Наставление разработано Всероссийским Государственным научно-исследовательским институтом контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов, Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии.

Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 17.12.98 г., протокол N 5, N ПВР 1.05.0867-98

1.1. Тест-система предназначена для выявления ДНК Chlamydia psittaci методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в биологическом материале от животных и птиц. В основе метода лежит многократное повторение циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе при температуре 95 °C, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) при температуре 62 гр. C и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента при температуре 72 °C.

В данной тест-системе используется неконкурентный внутренний стандарт (фрагмент ДНК фага лямбда, позволяющий контролировать эффективность протекания всего процесса для каждой исследуемой пробы).

В состав тест-системы, рассчитанной на проведение 100 анализов, входят:

- набор для выделения ДНК (набор N 1)

- набор для проведения ПЦР (набор N 2)

- набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР (набор N 3)

1.2. Набор для выделения ДНК состоит из следующих компонентов:

Лизирующий раствор - 1 флакон 30,0 мл

Отмывочный раствор N 1 - 1 пробирка, 20,0 мл

Концентрат для отмывочного раствора N 2 - 1 пробирка, 20,0 мл

Суспензия сорбента - 2 пробирки по 2,0 мл

Буфер для элюции ДНК с сорбента - 2 пробирки по 5,0 мл

1.3. Набор для проведения ПЦР состоит из следующих компонентов:

Смесь праймеров "Chla" - 1 пробирка, 0,25 мл

Смесь праймеров "ВС-Л" - 1 пробирка, 0,25 мл

Смесь нуклеотидов - 1 пробирка, 0,5 мл

5-кратный реакционный буфер - 1 пробирка, 1,0 мл

Деионизованная вода - 1 пробирка, 2,0 мл

Фермент Taq-полимераза - 1 пробирка, 0,1 мл

Положительная контрольная ДНК (ДНК C. psittaci) - 1 пробирка, 0,2 мл

ДНК внутреннего стандарта (ДНК ВС-Л) - 1 пробирка, 1,0 мл

Воск для ПЦР - 2 пробирки по 1,0 мл

Масло минеральное - 1 пробирка, 5,0 мл

1.4. Набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР состоит из следующих компонентов:

Концентрат буфера с бромидом этидия - 3 флакона по 25,0 мл

Агароза для электрофореза - 3 пробирки по 2,0 г

1.5. Тест-система должна быть упакована в картонную коробку с этикеткой, на которой указаны: полное наименование тест-системы, перечень наборов, входящих в него, наименование предприятия-изготовителя, номер серии, номер контроля, дата изготовления и срок годности, условия хранения и обозначения ТУ. В каждую упаковку вкладывают наставление по применению тест-системы.

Внутрь коробки тест-системы вложены три запаянных полиэтиленовых пакета с вышеперечисленными наборами. На этикетке каждого из наборов должно быть указано наименование набора, перечень компонентов, количество пробирок каждого компонента, количество препарата в каждой пробирке, номер серии набора, дата изготовления, срок годности, условия хранения.

На пробирки с каждым компонентом должна быть нанесена этикетка с указанием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке, номера серии и даты изготовления.

1.6. Тест-систему транспортируют и хранят при температуре 2 - 8 гр. C.

При получении и вскрытии коробки тест-системы исследователем можно хранить набор для выделения ДНК и набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР - при температуре 2 - 25 гр. C в темном сухом месте, а набор для прове-нии ПЦР - при температуре 2 - 8 гр. C.

1.7. Срок годности тест-системы - 6 мес со дня изготовления.

2.1. При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями по данному вопросу.

2.2. Для исследования используют:

- соскобы слизистых оболочек (конъюнктивы, урогенитального тракта, а у птиц - клоаки), помет птиц;

- паренхиматозные органы павших или вынужденно убитых животных, кусочки плодовых оболочек, паренхиматозные органы и перевязанный с двух сторон сычуг аборт-плодов, сперму замороженную (или пробы эякулята), мочу от производителей, подозрительных по заболеванию.

2.3. Жидкости для исследования отбирают в объеме 20 мл, из тканей и органов вырезают кусочки размером 3 x 3 x 3 см (при невозможности толщина кусочков может быть меньше).

