, очищают и концентрируют на колонке, после чего отделяют от антител при помощи метанола. Афлатоксины определяют количественно при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой с определением флуоресценции и послеколоночной дериватизацией.

4.1. Вода, не ниже 1-й степени, по [1].

4.2. Хлорид натрия по ГОСТ 4233.

4.3. Йод кристаллический по ГОСТ 4159.

4.4. Афлатоксин, кристаллический или в виде пленочной ампулы.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Афлатоксины канцерогенны для человека. Следует принимать во внимание заявление, сделанное Международными агентствами по исследованиям в области рака (ВОЗ) (см. [2], [3]).

Необходимо надлежащим образом предохранять лабораторию, в которой проводятся анализы, от дневного света. Для этого закрывают окна фольгой, поглощающей ультрафиолетовое излучение. Допускается использовать в комбинации с затемненным освещением (когда отсутствует прямое солнечное освещение) занавески или шторы в комбинации с искусственным освещением.

4.5. Ацетонитрил, степень чистоты для ВЭЖХ.

4.6. Метанол по ГОСТ 6995, степень чистоты ВЭЖХ.

4.7. Толуол по ГОСТ 5789.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Толуол огнеопасен и токсичен. Приготовление стандартов с использованием данного растворителя следует проводить в вытяжном шкафу. Операции за пределами вытяжного шкафа, такие как измерение эталонов методом УФ спектрометрии, следует проводить с использованием эталонов в закрытых контейнерах.

4.8. Смесь толуол/ацетонитрил

Смешивают 98 объемных частей толуола (4.7) с двумя объемными частями ацетонитрила (4.5) (см. предупреждение в 4.7).

4.9. Растворитель для экстракции

Смешивают семь объемных частей метанола (4.6) с тремя объемными частями воды (4.1).

Другие смеси - растворители для экстракции, которые совместимы с подвижной фазой, могут также использоваться, если покажут себя более эффективными или будут рекомендованы производителем иммуноаффинной колонки.

4.10. Подвижная фаза

Смешивают три объемные части воды (4.1) с одной объемной частью ацетонитрила (4.5) и одной объемной частью метанола (4.6). Перед использованием проводят дегазацию раствора.

4.11. Реагент для послеколоночной дериватизации

Растворяют 100 мг йода (4.3) в 2 см³ метанола (4.6). Добавляют 200 см³ воды (4.1), перемешивают в течение 1 ч, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (5.8). Раствор готовят на неделю использования и хранят в темноте или в склянке из коричневого стекла. Перед использованием раствор встряхивают в течение 10 мин.

4.12. Основные стандартные растворы афлатоксинов B₁, B₂, G₁ и G₂

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Растворы, содержащие афлатоксины, предохраняют от действия света (хранят в темноте, используют алюминиевую фольгу или затемненную стеклянную посуду).

Афлатоксины B₁, B₂, G₁ и G₂ растворяют по отдельности в смеси толуол/ацетонитрил (4.8), для получения индивидуальных растворов с массовой концентрацией вещества 10 мкг/см³.

Для определения точной концентрации афлатоксина в каждом исходном растворе регистрируют спектр поглощения при длинах волн от 330 до 370 нм в кварцевых кюветах толщиной 1 см (5.7), используя спектрометр (5.6).

Рассчитывают концентрацию каждого афлатоксина , мкг/см³ используя уравнение (1):

где - оптическая плотность, определяемая в максимуме спектра поглощения;

- молекулярная масса каждого афлатоксина, г/моль;

- коэффициент молярного поглощения каждого афлатоксина в смеси толуол/ацетонитрил.

Примечание. Это значение определено для раствора, который содержит c = 1 моль/дм³ афлатоксина и находится в кюветах с длиной оптического пути d = 1 см. Коэффициент молярного поглощения применяют без единиц измерения, допускается применять уравнение , ему соответствует единица измерений: дм³·моль^-1·см^-1;

d - длина оптического пути кюветы, см.

и приведены в таблице 1.

4.13. Основной стандартный раствор смеси афлатоксинов

Готовят исходный раствор, содержащий 500 нг/см³ афлатоксина B₁, 125 нг/см³ афлатоксина B₂, 250 нг/см³ афлатоксина G₁ и 125 нг/см³ афлатоксина G₂ в смеси толуол/ацетонитрил (4.8). При необходимости хранения раствора взвешивают колбу. Колбу плотно оборачивают алюминиевой фольгой и хранят при температуре около 4 °C. Непосредственно перед использованием колбу взвешивают снова и отмечают любые изменения в массе после хранения.

