1.1. Набор для иммуноферментной диагностики вирусной диареи крупного рогатого скота применяют для обнаружения антигена вируса диареи - болезни слизистых в исследуемом материале.

1.2. Набор рассчитан на исследование 168 проб материала и содержит следующие компоненты:

- антиген специфический лиофилизированный 0,2 мл, 1 ампула (N 1);

- антиген отрицательный лиофилизированный 0,2 мл, 1 ампула (N 2);

- иммуноглобулины антивирусные, лиофилизированные 1,0 мл, 2 ампулы (N 3);

- конъюгат иммуноферментный лиофилизированный 1,0 мл, 2 ампулы (N 4);

- 5-аминосалициловая кислота лиофилизированная 1,0 мл, 2 ампулы (N 5);

- гидроперит 1,0 мл, 2 ампулы (N 6);

- детергент (твин-80 или твин-20) 1,0 мл, 1 ампула (флакон) (N 7);

- фосфатно-буферный раствор 0,01 М 20 мл, 1 флакон (N 8);

- натрий хлористый 11,6 г., 1 флакон (N 9);

- плашки полистироловые, 2 шт.

1.3. Биологические компоненты набора представляют собой сухую гомогенную аморфную массу, белого с сероватым оттенком цвета. При добавлении в ампулы дистиллированной воды в объеме, равном объему до высушивания, содержимое должно раствориться в течение 1...2 мин и представлять собой прозрачную и слегка опалесцирующую жидкость.

Химические компоненты набора. 5-аминосалициловая кислота должна представлять собой сухую гомогенную аморфную массу фиолетово-коричневого цвета; фосфатно-буферный раствор - прозрачная бесцветная жидкость: гидроперит и хлористый натрий должны представлять собой сыпучий неоднородный порошок, содержащий гранулы разных размеров белого цвета; твин-80 или твин-20 - вязкая тягучая маслянистая жидкость соломенно-желтого цвета.

1.4. На ампуле и флаконе с каждым компонентом должна быть этикетка с указанием краткого названия компонента и его номера, количества препарата, номера серии и даты изготовления.

1.5. Этикетированные ампулы и флаконы укладывают в коробки по ГОСТ 12301, представляющие собой наборы компонентов для обнаружения антигена вируса диареи-БС крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа. В каждую коробку с набором вкладывают наставление по применению.

1.6. На каждую коробку с набором компонентов для диагностики ВД-БС наклеивают этикетку, на которой указывают наименование предприятия-изготовителя, полное название набора, перечень компонентов, входящих в набор, количество ампул (флаконов) каждого компонента, количество препарата в каждой ампуле (флаконе), номер серии набора, номер контроля, дату изготовления (месяц, год), срок годности, условия хранения и обозначение настоящих ТУ.

1.7. Срок годности набора компонентов - 12 мес. при соблюдении условий хранения в сухом темном месте при температуре 4...8 °C. Допускается хранение при минусовой температуре.

1.8. При отсутствии маркировки этикетки, нарушении целостности ампул (флаконов), изменении цвета и консистенции содержимого, наличии хлопьев и посторонних примесей при растворении, а также при неполном растворении компоненты бракуют.

2.1. В качестве испытуемого материала используют слизистую носовой перегородки, миндалины, трахею, пораженные (изъязвления, воспаления) участки слизистой оболочки носа, толстого и тонкого кишечника. От больных в острой стадии заболевания животных берут пробы носовой слизи при ринитах и фекалии при поносах.

2.2. Для получения 25...50%-ной суспензии кусочки материала тщательно измельчают ножницами и растирают в фарфоровой ступке до образования кашицеобразной однородной массы. Полученную суспензию промораживают в течение 18...20 ч при -20 °C, оттаивают и осветляют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают в стерильную посуду, добавляют антибиотики (пенициллин, стрептомицин по 1000 ЕД/мл), инкубируют при 4 °C в течение 2...3 ч и используют для исследования. Допускается хранение проб в замороженном состоянии.

