Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН Республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт метрологии" (БелГИМ) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии международного стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 января 2015 г. N 74-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 августа 2016 г. N 955-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 16649-2-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 16649-2:2001 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli (кишечная палочка). Часть 2. Методика подсчета колоний при температуре 44 °C с применением 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронида" ("Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for the enumeration of Escherichia coli. Part 2. Colony-count technique at 44 °C using ", IDT).

Международный стандарт разработан подкомитетом SC 9 "Микробиология" Технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий государственный стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования международного стандарта с целью применения обобщающего понятия в наименовании стандарта в соответствии с ГОСТ 1.5-2001.

В стандарт внесены следующие редакционные изменения: единица измерения миллилитр (мл) заменена на кубический сантиметр (см³); 5.2.1 и 5.2.2 дополнены примечаниями.

В разделе "Нормативные ссылки" ссылки на международные стандарты актуализированы.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

Международный стандарт ISO 16649 состоит из следующих частей под общим наименованием "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli (кишечная палочка)":

- часть 1. Методика подсчета колоний при температуре 44 °C с применением мембран и 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронида;

- часть 2. Методика подсчета колоний при температуре 44 °C с применением 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронида;

- часть 3. Метод наиболее вероятного числа с применением 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронида.

В данном стандарте описаны два горизонтальных метода (ISO 16649-1 и ISO 16649-2) для подсчета бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli (кишечная палочка).

Пользователь может выбрать либо ISO 16649-1, либо ISO 16649-2. Каждая часть предназначена для общего применения. Однако необходимо использовать ISO 16649-1 для пищевой продукции, которая может содержать микроорганизмы, подвергшиеся шоковому воздействию.

В настоящем стандарте приводится горизонтальный метод подсчета бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli в продуктах, предназначенных для потребления человеком в пищу, или в продуктах, предназначенных для корма животных. В нем используется методика подсчета колоний при температуре 44 °C на плотной питательной среде, содержащей хромогенный компонент для обнаружения фермента бета-глюкуронидазы.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Штаммы Escherichia coli, которые не растут при 44 °C, в частности бета-глюкуронидаза-отрицательные, такие как Escherichia coli O 157, не будут обнаружены.

В настоящем стандарте использованы ссылки на межгосударственные стандарты, которые являются обязательными. Для датированных ссылок применяют только указанное издание, для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения):

ISO 6887-1:1999 Microbiology of food and animal feeding stuffs. Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination. Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Подготовка образцов для испытания, исходной суспензии и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 1. Общие правила подготовки исходной суспензии и десятичных разведений)

ISO 7218:2007 Microbiology of food and animal feeding stuffs. General rules for microbiological examinations (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям)

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 бета-глюкуронидаза-положительные Escherichia coli ( Escherichia coli): Бактерии, которые при температуре 44 °C образуют типичные колонии синего цвета в среде с триптоном, солями желчных кислот и X-глюкуронидом (TBX) в условиях, описанных в настоящем стандарте.

3.2 подсчет бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli (enumeration of Escherichia coli): Определение количества колониеобразующих единиц (КОЕ) бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр или грамм образца, когда испытание и вычисления проводятся в соответствии с настоящим стандартом.

4.1 Заданное количество исследуемого образца или исходной суспензии засевают в две параллельные чашки Петри со средой с триптоном, солями желчных кислот и X-глюкуронидом (TBX).

При таких же условиях каждое последующее десятичное разведение образца или исходной суспензии засевают в две чашки Петри со средой TBX.

Чашки инкубируют в течение 18 - 24 ч при температуре (44 +/- 1) °C, затем исследуют на наличие колоний, типичных для бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli.

4.2 Рассчитывают количество КОЕ бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на грамм или кубический сантиметр образца (см. пункт 10).

См. действующую лабораторную практику в ISO 7218.

5.1 Разбавитель

См. ISO 6887-1 или соответствующий стандарт, касающийся подлежащего исследованию продукта.

5.2 Питательная среда: среда с триптоном, солями желчных кислот и X-глюкуронидом (TBX)

5.2.1 Состав

5.2.2 Подготовка

Растворяют BCIG в диметилсульфоксиде или в рекомендованном изготовителем разбавителе.

Растворяют все компоненты в воде и нагревают до кипения.

При необходимости отрегулировать pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,2 +/- 0,2) при температуре 25 °C.

Производят стерилизацию в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. Сразу же охлаждают среду в водяной бане (6.3) при температуре от 44 °C до 47 °C.

Обычное микробиологическое лабораторное оборудование (см. ISO 7218):

6.1 Устройство для суховоздушной стерилизации (печь) или паровой стерилизации (автоклав).

