1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт птицеперерабатывающей промышленности" Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ "ВНИИПП" Россельхозакадемии) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. N 1615-ст

4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 13496:2000 "Мясо и мясные продукты. Обнаружение красителей. Метод с применением тонкослойной хроматографии" (ISO 13496:2000 "Meat and meat products - Detection of colouring agents - Method using thin-layer chromatography", IDT).

ИСО 13496 подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 34 "Пищевые продукты", Подкомитетом SC 6 "Мясо и мясные продукты".

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им национальные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

6 Следует иметь в виду, что некоторые элементы международного стандарта могут быть объектом патентных прав. ISO не несет ответственность за идентификацию какого-либо одного или всех патентных прав

7 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Октябрь 2019 г.

Настоящий стандарт устанавливает метод тонкослойной хроматографии для обнаружения синтетических водорастворимых красителей в мясе и мясных продуктах.

Данный метод может быть использован для обнаружения следующих красителей:

Синонимы и идентификационные номера этих красителей приведены в приложении A.

Растительные красители и растительные экстракты, не препятствующие обнаружению с помощью данного метода, приведены в приложении B.1.

Натуральные красители, которые в некоторых случаях могут препятствовать обнаружению по данному методу, приведены в приложении B.2.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты. Для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных - последнее издание (включая все изменения).

ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

AOAC 46.1.08:1995, Official Methods of Analysis (AOAC International) (Официальные методы анализа)

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1 обнаружение красителей: Обнаружение наличия или отсутствия красителей с помощью метода, описанного в настоящем стандарте.

Красители экстрагируют из пробы горячей водой и адсорбируют на полиамидном порошке. Экстрагированные красители очищают с помощью колоночной хроматографии и затем элюируют из колонки. Идентификацию красителей проводят с помощью метода тонкослойной хроматографии.

Используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если не указано иное.

5.1 Вода, соответствующая по крайней мере степени чистоты 3 по ИСО 3696.

5.2 Петролейный эфир с диапазоном температуры кипения от 40 °C до 60 °C.

5.3 Метанол.

5.4 Аммиак, 25%-ный водный раствор, .

5.5 Кислота уксусная массовой долей 100%, .

5.6 Цитрат натрия дигидрат.

5.7 Пропан-1-ол.

5.8 Этилацетат.

5.9 2-Метил-2-пропанол.

5.10 Кислота пропионовая.

Смешивают 95 объемов метанола (см. 5.3) с пятью объемами раствора аммиака (см. 5.4).

Смешивают один объем уксусной кислоты (см. 5.5) с одним объемом метанола (см. 5.3).

5.13 Полиамидный порошок с размером частиц от 0,05 до 0,16 мм.

5.14 Песок мелкозернистый, промытый в соляной кислоте и прокаленный.

Чистота стандартов красителей может быть различной, поэтому необходимо знать чистоту красителей, используемых в качестве стандартов. Чистота должна определяться по методу AOAC 46.1.08.

Примечание - Сертифицированные пищевые красители также могут использоваться в качестве стандартов.

Стандартные водные растворы каждого красителя (см. 5.15) концентрацией около 1 г/дм³ готовят отдельно.

Растворы индигокармина готовят в день использования. Растворы других красителей могут храниться в темноте не более трех месяцев (растворы эритрозина - в течение одного месяца).

В мерной колбе с одной отметкой вместимостью 1000 см³ взвешивают 25 г дигидрата цитрата натрия (см. 5.6) с точностью 0,1 г. Растворяют в воде, доводят до метки водой и перемешивают.

Смешивают 80 объемов полученного раствора цитрата с 20 объемами раствора аммиака (см. 5.4) и 12 объемами метанола (см. 5.3).

Для предотвращения или снижения влияния сафлора или шафрана рекомендуется использовать раствор II (см. 5.18).

Смешивают шесть объемов пропан-1-ола (см. 5.7) с одним объемом этилацетата (см. 5.8) и тремя объемами воды.

Смешивают 50 объемов 2-метил-2-пропанола (см. 5.9) с 12 объемами пропионовой кислоты (см. 5.10) и 38 объемами воды.

Применяется обычное лабораторное оборудование, и в частности следующее.

Используют высокоскоростной измельчитель куттерного типа или мясорубку с диаметром отверстий решетки не более 4,0 мм.

6.2 Пробирки центрифужные стеклянные вместимостью 75 см³.

6.3 Колбы плоскодонные вместимостью 250 см³ с притертыми стеклянными пробками.

6.4 Колбы круглодонные вместимостью 100 см³ с притертыми стеклянными пробками.

6.5 Центрифуга, обеспечивающая радиальное ускорение примерно 2000 g_n.

6.6 Испаритель ротационный.