2.4. Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий день, сохраняя при 4 °C. Допускается хранение материала при минус 20 °C в течение 1 мес. Пробы мочи нужно доставлять в тот же день.

3.1. Все манипуляции, связанные с подготовкой проб, проводятся пипеточными дозаторами переменных объемов (типа "Ленпипет") с использованием одноразовых полипропиленовых пробирок на 1,5 мл и 10,0 мл (ПО "Ленполимер") и наконечников с аэрозольным барьером. Одноразовая пластиковая посуда (пробирки, наконечники) после применения должна сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 10%-ный раствор хлорной извести или 5%-ный раствор хлорамина Б. После 3-часовой выдержки раствор выливают в канализацию, а отработанный пластик выбрасывают в мусорный контейнер.

3.2. Пробы исследуемых жидкостей, в объеме 10 мл (при необходимости объем проб доводят до требуемого путем добавления физиологического раствора) и центрифугируют при 3*10 куб. об/мин в течение 10 - 15 мин. Супернатант осторожно сливают, оставив над осадком примерно 0,5 мл жидкости. Осадок ресуспендируют в оставшейся надосадочной жидкости, переносят в пробирку типа "эппендорф" и осаждают на микроцентрифуге при (11 - 12)*10 куб. об/мин в течение 8 - 10 мин. Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения ДНК.

3.3. Пробы органов, плодовых оболочек, размером 3 x 3 x 3 мм помещают в пробирки типа "эппендорф" тщательно растирают отдельными стеклянными палочками, добавляют по 1 мл физиологического раствора и тщательно перемешивают. Смесь отстаивают при температуре 20 - 25 °C в течение 30 мин, после чего верхнюю фазу переносят в другие пробирки типа "эппендорф" и центрифугируют при (11 - 12)*10 куб. об/мин в течение 8 - 10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения ДНК.

3.4. Сперму в объеме 0,5 мл разводят равным объемом физиологического раствора, осаждают на микроцентрифуге при 5*10 куб. об/мин в течение 3 - 5 мин, надосадочную жидкость используют для выделения ДНК.

3.5. Соскоб слизистых оболочек разводят в 0,5 - 1,0 мл физиологического раствора, осаждают на микроцентрифуге при (11 - 12)*10 куб. об/мин в течение 8 - 10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения ДНК. Если слизь очень густая (не всасывается в отверстие наконечника пипетки), то к пробе добавляют 1 - 2 мл раствора меркаптоэтанола (0,1М), разменивают на вортексе, оставляют на рабочем столе на 3 - 5 мин, а затем центрифугируют в вышеуказанном режиме. Осадок ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения ДНК.

3.6. Пробы помета птиц 0,1 - 0,2 г вносят в пробирку с 0,5 мл физиологического раствора, перемешивают и осаждают на микроцентрифуге при 2*10 куб. об/мин, в течение 1 мин. Из надосадочной жидкости выделяют ДНК.

4.1. ПЦР-анализ проводят в три этапа в трех отдельных помещениях (зонах), для работы в которых требуются следующие материалы и оборудование:

Для выделения ДНК из испытуемого материала - ЗОНА 1

- 100 мл спирта этилового ректификованного по ГОСТ 5962-67;

- настольный бокс с бактерицидной лампой "Циклотемп" (СП "РТС");

- термостат для пробирок типа "эппендорф" на 25 - 100 гр. C (фирма "Биоком");

- микроцентрифуга до (12 - 16)*10 куб. об/мин ("Elmi", "Hettish");

- центрифуга/вортекс "Micro-spin", "Minigen" ("Биоком");

- отдельный набор автоматических пипеток переменного объема ("Биоком");

- одноразовые наконечники с аэрозольным барьером ("Биоком" "Хеликон");

- одноразовые полипропиленовые пробирки на 1,5 мл типа "эппендорф" ("Хеликон");

- штативы для пробирок, наконечников ("Хеликон");

- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;

- холодильник на 2 - 8 гр. C с морозильной камерой на минус 20 °C.