6.2 Инкубаторы, способные поддерживать температуру (44 +/- 1) °C.

6.3 Водяная баня, способная поддерживать температуру от 44 °C до 47 °C.

6.4 Пробирки, бутылки или колбы необходимой вместимости.

6.5 Пипетки или микропипетки с одной меткой (выдувные), с широкими отверстиями и номинальной вместимостью 1 и 10 см³, с ценой деления 0,1 и 0,5 см³ соответственно.

6.6 Чашки Петри диаметром приблизительно 90 мм.

6.7 pH-метр, способный проводить измерения с точностью до +/- 0,1 ед. pH.

Его минимальный порог измерения должен составлять 0,01 ед. pH. pH-метр должен быть оснащен устройством ручного или автоматического выравнивания температуры.

Очень важно, чтобы лаборатория получила представительную, не поврежденную и не измененную во время транспортировки или хранения, пробу.

Отбор проб не является частью метода, описанного в настоящем стандарте. Если соответствующий стандарт отсутствует, рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны пришли к определенному соглашению по данному вопросу.

Подготовку анализируемой пробы проводят в соответствии со стандартом, подходящим для рассматриваемого продукта. Если соответствующий стандарт отсутствует, рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны пришли к определенному соглашению по данному вопросу.

9.1 Исследуемая часть пробы, исходная суспензия и разведения

См. ISO 6887-1 и любой соответствующий стандарт, подходящий для рассматриваемого продукта.

9.2 Посев и инкубация

9.2.1 Используя стерильные пипетки или микропипетки (6.5), внести в стерильную чашку Петри (6.6) 1 см³ исследуемой пробы (в случае с жидкостью) или 1 см³ исходного разведения (10^-1) в случае с другими продуктами.

Засевают по две чашки Петри для каждого разведения.

При необходимости повторяют процедуру с последующими десятичными разведениями, используя новую стерильную пипетку для каждого разведения.

9.2.2 Заливают в каждую чашку Петри приблизительно 15 см³ среды ТВХ (5.2), предварительно охлажденной до температуры от 44 °C до 47 °C на водяной бане (6.3).

Аккуратно смешивают инокулят со средой и дают застыть, разместив чашки Петри на прохладной горизонтальной поверхности.

Промежуток времени от момента распределения инокулята в чашке и до внесения среды не должен превышать 15 мин.

9.2.3 Переворачивают засеянные чашки (9.2.2) дном вверх и помещают их в инкубатор (6.2), настроенный на температуру (44 +/- 1) °C, на 18 - 24 ч. Общее время инкубации не должно превышать 24 ч.

9.3 Подсчет колоний (КОЕ)

После заданного периода инкубации (9.2.3) подсчитывают типичные колонии (КОЕ) бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli в каждой чашке, содержащей менее 150 типичных колоний (КОЕ) и менее 300 общих (типичных и нетипичных) колоний (КОЕ).

Чашки, не содержащие типичных колоний (КОЕ), должны быть учтены при вычислениях, приведенных в пункте 10.

10.1 Общие положения

В ходе вычисления, описанного в 10.2, принимаются во внимание случаи, наиболее часто встречающиеся при проведении испытаний в соответствии с надлежащей лабораторной практикой. Могут возникать некоторые особые, маловероятные случаи (например, сильно различающиеся количества колоний КОЕ в двух чашках из одного разведения или пропорции, сильно отличающиеся от пропорции коэффициента разведения в чашках из двух последовательных разведений). В таком случае результаты подсчета должны быть переданы компетентному микробиологу для изучения, толкования и возможного отклонения.

10.2 Подсчет колоний

Для того чтобы результат был достоверным, необходимо подсчитать количество колоний КОЕ по крайней мере в одной чашке, содержащей не менее 15 типичных колоний КОЕ.

Рассчитывают количество КОЕ бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli, присутствующих в исследуемой пробе, на кубический сантиметр или на грамм N как средневзвешенное из двух последовательных разведений, используя следующую формулу:

где - сумма типичных колоний КОЕ во всех чашках, выбранных для подсчета из двух последовательных разведений, из которых хотя бы одна содержит не менее 15 типичных колоний (КОЕ);

n₁ - количество чашек, выбранных для подсчета из первого разведения;

V - объем инокулята, внесенного в каждую чашку, см³;

n₂ - количество чашек, выбранных для подсчета из второго разведения;

d - коэффициент разведения, соответствующий первому выбранному разведению [d = 1 в случае (жидкие продукты), когда исследовался неразведенный жидкий продукт].

Округляют результаты до двух значащих цифр (см. ISO 7218).

За результат принимают количество бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты), выраженное как целое число, округленное до двух значащих цифр (если ниже 100), или как число между 1,0 и 9,9, умноженное на 10 в соответствующей степени.