Примечание. Обычное воздействие УФ-излучения во время измерения оптической плотности не приводит к заметной конверсии с образованием продуктов фотолиза.

4.14. Градуировочный раствор смеси афлатоксинов

Каждую порцию основного стандартного раствора смеси афлатоксинов (4.13), как это указано в таблице 2, переносят в четыре мерные колбы вместимостью 2 см³ (5.5). Растворы выпаривают до сухого остатка в токе азота при комнатной температуре. В каждую колбу добавляют 1 см³ метанола (4.6). Растворяют в нем сухой остаток, разбавляют раствор до метки водой (4.1) и перемешивают. Растворы готовят непосредственно в день использования.

4.15. Серная кислота, по ГОСТ 4204, раствор c(H₂SO₄) = 2 моль/дм³.

Лабораторную стеклянную посуду, которая контактирует с водными растворами афлатоксинов в серной кислоте (4.15), погружают в воду на несколько часов, затем тщательно промывают (например, три раза) водой, чтобы удалить все следы кислоты. Отсутствие кислоты проверяют с помощью индикаторной бумаги.

Примечание. Данная обработка является необходимой, так как использование стеклянной посуды, промытой не кислотой, может привести к потере афлатоксинов. На практике данная обработка необходима для круглодонных колб, мерных колб, мерных цилиндров, склянок или пробирок, используемых для градуировочных растворов и конечных экстрактов (особенно автоматических пипеток), а также пастеровских пипеток, если они используются для переноса градуировочных растворов или экстрактов.

Обычное лабораторное оборудование и, в частности, то, которое приводится ниже.

5.1. Иммуноаффинная (IA) колонка

IA колонка содержит антитела, предназначенные для афлатоксинов B₁, B₂, G₁ и G₂. Колонка должна иметь минимальную емкость не менее 100 нг афлатоксина B₁ и должна давать выход не менее 80% для афлатоксинов B₁, B₂, G₁ и не менее 60% для афлатоксина G₂ при внесении в колонку 15 см³ градуировочного раствора, содержащего 5 нг каждого афлатоксина в смеси метанол/вода [одна часть метанола (4.6) и три-четыре части воды (4.1) по объему]. Колонка должна быть оборудована подходящей емкостью для растворителя (например, шприцем с переходной насадкой).

5.2. Блендер, с баком смесителя на 500 см³ и крышкой.

Рекомендуется использование высокоскоростного блендера.

5.3. Рифленая фильтровальная бумага, например, диаметром 24 см.

5.4. Фильтровальная бумага из стеклянного микроволокна, например, диаметром 11 см.

5.5. Мерные колбы по ГОСТ 1770, вместимостью 2 см³ или пикнометры по ГОСТ 22524.

Примечание. При использовании пикнометров рекомендуется измерять фактическое значение вместимости и использовать его при обработке результатов измерений в качестве величины (V₅) [см. формулу (3)].

5.6. Спектрофотометр, предназначенный для измерения оптической плотности в диапазоне длин волн от 200 до 400 нм.

5.7. Кюветы из кварцевого стекла толщиной 1 см, не имеющие существенного поглощения в диапазоне длин волн от 300 до 370 нм.

5.8. Мембранный фильтр для водных растворов, изготовленный из политетрафторэтилена, диаметром 4 мм и размером пор 0,45 мкм.

5.9. Оборудование для ВЭЖХ

5.9.1. Насос ВЭЖХ, способный производить скорость потока 1 см³/мин.

5.9.2. Система ввода (инжектор), со шприцевой загрузкой и петлей 50 мкл или эквивалентным.

5.9.3. Аналитическая разделяющая колонка с обращенной фазой, например , которая обеспечивает разрешение пиков афлатоксинов B₁, B₂, G₁ и G₂ до базовой линии от всех остальных пиков и которая имеет следующие характеристики:

- длина: 250 мм;

- внутренний диаметр: 4,6 мм;

- размер сферических частиц: 5 мкм.

Допускается использование колонки меньшей длины.

