1. Разработан Московским государственным университетом пищевых производств.

Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность".

2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 25 декабря 1998 г. N 463.

3. Настоящий стандарт представляет собой аутентичный текст национального стандарта ФРГ ДИН ЕН 1140-94 "Фруктовые и овощные соки. Ферментативное определение D-глюкозы и D-фруктозы. Спектрофотометрическое определение НАДФH (никотинамидадениндинуклеотидфосфата)" с дополнительными требованиями, отражающими потребности народного хозяйства (разделы 2, 5, 7, 8 и 9 и пункт 6.1).

4. Введен впервые.

Настоящий стандарт распространяется на фруктовые и овощные соки, нектары и сокосодержащие напитки и устанавливает метод определения массовых концентраций D-глюкозы и D-фруктозы.

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 3769-78. Аммоний сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4201-79. Натрий углекислый кислый. Технические условия

ГОСТ 4328-77. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 4523-77. Магний сернокислый 7-водный. Технические условия

ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия.

3.1. В настоящем стандарте применяют следующий термин с соответствующими определениями:

Массовые концентрации D-глюкозы и D-фруктозы во фруктовых и овощных соках, нектарах и сокосодержащих напитках: массовые концентрации D-глюкозы и D-фруктозы, определенные раздельно в соответствии с настоящим стандартом и выраженные в граммах на кубический дециметр.

3.2. В настоящем стандарте применяют следующие обозначения и сокращения.

АТФ - аденозин-5'-трифосфат;

АДФ - аденозин-5'-дифосфат;

НАДФ - ;

НАДФH - (восстановленная форма);

Г-6-Ф - глюкозо-6-фосфат;

Ф-6-Ф - фруктозо-6-фосфат;

ГК - гексокиназа;

Г6Ф-ДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа;

ФГИ - фосфоглюкозоизомераза;

E - международная единица, определяет количество (активность) фермента, которое служит катализатором для превращения при 25 °C 1 мкмоля вещества в минуту.

4.1. Сущность метода

Метод [1, 2] основан на фосфорилировании D-глюкозы и D-фруктозы под действием АТФ в присутствии ГК с образованием Г-6-Ф и Ф-6-Ф, преобразовании Г-6-Ф под действием НАДФ в присутствии Г6Ф-ДГ в глюконат-6-фосфат и НАДФH, фотометрическом измерении массовой концентрации образовавшегося НАДФH, эквивалентной массовой концентрации D-глюкозы; изомеризации Ф-6-Ф в Г-6-Ф в присутствии ФГИ, преобразовании Г-6-Ф под действием НАДФ в присутствии Г6Ф-ДГ в глюконат-6-фосфат и НАДФH, фотометрическом измерении массовой концентрации образовавшегося НАДФH, эквивалентной массовой концентрации D-фруктозы в пробе.

4.2. Реакции, происходящие при определении D-глюкозы:

4.3. Реакции, происходящие при определении D-фруктозы:

5.1. Общие требования

При проведении анализа используют химически чистые или чистые для анализа реактивы.

Допускается использовать имеющиеся в продаже готовые наборы реактивов для определения D-глюкозы и D-фруктозы при условии, что качество реактивов не ниже указанного в настоящем стандарте.

Препараты триэтаноламингидрохлорида, динатриевой соли и динатриевой соли аденозин-5'-трифосфата должны содержать не менее 90% основного вещества.

5.2. Буферный раствор гидрохлорида триэтаноламина активной кислотностью 7,6 pH

14,0 г триэтаноламингидрохлорида и 0,25 г сернокислого магния по ГОСТ 4523 растворяют в 80 см3 дистиллированной воды по ГОСТ 6709. Активную кислотность раствора устанавливают равной 7,6 pH приблизительно 5 см3 раствора гидроокиси натрия по ГОСТ 4328 молярной концентрации c (NaOH) = 5 моль/дм3. Объем раствора доводят дистиллированной водой до 100,0 см3. Буферный раствор устойчив при температуре 4 °C 1 мес.

5.3. Раствор НАДФ

0,06 г динатриевой соли растворяют в 6 см3 дистиллированной воды по ГОСТ 6709. Раствор устойчив при температуре 4 °C 1 мес.

5.4. Раствор АТФ

0,3 г динатриевой соли аденозин-5'-трифосфата и 0,3 г углекислого кислого натрия по ГОСТ 4201 растворяют в 6 см3 дистиллированной воды по ГОСТ 6709. Раствор устойчив при температуре 4 °C 1 мес.

5.5. Суспензия ферментов ГК и Г6Ф-ДГ

Раствор гексокиназы массовой долей 0,002 г/см3 и удельной активностью не менее 280 E/см3, содержащий глюкозу в качестве субстрата и АТФ, и раствор глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы массовой долей 0,001 г/см3 и удельной активностью не менее 140 E/см3, содержащий глюкозо-6-фосфат в качестве субстрата, смешивают с раствором сернокислого аммония по ГОСТ 3769 молярной концентрации . Суспензия устойчива при температуре 4 °C 12 мес.