3.1. Растворение и разведение иммуноглобулинов и других компонентов реакции проводят на 0,01 М калий-фосфатном буфере (pH 7,2...7,4), для приготовления которого содержимое флаконов N 8 (0,01 М калий-фосфатный буфер) и N 9 (натрий хлористый) растворяют в 2 л дистиллированной воды и хранят при 4...8 °C в течение месяца (ФБР).

3.2. Содержимое ампулы с иммуноглобулинами растворяют в 10 мл ФБР.

3.3. Содержимое ампул со специфическим и отрицательным антигенами растворяют в 0,2 мл ФБР каждую, разливают по 0,1 мл и хранят в замороженном состоянии до использования в реакции.

3.4. Для промывания плашек и разведения компонентов при постановке реакции готовят ТФБР: к 1 л ФБР добавляют 0,5 мл твина-20 или твина-80 (флакон N 7) и перемешивают до полного растворения.

3.5. Содержимое ампулы с иммуноферментным конъюгатом растворяют в 10 мл ФБР.

3.6. Субстратную смесь готовят непосредственно перед использованием в реакции следующим образом. Содержимое ампулы с 5-аминосалициловой кислотой (N 5) растворяют в 10 мл подогретой до 30...40 °C дистиллированной воды, охлаждают и вносят в полученный раствор содержимое ампулы с гидроперитом (N 6).

4.1. На первом этапе реакции разведенные иммуноглобулины (п. 3.2) вносят по 0,1 мл в лунки полистироловой плашки, закрывают крышкой, инкубируют в течение 2 ч при 36...37 °C и затем 18 ч при 4 °C. Удаляют раствор иммуноглобулинов и 3...4 раза отмывают лунки ТФБР.

4.2. На втором этапе реакции во все лунки плашки вносят по 0,1 мл ТФБР. При качественной реакции (ответ "да" или "нет") в первую лунку первого ряда вносят 0,1 мл испытуемой пробы, пипетируют и 0,1 мл раствора удаляют и т.д. В одну из лунок вносят 0,1 мл специфического антигена, пипетируют и 0,1 мл смеси удаляют. Таким же образом вносят отрицательный антиген. Плашки инкубируют в термостате 1,5...2 ч при 36...37 °C и затем отмывают лунки плашки от несвязавшихся антигенов.

4.3. Иммуноферментный конъюгат вносят по 0,1 мл в отмытые лунки плашек, инкубируют в термостате при 36...37 °C 1,5...2 ч и вновь трижды отмывают раствором ТФБР.

4.4. Затем в лунки вносят по 0,1 мл субстратной смеси, которую готовят непосредственно перед использованием в реакции.

4.5. Результат реакции учитывают через 40...60 мин по изменению окраски образовавшегося реакционного продукта.

5.1. Результаты реакции учитывают через 40...60 мин визуально по появлению окраски образовавшегося реакционного продукта от коричневого до светло-коричневого цвета.

5.2. Оценку достоверности присутствия специфического антигена проводят по схеме:

- интенсивное коричневое окрашивание, коричневое окрашивание - положительный результат;

- светло-коричневое окрашивание - сомнительный результат;

- окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного контроля - отрицательный результат.

6.1. В случае несоответствия препарата предъявляемым требованиям, снижения активности и специфичности применение данной серии прекращают и, в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии Минсельхоза России от 8 мая 1992 г. N 22-7/28 "О порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и закупаемых по импорту", сообщают об этом предприятию-изготовителю, Всероссийскому государственному научно-исследовательскому институту контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5) и ЦНПВЛ.

При наличии невскрытых наборов одновременно с этим в институт направляют нарочным 1 набор. Образцы препарата транспортируют с соблюдением условий хранения препарата.

С утверждением настоящего Наставления не действует Временное наставление по применению "Набора компонентов для диагностики вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа" за N 22-7/81, утвержденное Главным управлением ветеринарии 20 августа 1992 г.