Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июля 2014 г. N 68-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 25 сентября 2014 г. N 1221-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 25179-2014 введен в качества национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.

5 ВЗАМЕН ГОСТ 25179-90

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1. Область применения

Настоящий стандарт распространяется на молоко и молочные продукты (молочное сырье, питьевое молоко, сухое молоко) и устанавливает методы определения массовой доли белка: формольного титрования и колориметрический.

2. Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты <*>

--------------------------------

<*> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3652-69 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия

ГОСТ 4172-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ ISO 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике <**>

--------------------------------

<**> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 11773-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 23327-98 Молоко и молочные продукты. Метод измерения массовой доли общего азота по Кьельдалю и определение массовой доли белка.

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 27752-88 Часы электронно-механические кварцевые настольные. Настенные и часы будильники. Общие технические условия

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний.

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29251-91 (ИСО 385-1-84) Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом, следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3. Отбор проб

3.1 Отбор проб и подготовка их к анализу - по ГОСТ 26809.

3.2 Если определение не может быть проведено сразу после отбора проб, их хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более суток.

4. Условия проведения измерений

При выполнении измерений в лаборатории следует соблюдать следующие условия:

5. Метод формольного титрования

Метод распространяется на непастеризованное молоко с титруемой кислотностью не выше 20 °Т.

Метод применяют при условии согласования с поставщиком.

5.1 Сущность метода

Метод основан на нейтрализации карбоксильных групп моноаминодикарбоновых кислот белков раствором гидроксида натрия, количество которого, затраченное на нейтрализацию, пропорционально массовой доле белка в молоке.

5.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы

Анализатор потенциометрический (или pH-метр) с диапазоном измерения от 1 до 14 ед. pH и допускаемой абсолютной погрешностью +/- 0,05 ед. pH.

Магнитная мешалка с частотой вращения 800 об/мин.

Секундомер механический типа СОПир 3-го класса.

Колбы 1-1000-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 1-2-5, 2-2-20 по ГОСТ 29169.

Воронки В-75-110 ХС по ГОСТ 25336.

Стаканы В-1-50, В-2-50 по ГОСТ 25336.

Бюретки 1-1(2)-1-25-0,05, 1-1(2)-2-25-0,05 по ГОСТ 29251.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч. или стандарт-титр, раствор молярной концентрации c (NaOH) = 0,1 моль/дм³.

Формальдегид, водный раствор с массовой долей формальдегида 36,5% - 37,5%, по нормативным и техническим документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерения, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов по качеству не хуже вышеуказанных.

5.3 Подготовка к проведению измерений

5.3.1 Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации c (NaOH) = 0,1 моль/дм³

Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 0,1 моль/дм³ и проверку его молярной концентрации проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 25794.1.

Раствор хранят не более 1 мес при температуре (20 +/- 5) °C в бутыли из темного стекла.

5.3.2 Определение поправки к результатам измерения массовой доли белка методом формольного титрования

Для определения поправки к результатам измерения массовой доли белка методом формольного титрования проводят одновременное измерение массовой доли белка в одном и том же образце молока методом формольного титрования и методом Кьельдаля (ГОСТ 23327).

Измерения проводят в средней пробе молока, полученной смешиванием равных по массе образцов молока, полученных от разных хозяйств. При этом средняя проба должна быть образована не менее чем от 75% всех хозяйств-сдатчиков молока.

Измерения как по ГОСТ 23327, так и методом формольного титрования проводят в шести повторностях, определяют среднеарифметические значения.

Поправку K, %, вычисляют по формуле

где X₁ - среднеарифметическое значение шести измерений массовой доли белка, полученное по ГОСТ 23327, %;

X₂ - среднеарифметическое значение шести измерений массовой доли белка, полученное формольным титрованием, %.

Определение поправки проводят не реже одного раза в десять дней.

