1. Разработан Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП).

Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 "Продукты переработки плодов и овощей".

2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 22 декабря 1999 г. N 582-ст.

3. Стандарт гармонизирован с европейским стандартом ЕН 12148:1996 "Соки фруктовые и овощные. Определение гесперидина и нарингина в цитрусовых соках. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии".

4. Введен впервые.

Настоящий стандарт распространяется на цитрусовые соки и устанавливает метод определения массовой концентрации гесперидина и нарингина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Диапазон определения массовой концентрации гесперидина и нарингина - от 300 до 2000 мг/дм3.

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 61-75. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 1770-74. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия

ГОСТ 5712-78. Аммоний щавелевокислый 1-водный. Технические условия

ГОСТ 20289-74. Диметилформамид. Технические условия

ГОСТ 24104-88. Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-84. Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб

ГОСТ 26671-85. Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81). Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ Р 51431-99. Соки фруктовые и овощные. Метод определения относительной плотности

ИСО 3696-87 <*>. Вода для лабораторного анализа. Технические условия и методы испытаний.

--------------------------------

<*> Действует до введения в действие ГОСТ Р, разработанного на основе стандарта ИСО.

Метод основан на экстракции гесперидина и нарингина из пробы сока раствором диметилформамида при нагревании и количественном определении их массовых концентраций в экстракте с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с применением обращенно-фазовой колонки и спектрофотометрического детектора в ультрафиолетовой области спектра.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 20 г, 2-го класса точности.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности.

Жидкостный хроматограф, состоящий из:

- насоса высокого давления с верхним пределом давления не менее 25 МПа и диапазоном регулирования подачи растворителя от 0,1 до 5 см3/мин;

- петлевого устройства ввода пробы (инжектора) с рабочим объемом петли 0,020 см3;

- спектрофотометрического детектора с переменной длиной волны, позволяющего проводить измерение оптической плотности при длине волны 287 нм, или детектора с фиксированной длиной волны, позволяющего проводить измерения оптической плотности при длине волны 280 нм, снабженного проточной кварцевой кюветой вместимостью не более 0,01 см3, с относительной погрешностью измерения оптической плотности не более 2%;

- регистрирующего устройства (самописца или интегратора), позволяющего проводить измерения при чувствительности 0,2 мВ/см, с погрешностью записи в рабочих условиях не более 0,5%;

- колонки длиной 250 мм, внутренним диаметром 4 или 4,6 мм, заполненной обращенно-фазовым сорбентом с привитыми октадецильными группами размером частиц 5 мкм.

Микрошприц вместимостью, обеспечивающей полное заполнение петли инжектора.

Баня водяная, пригодная для поддержания температуры (90 +/- 2) °C.

Колбы мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 50, 100 и 1000 см3.

Цилиндры по ГОСТ 1770 вместимостью 250 и 1000 см3.

Фильтры мембранные размером пор не более 0,5 мкм.

Пипетка по ГОСТ 29227 типа 2, исполнения 1, 1-го класса точности, вместимостью 2 и 10 см3.

Аммоний щавелевокислый 1-водный (оксалат аммония) по ГОСТ 5712, х.ч.

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии [1], х.ч.

Диметилформамид по ГОСТ 20289, х.ч.

Кислота уксусная по ГОСТ 61, х.ч.

Вода для лабораторного анализа по ИСО 3696 категории 1.

Нарингин (нарингенин-7-неогесперидозид).

Гесперидин (гесперидин-7-рутинозид).

Допускается использование других средств измерений, лабораторного оборудования и реактивов, по метрологическим и техническим характеристикам не уступающих перечисленным выше.

5.1. Отбор проб - по ГОСТ 26313.

5.2. Подготовка проб к испытаниям - по ГОСТ 26671.

Концентрированные продукты разводят водой до заданного значения относительной плотности в соответствии с нормативным или техническим документом на конкретный вид продукта. Относительную плотность разбавленной пробы определяют по ГОСТ Р 51431 и найденное значение указывают в протоколе испытаний.

Для приготовления растворов, используемых при проведении испытания, и подвижной фазы для ВЭЖХ используют только воду для лабораторного анализа категории 1 по ИСО 3696.

6.1. Приготовление стандартных растворов гесперидина и нарингина

Навески гесперидина и нарингина массой 120 мг каждая переносят в мерные колбы вместимостью 100 см3. В колбы вносят по 20 см3 диметилформамида. Содержимое колб перемешивают до полного растворения кристаллов гесперидина и нарингина, затем объем содержимого в колбах доводят до отметки раствором уксусной кислоты концентрации , содержимое колб тщательно перемешивают. Из полученных основных растворов гесперидина и нарингина массовой концентрации 1200 мг/дм3 готовят рабочие растворы гесперидина и нарингина массовой концентрации 120, 60, 30 и 15 мг/дм3 точным разведением основных растворов в соответствующее количество раз смесью раствора уксусной кислоты концентрации и диметилформамида (8:2 по объему). Срок годности основных и рабочих растворов гесперидина и нарингина - 30 сут при хранении при температуре около 4 °C.