Для проведения амплификации (ПЦР) - ЗОНА 2

- амплификатор ("ДНК-технология", "Perkin elmer");

- ПЦР-бокс "Циклотемп" (СП "РТС") или отдельный стол с УФ-лампой;

- отдельный халат и одноразовые перчатки;

- отдельный набор автоматических пипеток переменного объема ("Биоком");

- одноразовые наконечники в штативах ("Биоком");

- одноразовые микропробирки для ПЦР на 0,5 мл ("Хеликон");

- штативы для микропробирок на 0,5 мл ("Хеликон");

- холодильник на 2 - 8 гр. C, морозильник на минус 20 °C для выделенных ДНК;

- термостат для микропробирок с воском на 95 °C ("Биоком").

Для электрофоретического анализа продуктов ПЦР - ЗОНА 3

- камера для горизонтального электрофореза ("Хеликон", "ДНК-технология") на 50 проб;

- источник постоянного тока с напряжением 150 - 200 В ("ДНК-технология");

- ультрафиолетовый трансиллюминатор для просмотра гелей ("Биоком");

- фотоаппарат для фотографирования гелей и фотопленка "Микрат-300";

- бачок для проявления пленки, проявитель, фиксаж;

- аквадистиллятор;

- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;

- отдельная автоматическая пипетка 10 - 40 мкл и наконечники в штативе;

- мерный цилиндр на 1 л;

- колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы;

- электроплитка или микроволновая печь для плавления агарозы.

4.2. Порядок работы

ЭТАП 1. Выделение ДНК из исследуемого материала

Работа проводится в зоне 1. Выделение ДНК из 100 мкл подготовленного материала проводят с помощью набора N 1. Предварительно готовят отмывочный раствор N 2, смешав в отдельном флаконе 20 мл концентрата из набора, 80 мл дистиллированной воды и 100 мл 96%-ного этилового спирта. Смесь хорошо перемешивают и хранят при температуре 20 - 22 °C под плотно закрытой крышкой. Проверяют состоящие сорбента - при отстаивании он должен занимать приблизительно половину объема суспензии.

В ряд полипропиленовых пробирок вместимостью 1,5 мл вносят по 100 мкл предварительно подготовленных исследуемых проб, а также по 100 мкл контрольных проб 1-го этапа анализа ("контролей выделения"): отрицательные пробы элюирующий буфер и физиологический раствор (последний вносят в случае подготовки пробы с его использованием), положительная проба - ДНК C. pecorum (из набора N 2), разведенная 1:10 элюирующим буфером (90 мкл + 10 мкл).

Вносят по 300 мкл лизирующего раствора (в каждую пробу отдельным наконечником с аэрозольным барьером) и тщательно пипетируют 5 - 10 раз до полного лизиса пробы, стараясь при этом не вспенивать раствор.

В лизированный материал добавляют 10 мкл ДНК ВС-Л. Прогревают пробирку в термостате при 65 гр. C 5 мин, тщательно перемешивают на вортексе до полного растворения материала.

Добавляют 20 мкл ресуспендированного на вортексе сорбента (в каждую пробирку отдельным наконечником), хорошо перемешивают содержимое пробирки на вортексе и оставляют в штативе на 2 мин для осаждения сорбента и еще раз перемешивают и отстаивают 5 - 7 мин.

Осаждают сорбент на вортексе-центрифуге в течение 30 с и удаляют супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником (удобно использовать вакуумный отсос с колбой-ловушкой для удаляемой жидкости).

Вносят по 200 мкл отмывочного раствора N 1, перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования (если сорбент плохо разбивается, тогда его разбивают при помощи наконечника пипетки), осаждают на вортексе-центрифуге в течение 30 с и удаляют супернатант в колбу-ловушку.

Вносят по 800 мкл отмывочного раствора N 2, перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, осаждают на микроцентрифуге при 10*10 куб. об/мин в течение 30 с и удаляют супернатант в колбу-ловушку.

Повторяют процедуру отмывки раствором N 2, тщательно удаляют супернатант и высушивают осадок сорбента при открытых крышках пробирок в термостате при 65 гр. C в течение 5 - 7 мин.

Вносят по 50 мкл элюирующего буфера, ресуспендируют, помещают в термостат при 65 гр. C на 5 мин, встряхивая на вортексе через каждую минуту.

Осаживают на микроцентрифуге при 10*10 куб. об/мин в течение 1 мин. Проба готова к постановке ПЦР, супернатант содержит очищенную ДНК.

ЭТАП 2. Постановка ПЦР (амплификация ДНК).