5.4 Проведение измерений

5.4.1 В стакан помещают 20 см³ молока и стержень магнитной мешалки. Стакан устанавливают на магнитную мешалку, включают двигатель мешалки и погружают электроды потенциометрического анализатора в молоко. Постепенно добавляют раствор гидроокиси натрия. При достижении точки эквивалентности (pH = 9) и истечении времени выдержки (30 с) после достижения точки эквивалентности определяют количество раствора гидроокиси натрия, пошедшее на нейтрализацию молока до внесения формальдегида. Затем вносят в стакан 5 см³ формальдегида.

По истечении 2,0 - 2,5 мин продолжают титрование. По окончании процесса определяют общее количество раствора, затраченного на нейтрализацию.

5.4.2 Параллельно проводят контрольный опыт по нейтрализации смеси, состоящей из 20 см³ дистиллированной воды и 5 см³ раствора формальдегида.

5.5 Обработка результатов

5.5.1 Массовую долю белка X₃, %, вычисляют по формуле

где V₂ - общее количество раствора, израсходованное на нейтрализацию, см³;

V₁ - количество раствора, израсходованное на нейтрализацию до внесения формальдегида, см³;

V₀ - количество раствора, израсходованное на контрольный опыт, см³;

0,96 - эмпирический коэффициент, %/см³;

K - поправка к результату измерения массовой доли белка, %.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух измерений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до второго десятичного знака, если выполняется условие приемлемости по разделу 7.

5.5.2 Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих метода формольного титрования определения массовой доли белка при P = 0,95 приведены в таблице 1.

6. Колориметрический метод

6.1 Сущность метода

Метод основан на способности белков молока при pH ниже изоэлектрической точки связывать кислый краситель, образуя с ним нерастворимый осадок, после удаления которого измеряют оптическую плотность исходного раствора красителя относительно полученного раствора.

6.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,001 г.

Колориметр или спектрофотометр лабораторный со спектральным диапазоном длин волн 315 - 990 нм, диапазоном измерения коэффициента пропускания от 0,1% до 100%, диапазоном измерения оптической плотности от 0 до 3, с кюветами длиной оптического пути 10 мм.

Анализатор потенциометрический диапазоном измерения от 1 до 14 ед. pH, погрешностью +/- 0,05 ед. pH.

Термометр ртутный стеклянный с диапазоном измерения от 0 °C до 100 °C, с ценой деления 0,5 °C или 1,0 °C, с пределом допустимой погрешности +/- 1 °C по ГОСТ 28498.

Центрифуга с частотой вращения не менее 1000 об/мин.

Мешалка магнитная с частотой вращения 800 об/мин.

Баня водяная термостатируемая, обеспечивающая поддержание температуры в интервале от 0 °C до 100 °C с погрешностью +/- 2 °C.

Часы электронно-механические по ГОСТ 27752.

Пробки резиновые конусные N 16 или N 19 по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.

Штатив для пробирок.

Фильтры бумажные обеззоленные или бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Пробирки П2Т-25, П2Т-50, П3-25, П3-50 ХС по ГОСТ 25336.

Воронки В-36-50, В-75-110 ХС по ГОСТ 25336.

Колбы 1-50-2, 1-1000-2, 1-2000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 1-2-1, 2-2-20 по ГОСТ 29169.

Цилиндр 3-250-2 по ГОСТ 1770.

Колбы Кн-1-500-29/32 ТС по ГОСТ 25336.

Краситель "Амидо черный 10 Б", ч.д.а., по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.

Кислота лимонная по ГОСТ 3652, х.ч. или ч.д.а.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный, 12-водный по ГОСТ 4172, х.ч. или ч.д.а. или натрий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 11773, х.ч. или ч.д.а.

Кислота серная по ГОСТ 4204, х.ч. или ч.д.а.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, ч.д.а., раствор массовой доли 40%.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов по качеству не хуже вышеуказанных.

6.3 Определение массовой доли белка в сыром и питьевом молоке

6.3.1 Подготовка к проведению измерений

6.3.1.1 Приготовление буферного раствора

В коническую колбу вместимостью 500 см³ помещают (31,70 +/- 0,01) г лимонной кислоты и (8,40 +/- 0,01) г натрия фосфорнокислого, добавляют 400 см³ дистиллированной воды. Содержимое колбы нагревают до температуры (68 +/- 2) °C, аккуратно перемешивая до полного растворения веществ, и затем охлаждают до температуры (20 +/- 2) °C.