5.6. Суспензия фермента ФГИ

Раствор фосфоглюкозоизомеразы массовой концентрацией 0,002 г/см3, удельной активностью не менее 700 E/см3, содержащий фруктозо-6-фосфат в качестве субстрата, суспендируют в растворе сернокислого аммония по ГОСТ 3769 молярной концентрации . Суспензия устойчива при температуре 4 °C 12 мес.

Обычная лабораторная аппаратура, а также указанная в 6.1 - 6.4.

6.1. Дозаторы пипеточные [3] объемами доз 100, 50 и 25 см3 и относительной погрешностью дозирования +/- 1% или пипетки градуированные номинальной вместимостью 2,0; 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 и 0,02 см3 и допускаемой относительной погрешностью +/- 1%.

6.2. Кюветы фотометрические из оптического стекла или пластмассы толщиной поглощающего слоя 1 см для измерений при длинах волн 334, 340 или 365 нм.

6.3. Шпатели пластиковые или палочки стеклянные оплавленые длиной от 10 до 15 см для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.

6.4. Спектрофотометр или фотометр фотоэлектрический для измерений при длинах волн 334, 340 или 365 нм, допускаемой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания +/- 1%.

6.5. Весы лабораторные общего назначения наибольшим пределом взвешивания 20 г и допускаемой погрешностью +/- 0,0001 г.

7.1. Подготовка пробы к испытанию

Как правило, пробы не нуждаются в особых методах подготовки к испытаниям. Результаты испытаний по настоящей методике выражают в граммах на кубический дециметр.

Испытания концентрированных продуктов проводят после их разбавления дистиллированной водой до получения значения относительной плотности разбавленного продукта согласно рецептурам натурального сока, нектара или сокосодержащего напитка. При этом относительную плотность разбавленной пробы выражают в граммах на кубический дециметр.

Результаты испытаний концентрированного продукта могут быть также выражены в граммах на килограмм. При расчете результата испытаний учитывают массу пробы концентрированного продукта и фактор разбавления.

При испытании продуктов высокой вязкости и/или с очень большим содержанием мякоти результаты испытаний выражают в граммах на килограмм продукта.

Продукты с мутной взвесью перед испытанием хорошо перемешивают.

Пробу разбавляют дистиллированной водой до получения значений массовых концентраций D-глюкозы и D-фруктозы в интервале от 0,1 до 1,0 г/дм3. Допускается использование при проведении испытания окрашенной разбавленной пробы.

7.2. Определение

7.2.1. Общие требования

Определение проводят при постоянной температуре в интервале от 20 до 25 °C. Допускается проводить определения при постоянной температуре в интервале от 25 до 37 °C при условии получения равноценных результатов.

Абсорбционный максимум НАДФH находится при длине волны 340 нм. При использовании спектрофотометра переменной длины волны все измерения проводят при максимуме поглощения света НАДФH. При использовании спектрофотометра с ртутной лампой измерения проводят при длинах волн 334 или 365 нм.

Для дозирования буферных растворов, а также растворов проб, ферментов и коферментов используют только градуированные пипетки или автоматические дозаторы.

7.2.2. Контрольный раствор

В фотометрическую кювету вносят 1,00 см3 раствора триэтаноламингидрохлорида по 5.2, 0,10 см3 раствора НАДФ по 5.3, 0,10 см3 раствора АТФ по 5.4 и 2,00 см3 дистиллированной воды. Раствор перемешивают пластиковым шпателем или стеклянной палочкой, выдерживают 3 мин и измеряют оптическую плотность раствора - относительно оптической плотности воздуха.

7.2.3. Раствор пробы

В фотометрическую кювету вносят 1,00 см3 буферного раствора триэтаноламингидрохлорида по 5.2, 0,10 см3 раствора НАДФ по 5.3, 0,10 см3 раствора АТФ по 5.4, 0,10 см3 подготовленной пробы по 7.1 и 1,90 см3 дистиллированной воды. Раствор перемешивают пластиковым шпателем или стеклянной палочкой, выдерживают 3 мин и измеряют оптическую плотность раствора - относительно оптической плотности воздуха.

7.2.4. Ферментативная реакция и количественное определение

В каждую из кювет с контрольным раствором по 7.2.2 и раствором пробы по 7.2.3 вносят по 0,02 см3 суспензии ГК и Г6Ф-ДГ по 5.5, перемешивают пластиковым шпателем или стеклянной палочкой и выдерживают от 10 до 15 мин. Затем измеряют оптические плотности растворов - и относительно оптической плотности воздуха.