Пробирку с воском ставят в термостат при 95 гр. C до полного расплавления. Готовят "нижнюю" реакционную смесь, используя стерильные наконечники (полистирол выдерживает автоклавирование при 120 °C в течение 15 мин):

- для амплификации ДНК Chlamydia: к 0,25 мл праймеров "Chla" добавляют 0,25 мл нуклеотидов, смешивают на вортексе;

- для амплификации ДНК ВС-Л: к 0,25 мл праймеров "ВС-Л" добавляют 0,25 мл нуклеотидов, смешивают на вортексе.

Раскапывают в микропробирки для ПЦР по 5 мкл "нижней" смеси, наслаивают сверху по 10 мкл расплавленного воска так, чтобы он полностью накрыл жидкость, закрывают крышки, на верхней части которых наносят пометки "Chla" или "ВС-Л".

Если воск покрыл жидкость неровно или образовались пузыри, прогревают пробирки в амплификаторе 5 мин при 95 гр. C и охлаждают. В таком виде пробирки хранятся в морозильнике несколько месяцев, можно приготовить сразу 50 - 100 штук.

Готовят "верхнюю" смесь: к 0,5 мл 5-кратного реакционного буфера добавляют 0,45 мл деионизованной воды и 0,05 мл Taq-полимеразы, хорошо перемешивают на вортексе. Смесь хранится при 2 - 8 °C в течение месяца (не замораживать!).

Ставят два ряда пробирок с "нижними" смесями ("Chla" и "ВС-Л") в штатив по числу испытуемых проб, включая контрольные из 1-го этапа анализа ("контроли выделения"), и добавляют пробирки для "контролей ПЦР" (деионизованная вода, ДНК C. psittaci и ДНК ВС-Л, разведенные деионизованной водой 1:10), нумеруют их в нижней части крышки.

Раскапывают на поверхность застывшего воска по 10 мкл "верхней" смеси, при этом она не должна протекать под воск и смешиваться с "нижней" смесью. В противном случае пробирку считают браком и выбрасывают.

Сверху раскапывают по 1 капле минерального масла.

Под масло вносят по 10 мкл проб - испытуемых и контрольных двух этапов анализа (для каждой пробы две пробирки - из ряда "Chla" и ряда "ВС-Л").

Набирают на амплификаторе нужную программу:

- для Chlamydia psittaci

Для ВС-Л

Через 1 - 2 мин после запуска программы, когда температура в ячейке амплификатора достигнет 95 °C, ставят программу на паузу, помещают пробирки в ячейки, закрывают крышку прибора, убирают паузу и ждут окончания реакции (примерно 2,5 часа на амплификаторе с регулированием температур по матрице и 1 ч 40 с на амплификаторе с активным регулированием).

Длина амплифицированного специфического фрагмента ДНК:

После окончания реакции (в тот же день или после хранения утром следующего дня) собирают пробирки в отдельный пакет и отправляют в комнату для анализа продуктов ПЦР (зону 3), который проводится разделением фрагментов ДНК в агарозном геле.

ЭТАП 3. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР

Работа с амплифицированными ДНК должна проводиться в отдельной комнате лаборантом или сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в пре-ПЦР помещении ("Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующие метод полимеразной цепной реакции. Основные положения", утвержденные Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 27.01.1997 г. N 13-7-2/840).

В мерный цилиндр наливают 25 мл концентрированного буфера, доводят дистиллированной водой до 500 мл, закрывают цилиндр парафинированной пленкой ("parafilm") и перемешивают.

Агарозу из одной пробирки набора пересыпают в стеклянную колбу из термостойкого стекла объемом 250 мл, наливают 100 мл готового буфера и плавят на кипящей водяной бане до полного растворения агарозы, после этого кипятят агарозу еще 20 мин и немного остужают, вращая колбу.

Заливают агарозный гель в форму по размеру используемой камеры (толщина 5 - 6 мм), помещают гребенки на расстоянии не менее 3 см друг от друга. После полного застывания геля (примерно 30 мин) осторожно вынимают гребенки, не повредив лунки, разрезают на полосы 3 - 3,5 см.

Помещают полосу готового геля в электрофорезную камеру так, чтобы лунки были обращены в сторону отрицательного электрода (ДНК из лунок должна двигаться к положительному электроду). Наливают буфера столько, чтобы он покрыл гель на 4 - 5 мм.