6.3.1.2 Приготовление раствора красителя

В коническую колбу вместимостью 500 см³ помещают (4,60 +/- 0,01) г красителя Амидо черного, добавляют 200 см³ дистиллированной воды. Содержимое колбы нагревают до температуры (68 +/- 2) °C, аккуратно перемешивая до растворения красителя.

Затем раствор фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 2000 см³. Фильтр промывают дистиллированной водой до удаления следов красителя. В эту же колбу переносят буферный раствор, приготовленный по 6.3.1.1.

Содержимое колбы охлаждают до температуры (20 +/- 2) °C, доливают дистиллированной водой до метки, закрывают резиновой пробкой и перемешивают содержимое путем переворачивания колбы не менее шести раз.

Измеряют значение pH полученного раствора: оно должно быть (2,3 +/- 0,1) ед. pH. Если pH раствора не соответствует данному значению, добавляют концентрированную серную кислоту или раствор с массовой долей гидроокиси натрия 40%.

Раствор, разбавленный в 50 раз, должен иметь оптическую плотность (0,82 +/- 0,02) на длине волны 590 нм в кювете с рабочей длиной 10 мм. Если оптическая плотность раствора не соответствует данному значению, то исправляют ее добавлением буферного раствора или раствора красителя.

Раствор используют после 12 ч выдержки.

Срок хранения раствора в плотно укупоренной темной посуде в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C - не более 4 мес.

При этом значения pH и оптической плотности еженедельно проверяют и при необходимости исправляют.

6.3.2 Проведение измерений

6.3.2.1 В стеклянную пробирку пипеткой отмеряют 1 см³ молока, добавляют 20 см³ раствора красителя (6.3.1.2) и, закрыв пробирку резиновой пробкой, перемешивают содержимое, переворачивая пробирку от 2 до 10 раз. Следует избегать встряхивания, т.к. при этом образуется трудноразрушимая пена.

6.3.2.2 Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют 10 мин при частоте вращения 1500 об/мин или 20 мин при частоте вращения 1000 об/мин.

6.3.2.3 Отбирают пипеткой 1 см³ надосадочной жидкости, переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, доливают до метки дистиллированной водой и перемешивают.

6.3.2.4 В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают 1 см³ раствора красителя (6.3.1.2), объем раствора доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

6.3.2.5 Измеряют оптическую плотность разбавленного раствора красителя (6.3.2.4) по отношению к анализируемой пробе (6.3.2.4). После каждых 24 измерений кювету промывают буферным раствором, приготовленным по 6.3.1.1.

6.3.3 Обработка результатов

Массовую долю белка X₄, %, вычисляют по формуле

где 7,78 - эмпирический коэффициент, %/ед. оптической плотности;

D - измеренная оптическая плотность, ед. оптической плотности;

1,34 - эмпирический коэффициент, %.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов измерений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до второго десятичного знака, если выполняется условие приемлемости по разделу 7.

6.3.4 Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих колориметрического метода определения массовой доли белка при P = 0,95 приведены в таблице 2.

6.4 Определение массовой доли белка в сухом молоке

6.4.1 Подготовка к проведению измерений

6.4.1.1 Приготовление раствора красителя

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают (1,664 +/- 0,001) г фосфорнокислого двузамещенного натрия и (1,50 +/- 0,01) г лимонной кислоты, добавляют 400 см³ дистиллированной воды и тщательно перемешивают. После растворения добавляют (0,80 +/- 0,01) г красителя Амидо черного и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки, закрывают резиновой пробкой и перемешивают содержимое путем переворачивания колбы не менее шести раз.

Измеряют значение pH полученного раствора: оно должно быть (2,40 +/- 0,05) единиц ед. pH. Если pH раствора не соответствует данному значению, добавляют концентрированную серную кислоту или раствор с массовой долей гидроокиси натрия 40%.

Раствор хранят не более 7 сут. при температуре (6 +/- 2) °C в плотно укупоренной бутыли из темного стекла.