6.7 Колонка хроматографическая стеклянная с пористым фильтром и краном, длиной около 20 см, диаметром около 30 мм и размером пор фильтра от 40 до 100 мкм (класс пористости P 100 по [2]).

В колонку помещают небольшой кусок стекловаты и добавляют от 1 до 2 г песка (см. 5.14).

6.8 Емкость из пластика вместимостью около 10 см³ с крышкой.

6.9 Пластинки для тонкослойной хроматографии, покрытые слоем порошка из целлюлозы толщиной 0,10 мм, или эквивалентные пластинки.

Допускается использование готовых пластинок.

6.10 Микропипетки вместимостью около 5 мм³.

6.11 pH-метр, обеспечивающий измерение с точностью до 0,1 pH.

Отбор проб не является частью метода, установленного настоящим стандартом. Рекомендуемый метод отбора проб приведен в [1].

Важно, чтобы в лабораторию поступала представительная проба, которая не была повреждена или изменена во время транспортирования или хранения.

Масса пробы должна быть не менее 200 г. Пробу необходимо хранить таким образом, чтобы не допустить ее порчи и изменения состава.

Лабораторную пробу гомогенизируют с помощью соответствующего оборудования (см. 6.1). При этом принимают меры, чтобы температура материала пробы не превышала 25 °C. При использовании мясорубки пробу необходимо измельчить не менее двух раз.

Подготовленную пробу помещают в соответствующую герметичную емкость. Емкость закрывают крышкой и хранят таким образом, чтобы не допустить порчи и изменения состава пробы. Анализ пробы проводят как можно скорее, но не более чем в течение 24 ч после гомогенизации.

В центрифужной пробирке (см. 6.2) взвешивают 5 г подготовленной пробы (см. раздел 8) с точностью до 0,1 г.

Дальнейшие процедуры для проб, содержащих жир, описаны в 9.2.

Дальнейшие процедуры для проб, не содержащих жир, описаны в 9.3.

В центрифужную пробирку добавляют около 20 см³ петролейного эфира (см. 5.2) и перемешивают стеклянной палочкой. Петролейный эфир декантируют.

Эту процедуру повторяют три раза.

В центрифужную пробирку добавляют 25 см³ кипящей воды (см. предупреждение выше) и перемешивают. Добавляют 25 см³ элюента (см. 5.11).

С помощью pH-метра (см. 6.11) проверяют, находится ли pH в интервале (9 +/- 0,5) ед. pH. Если pH выходит за указанный интервал, то его доводят до необходимой величины уксусной кислотой (см. 5.5) или раствором аммиака (см. 5.4).

Тщательно перемешивают. Охлаждают пробу в морозильной камере в течение 15 мин (для предотвращения помутнения).

Центрифугируют (см. 6.5) в течение 10 мин при радиальном ускорении около 2000 g_n.

Декантируют прозрачный раствор в плоскодонную колбу (см. 6.3). В случае присутствия индигокармина используют круглодонную колбу (см. 6.4).

В центрифужную пробирку, содержащую осадок, добавляют 5 см³ воды. Перемешивают и добавляют 10 см³ элюента (см. 5.11). Снова перемешивают и центрифугируют, как описано выше.

Эту процедуру повторяют, пока все красители не экстрагируются из пробы, затем объединяют все экстракты.

Смешанный экстракт упаривают на водяной бане до объема около 25 см³ для удаления метанола. В случае присутствия индигокармина используют круглодонную колбу (см. 6.4) и ротационный испаритель (см. 6.6) при температуре 35 °C.

Добавляют 25 см³ кипящей воды (см. предупреждения) и перемешивают.

С помощью уксусной кислоты (см. 5.5) или раствора аммиака (см. 5.4) доводят pH до значения от 4 до 5 ед. pH.

К теплому раствору (см. предупреждения) добавляют 1 г полиамидного порошка (см. 5.13). Энергично встряхивают в течение 1 мин.

Дают возможность порошку сформировать осадок.

Проверяют, окрашен ли раствор. Если раствор окрашен, то добавляют еще немного полиамидного порошка и энергично встряхивают.

Примечание - Некоторые натуральные красители (см. приложение B) не полностью адсорбируются на полиамидном порошке, оставляя раствор окрашенным, даже если все синтетические красители были полностью адсорбированы. Обычно по типу пробы можно заключить, присутствуют ли в ней такие натуральные красители.

Встряхивают и переносят теплую суспензию в хроматографическую колонку (см. 6.7).

Промывают плоскодонную колбу тремя порциями по 10 см³ горячей воды (см. предупреждения), добавляют каждый раз промывные воды в колонку. Промывают колонку другими тремя порциями по 10 см³ горячей воды (см. предупреждения) и затем тремя порциями по 5 см³ метанола (см. 5.3). Если натуральные красители элюируются, то продолжают промывать колонку метанолом, пока он не обесцветится.