10.3 Расчет малых количеств

10.3.1 Если в двух чашках [с исследуемой пробой (жидкие продукты) или исходной суспензией (другие продукты) или первым засеянным разведением отсутствуют типичные колонии (КОЕ)] содержится менее 15 типичных колоний КОЕ, рассчитывают количество колоний (КОЕ) бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli, присутствующих в испытуемой пробе, N_E, как среднее арифметическое количество колоний в двух параллельных чашках, используя следующую формулу:

где - сумма типичных колоний КОЕ, подсчитанных в двух чашках;

V - объем инокулята, внесенного в каждую чашку, см³;

n - количество выбранных для подсчета чашек (n = 2 в данном случае);

d - коэффициент разведения, соответствующий первому выбранному разведению [d = 1 в случае (жидкие продукты), когда исследовался неразведенный жидкий продукт].

Округляют результаты до двух значащих цифр (см. ISO 7218).

Выражают результаты следующим образом:

- рассчитанное количество бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты): N_E = Y.

10.3.2 Если в двух чашках [с исследуемой пробой (жидкие продукты) или исходной суспензией (другие продукты), или первым засеянным или сохраненным разведением] отсутствуют типичные колонии КОЕ, результаты выражают следующим образом:

- менее 1/d бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты), где d - коэффициент разведения, соответствующий первому выбранному разведению [d = 1 в случае (жидкие продукты), когда исследовался неразведенный жидкий продукт].

10.3.3 Если для двух чашек из первого разведения d₁ общее количество типичных и нетипичных колоний КОЕ превышает 300 с видимыми типичными колониями КОЕ и если для двух чашек из последующего разведения d₂, содержащих менее 300 колоний, не могут быть подсчитаны типичные колонии КОЕ, выражают результаты следующим образом:

- менее 1/d₂ и более 1/d₁ бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты), где d₁ и d₂ - коэффициенты разведения, соответствующие первому и второму выбранным разведениям.

10.3.4 Если для двух чашек из первого разведения d₁ общее количество типичных и нетипичных колоний КОЕ превышает 300 без видимых типичных колоний КОЕ и если для двух чашек из последующего разведения d₂, содержащих менее 300 колоний, не могут быть подсчитаны типичные колонии КОЕ, выражают результаты следующим образом:

- менее 1/d₂ колоний КОЕ бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты), где d₂ - коэффициент разведения, соответствующий второму разведению.

10.4 Метод подсчета

10.4.1 В случае, когда количество типичных колоний КОЕ превышает 150 для двух чашек из первого разведения d₁ и когда количество типичных колоний КОЕ не превышает 15 для двух чашек из последующего разведения d₂:

- если количество типичных колоний КОЕ в каждой из двух чашек из разведения d₁ находится в диапазоне от 167 до 150 (верхняя часть доверительного интервала средневзвешенного значения, равного 150 КОЕ), следует использовать метод расчета для общего случая (10.2);

- если количество типичных колоний КОЕ в каждой из двух чашек из разведения d₁ превышает 167 (верхний предел доверительного интервала средневзвешенного значения, равного 150 КОЕ), следует принять во внимание только результат подсчетов разведения d₂ и произвести подсчет малых чисел (10.3).

10.4.2 Если в ходе подсчета типичных колоний КОЕ в каждой чашке из всех засеянных разведений получено число, превышающее 150, результат выражают следующим образом:

- более 150/d колоний КОЕ бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты), где d - коэффициент разведения последнего засеянного разведения.

10.4.3 Если только в двух чашках из наименьшего разведения (самая высокая концентрация) содержится менее 150 типичных колоний КОЕ, следует рассчитать количество бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli, присутствующих в анализируемой пробе, N', как среднее арифметическое число колоний, подсчитанных в двух чашках, используя следующую формулу:

где - сумма типичных колоний КОЕ, подсчитанных в двух чашках, в одной из которых содержится как минимум 15 типичных колоний КОЕ;

V - объем инокулята, примененного в каждой чашке, см³;

n - количество сохраненных чашек (n = 2 в данном случае);

d - коэффициент разведения, соответствующий сохраненному разведению.

Округлить результаты до двух значащих цифр (см. ISO 7218).

10.5 Границы доверительного интервала

См. ISO 7218.

В протоколе испытания необходимо указать:

- всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

- использованный метод отбора проб, если известен;

- использованный метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

- все рабочие детали, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, вместе с деталями касающихся всех особых случаев, которые могли оказать влияние на результат(ы);

- полученный(е) результат(ы), четко указывающий(е) на использованный для его выражения метод;

- окончательный результат с учетом воспроизводимости, если она оценивалась.