5.9.4. Система послеколоночной дериватизации, состоящая из безпульсационного насоса и тройника, имеющего очень малый мертвый объем, системы труб из политетрафторэтилена или нержавеющей стали длиной от 3000 до 5000 мм и внутренним диаметром 0,5 мм, а также водяной бани или послеколоночного реактора для реакции с участием йода.

5.10. Флуоресцентный детектор, пригодный для работы при длине волны возбуждения 365 нм и излучении при длине волны эмиссии 435 нм (для фильтровых приборов длина волны регистрации излучения > 400 нм), с пределом детектирования не более 0,05 нг афлатоксина B₁ в объеме ввода (в данном случае он равен 50 мкл).

6.1. Общие замечания

Растворы проб и стандартные растворы для определения с помощью ВЭЖХ должны содержать одинаковый растворитель или смесь растворителей.

6.2. Экстракция

Взвешивают 25 г гомогенизированной пробы, с точностью 0,1 г, в сосуде блендера (см. 5.2). Добавляют 5 г хлорида натрия (см. 4.2) и 125 см³ растворителя для экстракции (см. 4.10) и гомогенизируют с помощью перемешивающего устройства в течение 2 мин при высокой скорости. Контролируют, чтобы время и скорость перемешивания не оказывали негативного влияния на эффективность экстракции. Смесь фильтруют через рифленую фильтровальную бумагу (см. 5.3) (V₁).

Отбирают пипеткой 15 см³ (V₂) фильтрата в коническую колбу подходящего размера со стеклянной пробкой. Добавляют 30 см³ воды, закрывают колбу пробкой и перемешивают. Перед проведением аффинной колоночной хроматографии разбавленный экстракт фильтруют через фильтровальную бумагу из стеклянного микроволокна (5.4). Фильтрат (V₃) должен быть прозрачным. Если это не так, проводят повторную фильтрацию. Незамедлительно следуют процедурам в соответствии с 6.3.

Для получения прозрачного раствора можно также использовать центрифугу.

6.3. Очистка

Готовят IA колонку (см. 5.1) и осуществляют процедуру очистки в соответствии с инструкциями производителя. Отбирают пипеткой 15 см³ (V₄) второго фильтрата (V₃) в емкость для растворителя IA колонки. Пропускают его через разделяющую колонку, затем промывают колонку, как это описано в инструкциях производителя и удаляют элюаты. Начинают проводить элюирование афлатоксинов. Собирают этанольный или ацетонитрильный элюат (в зависимости от продукта или инструкций производителя) в мерной колбе вместимостью 2 см³ (см. 5.5) (или другого объема, установленного производителем). Разбавляют до метки водой (V₅). Перемешивают и действуют в соответствии с 6.4.

Методы ввода в IA колонки, промывания и элюирования немного отличаются в зависимости от производителя колонки, и необходимо четко следовать конкретным инструкциям, прилагаемым к колонкам.

Примечание. В целом, процедуры включают экстракцию образца смесью метанола и воды, фильтрацию или центрифугирование, возможное разбавление образца раствором фосфатного буфера или водой, загрузку под давлением в предварительно промытую колонку, промывку колонки дистиллированной водой и элюирование афлатоксинов метанолом или ацетонитрилом (в зависимости от продукта и инструкций производителя).

Допускается использовать традиционные колонки с силикагелем или колонки твердофазной экстракции. В этих случаях также необходимо четко следовать инструкциям производителя. Если растворитель, применяемый для элюирования афлатоксинов, несовместим с подвижной фазой, то элюат необходимо выпарить до сухого остатка в токе азота при температуре ниже 40 °C. Остаток необходимо растворить в подвижной фазе и разбавить до 2 см³ или до того объема, который установлен производителем.

Необходимо предусмотреть, чтобы максимальная емкость колонки не была превышена.

6.4. Условия работы при выполнении ВЭЖХ

Выход разделительной колонки подсоединяют к одному ответвлению тройника системы послеколоночной дериватизации (5.9.4) с помощью короткого фрагмента системы труб с внутренним диаметром, например, 0,25 мм. Ко второму ответвлению тройника подсоединяют выход насоса, который поставляет реагент для послеколоночной дериватизации. Один конец витка труб из политетрафторэтилена или нержавеющей стали (см. 5.9.4) присоединяют к третьему ответвлению тройника и другой конец присоединяют к детектору (см. 5.10). Используя термостат или водяную баню, поддерживают температуру реакционного змеевика на уровне 70 °C.