Помещают колбу (см. 6.4) под колонкой и элюируют красители из полиамидного порошка порциями по 5 см³ элюента (см. 5.11) при объемной скорости потока элюента 2 см³/мин, пока полиамид не станет бесцветным.

Выпаривают полученный элюат досуха с помощью испарителя (см. 6.6) при температуре не выше 35 °C (см. предупреждения).

В зависимости от содержания и числа красителей, добавляют 1,0 или 2,0 см³ элюента (см. 5.11) и растворяют высушенный остаток. Помещают раствор красителей в пластиковую емкость (см. 6.8).

Готовят три стандартные пластинки для тонкослойной хроматографии со стандартными растворами (см. 5.16). Используя микропипетку (см. 6.10), наносят около 5 мм³ каждого стандартного раствора (см. 5.16) отдельно на каждую пластинку в виде пятна (диаметр < 5 мм) на каждую пластинку (см. 6.9). Развитие хроматограмм на пластинках проводят отдельно в ненасыщенных камерах с каждым из элюентов для хроматографии (см. 5.17, 5.18 и 5.19), пока фронт растворителя не достигнет расстояния около от 10 до 12 см от стартовой линии. Вынимают пластинки из камеры и сушат на воздухе в вытяжном шкафу. Пластинки хранят в темном месте. Пятна всех красителей, за исключением индигокармина, являются устойчивыми в течение нескольких лет.

На пластинку для тонкослойной хроматографии (см. 6.9) с помощью микропипетки (см. 6.10) наносят едва видимое количество раствора пробы (см. 9.5). Сушат пластинку с помощью фена. В случае присутствия индигокармина сушат на воздухе.

Развитие хроматограммы на пластинке проводят в ненасыщенной камере до высоты около от 10 до 12 см, используя подходящий раствор для хроматографии (см. 5.16, 5.17 или 5.18), то есть тот раствор, который обеспечивает наилучшее разделение красителей, обнаруженных в пробе (см. раздел 1). В некоторых случаях для получения наилучшего разделения может потребоваться приготовление второй пластинки с пробой и развитие хроматограммы с одним из двух других элюентов.

Вынимают пластинку из камеры и сушат на воздухе в вытяжном шкафу.

Сравнивают пятна на пластине с пробой с пятнами на соответствующих пластинах со стандартными растворами (см. 9.6.1).

В случае присутствия смеси красителей рекомендуется наносить различные количества раствора пробы, так как в концентрате красители могут присутствовать в разных концентрациях.

Образование "хвостов" обычно вызвано недостаточной очисткой. При наличии "хвостов" краситель снова адсорбируют адсорбентом, промывают горячей водой и выделяют из адсорбента, как описано выше.

Идентичность красителей подтверждают хроматографированием концентрата (см. 9.6.2) в смеси со стандартными красителями, идентифицированными на первой хроматограмме.

В сомнительных случаях краситель элюируют с пластинки нейтральным раствором (вода, или этиловый спирт, или раствор ацетата аммония концентрацией 0,2 г/дм³), кислотой (соляная кислота концентрацией 0,1 моль/дм³) и щелочью (раствор гидроокиси натрия концентрацией 0,1 моль/дм³) и сравнивают спектр поглощения красителя со спектром стандарта. Спектры поглощения красителей представлены в приложении C.

Примечание - Участок пластинки с пятном анализируемого красителя осторожно соскабливают скальпелем, помещают в пробирку, добавляют несколько см³ нейтрального элюирующего раствора (см. выше в 9.7) и энергично встряхивают (если краситель не элюируется, то используют другой раствор из перечисленных выше в 9.7). Отфильтрованный через фильтровальную бумагу или слой ваты раствор помещают в кювету спектрофотометра и регистрируют спектр поглощения в диапазоне длин волн от 350 до 750 нм. Полученный спектр сравнивают качественно со спектрами поглощения стандартных растворов красителей, приведенными в приложении C.

В протоколе должны быть указаны:

- вся информация, необходимая для полной идентификации пробы;

- использованный метод отбора проб, если он известен;

- использованный метод анализа со ссылкой на настоящий стандарт;

- все особенности методики, не указанные в настоящем стандарте или считающиеся необязательными, а также все факторы, которые могут повлиять на результат(ы) испытания;

- полученный(е) результат(ы) испытаний.

Известно, что следующие красители растительного происхождения или растительные экстракты, не препятствующие обнаружению по данному методу:

В некоторых случаях натуральные красители могут препятствовать обнаружению данным методом. В таблице B.2.1 приведено их применение в пищевых продуктах, а также синтетические красители, обнаружению которых эти натуральные красители могут препятствовать.