6.4.2 Проведение измерений

6.4.2.1 В центрифужную или химическую пробирку помещают 0,17 - 0,20 г хорошо перемешанного сухого молока, постепенно добавляют 30 см³ раствора красителя Амидо черного (6.4.1.1) и аккуратно перемешивают в течение (5,0 +/- 0,5) мин при помощи магнитной мешалки с подогревом [температура раствора (28 +/- 2) °C] или (10,0 +/- 0,5) мин без подогрева. Допускается ручное перемешивание.

6.4.2.2 После перемешивания полученный раствор центрифугируют 10 мин при частоте вращения 1500 об/мин или 20 мин при частоте вращения 1000 об/мин. Осадок отделяют фильтрованием.

6.4.2.3 Определяют оптическую плотность фильтрата при длине волны 450 - 500 нм.

6.4.3 Обработка результатов

Массовую долю белка в пробе сухого молока определяют, пользуясь градуировочным графиком.

6.4.3.1 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика готовят градуировочные образцы массовой доли белка в количестве не менее 10 шт. Значения массовой доли белка в градуировочных образцах должны находиться в интервале от 20% до 40%.

В приготовленных градуировочных образцах определяют массовую долю белка методом Кьельдаля, а также оптическую плотность фильтрата, полученного по 6.4.2.

По полученным результатам строят градуировочный график. Для этого на оси абсцисс откладывают значения массовой доли белка в пробе продукта в процентах, определенные методом Кьельдаля, а на оси ординат откладывают соответствующие им значения оптической плотности. Полученные точки соединяют.

6.4.3.2 Определение массовой доли белка

По измеренному значению оптической плотности фильтрата исследуемой пробы сухого молока (6.4.2.3) с помощью градуировочного находят значение массовой доли белка.

За окончательный результат измерений массовой доли белка в сухом молоке принимают среднеарифметическое значение результатов двух измерений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости по разделу 7.

6.4.4 Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих колориметрического метода определения массовой доли белка в сухом молоке при P = 0,95 приведены в таблице 3.

7. Проверка приемлемости результатов измерений

7.1 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости

Проверку приемлемости результатов измерений массовой доли белка в исследуемых продуктах, полученных в условиях повторяемости (n = 2), проводят с учетом требований ГОСТ ISO 5725-6.

Результаты измерений считаются приемлемыми при условии

где X₁, X₂ - значения двух результатов измерений массовой доли белка в исследуемых продуктах, полученные в условиях повторяемости, %;

r - предел повторяемости (сходимости), значение которого приведено в таблицах 1 - 3, %.

Если данное условие не выполняется, то проводят повторные измерения и проверку приемлемости результатов измерений в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ ISO 5725-6 (5.2).

При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам анализа.

7.2 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Проверку приемлемости результатов измерений массовой доли белка в исследуемых продуктах, полученных в условиях воспроизводимости (в двух лабораториях, m = 2), проводят с учетом требований ГОСТ ISO 5725-6.

Результаты измерений, выполненные в условиях воспроизводимости, считаются приемлемыми при условии

где X'₁, X'₂ - значения двух результатов измерений массовой доли белка в исследуемых продуктах, полученные в двух лабораториях в условиях воспроизводимости, таблицы 1 - 3, %;

R - предел воспроизводимости, значения которых приведены в таблицах 1 - 3, %.

Если данное условие не выполняется, то выполняют процедуры в соответствии с требованиями ГОСТ ISO 5725-6 (5.3.2, 5.3.3).

8. Оформление результатов измерений

Результат измерения массовой доли белка в исследуемых продуктах представляют в документах, предусматривающих его использование, в виде

где X_ср - среднеарифметическое значение результатов двух измерений, признанных приемлемыми по разделу 7, %;

- границы абсолютной погрешности измерений, % (таблицы 1 - 3).

9. Требования безопасности

9.1 При выполнении работ необходимо соблюдать следующие требования:

- помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005;

- требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007;

- требования техники безопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009.

9.2 Требования к оператору

Выполнение определений может проводить специалист, имеющий специальное образование, освоивший метод в соответствии с нормативами контроля точности при выполнении процедур контроля точности.