Ставят пробирки с продуктами амплификации в штатив в два ряда (на основе праймеров "Chla" и "ВС-Л"). Из-под слоя масла отбирают 15 мкл амплификата и вносят на дно лунки (например, амплификат пробы N 6 из ряда "Chla" вносят в одну полосу геля, затем амплификат той же пробы из ряда "ВС-Л" - в другую полосу). Можно пользоваться одним наконечником, промывая его (пилотируя 1 - 2 раза) буфером из камеры после внесения каждой пробы.

Подключают камеру к источнику тока, соблюдая полярность. Если нет нарушения контактов, то при прохождении тока от электродов должны подниматься пузырьки. Электрофорез проводят в градиенте напряжения 10 В/см до того момента, как краситель (ксиленцианол) пройдет примерно половину длины геля.

Выключают источник тока, переносят гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх и совместив уровень лунок (одна под другой) для удобства учета. Просматривают расположение полос ДНК под ультрафиолетовым излучением. (Глаза и лицо должны быть защищены специальной маской или стеклянной пластиной).

Электрофореграмму фотографируют с оранжевым светофильтром в проходящем ультрафиолете на поляроидную пленку или "Микрат 300". Документирование результатов можно проводить с помощью других систем: insta doc i, insta doc ii (фотографирующие), gel doc 1000, или Шатер ДВ (компьютерные).

5.1. Учет результатов ПЦР-анализа следует начинать с результатов амплификации ДНК внутреннего стандарта. Все амплификаты "ВС-Л" (кроме "контролей ПЦР" - ДНК C. psittaci и деионизованная вода) должны содержать полосу 500 п.н. Если в дорожке какой-либо исследуемой пробы полоса ВС-Л отсутствует, то отрицательный результат анализа данной пробы на ДНК chlamydia psittaci учитывать нельзя.

Положительные пробы должны содержать специфическую светящуюся полосу большей или меньшей интенсивности строго на том же уровне, что и полоса с положительным контрольным образцом ДНК C. psittaci. В ярко положительных пробах может отсутствовать полоса ВС-Л и результат учитывают как положительный при условии правильного учета результатов анализа "контролей" см. таблицы N 1 и N 2.

Отрицательными считаются пробы, которые содержат только полосу ВС-Л.

Кроме полос 1036 п.н. и 500 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые пятна праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 н.п. (в нижней части дорожки).

Если результаты анализа контрольных образцов не совпадают с приведенными в таблице N 2, то анализ считают недействительным и исследование повторяют.

При работе с материалом, содержащим много клеток, в ПЦР участвует большое количество неспецифической геномной ДНК. При этом в дорожках геля появляются характерные шмеры, равномерно располагающиеся от лунки до самого низа дорожки или концентрирующиеся около лунки. На фоне такого шмера в положительном образце видна специфическая полоса, а в отрицательном образце полоса отсутствует.

5.2. Результаты анализа не учитываются, если:

В дорожке какой-либо пробы отсутствуют обе полосы. Необходимо повторить исследование этой пробы с самого начала. Возможная причина - ошибка на первом этапе работы, приведшая к недостаточной сорбции ДНК или плохой очистке от ингибиторов.

В дорожке любого отрицательного контроля выявляется специфическая полоса. Возможно, произошла контаминация реактивов и проб положительной ДНК или продуктами амплификации положительной ДНК (1 и 2 этапы). Для проверки реактивов необходимо поставить не менее трех отрицательных контролей на этапе выделения ДНК и столько же на этапе постановки ПЦР для выявления источника контаминации. Если результат повторяется, необходимо сменить реактивы.

В дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Возможные причины: неправильное проведение "горячего старта" или неверный температурный режим в ячейках амплификатора.

В случае несоответствия препарата указанным в настоящем наставлении требованиям, использование тест-системы прекращают и данную серию препарата направляют с нарочным (или пересылают) во Всероссийский Государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5) и в Центральную научно-методическую ветеринарную лабораторию (111622, Москва, Оранжерейная ул., 23) в соответствии с указанием ГУВ Минсельхоза России "О порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и закупаемые по импорту" N 227/28 от 8 мая 1992 года. Второй экземпляр сопроводительного письма направляют на предприятие-изготовитель.