В случае использования колонки, указанной в 5.9.3, подходящими являются следующие параметры:

- скорость потока подвижной фазы (колонка): 1,0 см³/мин;

- скорость потока послеколоночного реагента: 0,3 см³/мин;

- впрыскиваемый объем: 50 мкл.

Дают всей системе функционировать 10 - 20 мин для ее стабилизации. Если используется интегратор, настраивают регулировку чувствительности флуоресцентного детектора или интегратора, чтобы получить соответствующий сигнал: шум 5:1 для 0,125 нг афлатоксина G₂ в 50 мкл. Если используется регистрирующий прибор с ленточной диаграммой, настраивают регулировку флуоресцентного детектора таким образом, чтобы получить для 0,125 нг афлатоксина G₂ в 50 мкл от 30% до 40% шкалы регистрирующего прибора.

6.5. Идентификация

Проводят идентификацию каждого пика афлатоксина на хроматограмме образца путем сравнения значений времени удерживания со значениями соответствующих стандартов.

Афлатоксины можно идентифицировать одновременным вводом раствора испытуемой пробы и градуировочных растворов. Кроме того, при идентификации помогает исчезновение пиков афлатоксинов B₁ и G₁ в случае, когда не проводится добавка реагента для дериватизации.

6.6. Построение градуировочной зависимости

Для каждого афлатоксина строят градуировочную зависимость путем ввода 50 мкл стандартных растворов 1, 2, 3 и 4 (см. таблицу 2). Проверяют линейность зависимости [4].

6.7. Определение

Количественное определение проводится методом внешнего стандарта с интегрированием площади пика или измерением высоты пика, которые далее соотносятся с соответствующими значениями для стандарта.

В петлю инжектора вводят 50 мкл стандартного раствора в соответствии с инструкциями производителя инжектора. Афлатоксины элюируют в порядке G₂, G₁, B₂, и B₁ со временем удерживания приблизительно 6, 8, 9 и 11 мин соответственно. Пики должны быть разделены до базовой линии. При необходимости регулируют значения времени удерживания путем изменения концентрации метанола подвижной фазы (4.11).

Вводят 50 мкл (V₆) очищенного экстракта образца (см. 6.3) в инжекторную петлю.

Рассчитывают массу m_t, г, анализируемой пробы, присутствующей во фракции второго фильтрата, взятого для IA колонки (V₄), по формуле

где m₀ - масса пробы образца (см. 6.2), г (m₀ = 25 г);

V₁ - общий объем первого фильтрата (см. 6.2), см³ (V₁ = 125 см³); <1>

--------------------------------

<1> Принимая во внимание данные по точности метода, V₁ может рассматриваться как эквивалент объема растворителя экстракции.

V₂ - объем фракции первого фильтрата (см. 6.2), взятый для разбавления, см³ (V₂ = 15 см³);

V₃ - общий объем второго фильтрата (см. 6.2), см³ (V₃ = 45 см³);

V₄ - объем фракции второго фильтрата (см. 6.3), см³ (V₄ = 15 см³).

Рассчитывают массовую долю каждого афлатоксина, , в микрограммах на килограмм пробы, вычисляют по формуле 3 (метод внешнего стандарта)

где V₅ - объем элюата (6.3), мкл (V₅ = 2000 мкл);

V₆ - объем очищенного и введенного экстракта образца (6.7), мкл (V₆ = 50 мкл);

m_i - масса данного афлатоксина, присутствующего во введенном объеме, соответствующая измеренной площади пика или высоте пика, определяемая по градуировочной характеристике, в нанограммах;

m_t - масса анализируемой пробы, г, соответствующей фракции второго фильтрата, взятого для IA колонки (V₄) (см. формулу (2)).

Для получения массовой доли суммы афлатоксинов суммируют массовые доли четырех афлатоксинов.

8.1. Межлабораторное сравнительное испытание

Детали межлабораторного сравнительного испытания прецизионности данного метода приведены в Приложении А. Значения, полученные в результате межлабораторного сравнительного испытания, могут быть неприменимы к диапазонам концентраций и матрицам, отличных от тех, которые приведены в Приложении А.