6.2. Приготовление раствора оксалата аммония концентрации 

Навеску оксалата аммония массой 3,55 г переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3, растворяют в 100 - 200 см3 воды, объем содержимого в колбе доводят водой до отметки.

6.3. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

Подвижную фазу для ВЭЖХ готовят смешиванием 200 см3 ацетонитрила, 800 см3 воды и 0,5 см3 уксусной кислоты.

7.1. Экстракция гесперидина и нарингина из пробы сока

Проводят два параллельных определения.

В мерную колбу вместимостью 50 см3 пипеткой вносят 10 см3 исследуемой пробы, 10 см3 раствора оксалата аммония концентрации 0,025 моль/дм3 и 10 см3 диметилформамида. Объем содержимого в колбе доводят водой до отметки, содержимое колбы тщательно перемешивают. После этого колбу с раствором выдерживают на водяной бане при температуре 90 °C в течение 10 мин, затем колбу с раствором охлаждают до комнатной температуры и содержимое колбы фильтруют через мембранный фильтр. Фильтрат используют для хроматографического анализа.

7.2. Хроматографический анализ

Хроматографический анализ рабочих стандартных растворов гесперидина и нарингина и экстрактов из пробы, приготовленных по 7.1, проводят при следующих условиях:

Анализ рабочих стандартных растворов проводят непосредственно перед анализом каждой серии экстрактов.

Регистрируют площади пиков и время удерживания гесперидина и нарингина.

Если площадь пика анализируемого вещества в экстракте из пробы превышает площадь пика этого вещества в рабочем стандартном растворе наибольшей концентрации, экстракт из пробы разводят водой, используя пипетку и мерную колбу подходящей вместимости, и проводят его повторный хроматографический анализ.

Из-за ограниченной стабильности экстрактов продолжительность проведения испытания не должна превышать 24 ч.

Обработку результатов испытания проводят по методу внешнего стандарта, исходя из линейной зависимости площади пика от концентрации гесперидина и нарингина.

Массовую концентрацию гесперидина или нарингина x, мг/дм3, вычисляют по формуле

где S - площадь пика гесперидина или нарингина при анализе экстракта из пробы, ед. площ.;

- объем, до которого доведена проба при приготовлении экстракта, см3;

- объем пробы, взятый для приготовления экстракта, см3;

k - градуировочный коэффициент соответственно для нарингина или гесперидина, ед. площ. x дм3/мг, рассчитываемый по формуле

где - площадь пика гесперидина или нарингина при анализе рабочего стандартного раствора, ед. площ.;

c - концентрация гесперидина или нарингина в рабочем стандартном растворе, мг/дм3.

Примечание. При необходимости определения нарингина и гесперидина в навеске массовую долю этих веществ в продукте , мг/кг, вычисляют по формуле

где m - масса навески, г.

Вычисления проводят до первого десятичного знака.

Относительное расхождение между результатами двух определений, выполненных одним оператором при анализе одной и той же пробы, с использованием одних и тех же средств измерений и реактивов, в течение возможно минимального интервала времени, не должно превышать норматива оперативного контроля сходимости 6% (P = 0,95). При соблюдении этого условия за окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, округленное до целого значения.

Относительное расхождение между результатами двух определений, выполненных в двух лабораториях при анализе одной и той же пробы, не должно превышать норматива оперативного контроля воспроизводимости, 16% (P = 0,95).

Пределы относительной погрешности определения массовой концентрации гесперидина и нарингина при соблюдении условий, регламентируемых настоящим стандартом, не превышают +/- 11% (P = 0,95).

В протоколе испытаний указывают:

- информацию, необходимую для идентификации исследуемого продукта (вид продукта, происхождение, шифр);

- ссылку на настоящий стандарт;

- дату и способ отбора проб (по возможности);

- дату получения пробы для испытаний;

- дату проведения испытаний;

- результат испытаний с указанием погрешности и единицы измерений;

- соблюдение норматива контроля сходимости результатов;

- особенности проведения испытаний (разведение концентрированной пробы, относительную плотность разведенной пробы и пр.);

- отклонения условий проведения испытаний от описанных в стандарте, которые могли повлиять на результат.

[1] ТУ 6-09-06-1092-83. Ацетонитрил для жидкостной хроматографии.