Окончание реакции проверяют повторным считыванием показаний спектрофотометра через 2 мин. Если ферментативная реакция не завершилась через 15 мин и оптические плотности растворов увеличиваются с течением времени, то значения и определяют методом экстраполяции на момент внесения суспензии ферментов ГК и Г6Ф-ДГ по 5.5.

Далее в каждую из кювет с контрольным раствором по 7.2.2 и раствором пробы по 7.2.3 вносят по 0,02 см3 суспензии фермента ФГИ по 5.6, перемешивают пластиковым шпателем или стеклянной палочкой, выдерживают от 10 до 15 мин и затем измеряют оптические плотности растворов - и относительно оптической плотности воздуха.

Окончание реакции проверяют повторным считыванием показаний спектрофотометра через 2 мин. Если ферментативная реакция не завершилась через 15 мин и оптические плотности растворов увеличиваются с течением времени, то значения и определяют методом экстраполяции на момент внесения фермента ФГИ по 5.6.

8.1. В ферментативных реакциях, лежащих в основе данного метода, образующийся в кювете НАДФH приводит к изменению оптических плотностей растворов , а его массовые концентрации пропорциональны массовым концентрациям D-глюкозы и D-фруктозы.

8.2. Массовую концентрацию D-глюкозы в пробе и/или D-фруктозы в пробе , г/дм3, вычисляют в соответствии с законом Ламберта-Бера по формуле

где M - молярная масса глюкозы или фруктозы, 180,16 г/моль;

- общий объем раствора в кювете, см3;

F - фактор разбавления по 7.1;

- молярный коэффициент поглощения НАДФH, ;

- при длине волны 340 нм - 6,3,

- при длине волны 365 нм - 3,4 (ртутная лампа),

- при длине волны 334 нм - 6,18 (ртутная лампа);

- толщина поглощающего слоя в кювете, см;

- объем пробы, см3.

Если нет отклонений от объемов, указанных в 7.2.2 и 7.2.3, то

8.3. При использовании имеющихся в продаже наборов реактивов численные коэффициенты (5,801 и 5,837) в уравнениях (9) и (10) могут быть иными из-за изменения общего объема раствора в кювете.

8.4. За результат испытаний принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, округленное до десятых долей.

9.1. Сходимость

Абсолютные расхождения между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должны превышать более чем в 5% случаев значений показателей сходимости r, г/дм3, рассчитываемых по формулам для:

где - среднее арифметическое результатов двух параллельных определений массовой концентрации D-глюкозы;

- среднее арифметическое результатов двух параллельных определений массовой концентрации D-фруктозы.

9.2. Воспроизводимость

Абсолютные расхождения между результатами двух измерений, выполненных в двух лабораториях, не должны превышать более чем в 5% случаев значений показателей воспроизводимости R, г/дм3, рассчитываемых по формулам для:

где - среднее арифметическое результатов двух измерений массовой концентрации D-глюкозы;

- среднее арифметическое результатов двух измерений массовой концентрации D-фруктозы.

В отчете об испытании должны быть указаны:

- информация, которая необходима для идентификации пробы (вид пробы, ее происхождение, описание);

- ссылка на настоящий стандарт;

- дата и способ отбора пробы (если возможно);

- дата доставки пробы;

- результаты испытаний и наименования единиц измерений, в которых они приводятся;

- дата испытаний;

- информация о выполнении условий воспроизводимости метода;

- замечания об особенностях проведения испытаний;

- особые условия проведения испытаний, которые не учтены настоящим стандартом, но могли бы оказать влияние на результаты испытаний.

Проведенное в соответствии с [4] круговое испытание дало следующие характеристики точности метода для глюкозы и фруктозы, приведенные в таблицах А.1 и А.2.

Испытание проводилось под руководством Отдела пищевой химии Института Макса фон Петтенкофера Федерального министерства здравоохранения, г. Берлин, ФРГ.

Год проведения кругового испытания - 1983.

Число участвовавших лабораторий - 22.

Количество проб - 4.

[1] Bestimmung der Glucose und Fructose; Enzymatisch: Nr. 55, 1985. - In: Analysen/Sammlung] Internationale Fruchtsaft - Union. - Loseblattausgabe, stand 1989. Zug: Schweizerischer Obstverband

[2] Untersuchung von Lebensmitteln: Bestimmung von Glucose und Fructose in Fruchtsaeften: L31.00-12, 1984-11. - In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG: Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfgegenstaenden/Bundesgesund-heitsamt. Loseblattausgabe, Stand 31.12.1991, Bd. 1. - Berlin, Koeln: Beuth Verlag GmbH

[3] ТУ 64-13329-81. Дозаторы пипеточные

[4] ИСО 5725:1986. Точность методов испытания. Определение повторяемости и воспроизводимости для метода стандартного испытания с помощью межлабораторных испытаний.