8.2. Повторяемость

Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами испытаний, полученными при использовании одного и того же метода, идентичных материалов для испытаний, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, с использованием того же оборудования, в течение короткого интервала времени, будет превышать предел повторяемости r, значения которого приведены ниже, не более чем в 5% случаев.

a) Значения для кукурузы:

- афлатоксин B₁: , r = 2,4 мкг/кг,

- афлатоксин B₂: , r = 1,0 мкг/кг,

- афлатоксин G₁: , r = 1,9 мкг/кг,

- афлатоксин G₂: , r = 0,6 мкг/кг,

- общее содержание афлатоксинов: .

b) Значения для арахисового масла:

- афлатоксин B₁: , r = 2,2 мкг/кг,

- афлатоксин B₂: , r = 0,3 мкг/кг,

- афлатоксин G₁: , r = 1,5 мкг/кг,

- афлатоксин G₂: , r = 0,5 мкг/кг,

- общее содержание афлатоксинов: .

c) Значения для арахиса:

- афлатоксин B₁: , r = 1,5 мкг/кг,

- афлатоксин B₂: , r = 0,7 мкг/кг,

- афлатоксин G₁: , r = 0,8 мкг/кг,

- афлатоксин G₂: , r = 0,8 мкг/кг,

- общее содержание афлатоксинов: .

Основываясь на полученных результатах, содержание афлатоксинов в арахисовом масле можно только оценить. В случае кукурузы и арахисовых орехов афлатоксины B₁ и G₁ могут быть определены, а афлатоксины B₂ и G₂ могут быть только обнаружены, и их содержание может быть оценено качественно.

8.3. Воспроизводимость

Абсолютная разница между двумя отдельными результатами испытаний, полученными при использовании одинакового метода, идентичных материалов для испытаний, в различных лабораториях различными операторами и с использованием различного оборудования, будет превышать предел воспроизводимости R, значения которого приводятся ниже, не более чем в 5% случаев.

a) Значения для кукурузы:

- афлатоксин B₁: , R = 4,2 мкг/кг,

- афлатоксин B₂: , R = 1,2 мкг/кг,

- афлатоксин G₁: , R = 1,9 мкг/кг,

- афлатоксин G₂: , R = 1,5 мкг/кг,

- общее содержание афлатоксинов: .

b) Значения для арахисового масла:

- афлатоксин B₁: , R = 4,4 мкг/кг,

- афлатоксин B₂: , R = 0,6 мкг/кг,

- афлатоксин G₁: , R = 2,0 мкг/кг,

- афлатоксин G₂: , R = 0,7 мкг/кг,

- общее содержание афлатоксинов: .

c) Значения для арахиса:

- афлатоксин B₁: , R = 4,5 мкг/кг,

- афлатоксин B₂: , R = 1,2 мкг/кг,

- афлатоксин G₁: , R = 1,8 мкг/кг,

- афлатоксин G₂: , R = 1,4 мкг/кг,

- общее содержание афлатоксинов: .

Основываясь на полученных результатах, содержание афлатоксинов в арахисовом масле можно только оценить качественно. В случае кукурузы и арахиса афлатоксины B₁ и G₁ могут быть определены, а афлатоксины B₂ и G₂ могут быть только обнаружены, и их содержание может быть оценено качественно.

Протокол испытаний должен содержать:

- всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;

- используемый метод отбора образцов, если он известен;

- используемый метод испытаний, со ссылкой на настоящий стандарт;

- детали проведения работ, не установленные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, а также все факторы, влияющие на результат(ы) испытаний;

- полученные результат(ы) испытаний или, если была проведена проверка повторяемости, полученный окончательный результат.

Нижеприведенные данные получены в процессе межлабораторного сравнительного испытания, которое проводилось в 1999 г. и было организовано АОАС и ИЮПАК (Международный союз теоретической и прикладной химии) в соответствии с ГОСТ ISO 5725-1. Были исследованы образцы кукурузы, арахисовых орехов и арахисового масла, имеющие естественное загрязнение и зафиксированные на уровне 10, 20 и 30 мкг/кг общей суммы афлатоксинов с соотношением афлатоксинов B₁, B₂, G₁ и G₂ - 7:1:3:1 соответственно.

В исследовании участвовало десять лабораторий, имелся один экземпляр каждого образца. Во время проведения данного межлабораторного сравнительного испытания в качестве реагента послеколоночной дериватизации использовался йод.