Методика апробирована в Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России (ЦНМВЛ) и во Всероссийском научно-исследовательском институте мясной промышленности (ВНИИМП)

Методика предназначена для количественного определения гистамина в рыбе (скумбрия, ставрида, сайра, макрель, тунец, сельдь, шпрот, лосось и др.) с помощью тест-системы для иммуноферментного анализа Histamin <*>.

--------------------------------

<*> является зарегистрированным товарным знаком фирмы R-Biopharm, Германия.

Гистамин является одним из биогенных аминов, образующихся в рыбе при декарбоксилировании аминокислот, в том числе, в результате деятельности бактерий. Поскольку биогенные амины принадлежат к веществам, участвующим в обмене веществ высших животных, они легко метаболизируются и поэтому обычно хорошо переносятся человеком, если их концентрация в пище находится в пределах допустимого уровня.

При бактериальном загрязнении рыбы повышение уровня содержания биогенных аминов, в частности гистамина, может причинить вред здоровью потребителя. При содержании гистамина выше обычного уровня естественный механизм детоксификации аминов за счет деятельности ферментов - аминооксидаз (гистаминазы) уже не справляется. Повышенное поступление гистамина может вызвать так называемую "гистаминовую" мигрень (синдром Хортона), головную боль (невралгия Харриса, характеризующаяся болью в области глаз, лба, височной части головы, слезотечением, воспалением слизистой носа) и другие симптомы, включая тошноту, понос, испарину, повышенное выделение желудочного сока, учащение сердцебиения и снижение диастолического (нижнего) кровяного давления.

Бактерии Enterobacteriaceae, в частности колиформы, обладают высокой декарбоксилизующей активностью, причем даже при стерилизации рыбы наработка гистамина не прекращается за счет деятельности активных ферментов. Продуктами риска является в первую очередь рыба богатая гистидином, в частности скумбрия, ставрида, сайра, макрель, тунец, сельдь, шпрот, лосось и некоторые другие продукты, например, сыр, мясо, шампанское, вино, пиво и кислая капуста.

Содержание гистамина в пище нормируется во всех развитых странах и является важнейшим показателем свежести рыбы. Так, например, согласно СанПиН 2.3.2.560-96 Российской Федерации содержание гистамина в рыбе не должно превышать 100 мг/кг, в Соединенных Штатах норма гистамина составляет 50 мг/кг (производители рыбных консервов контролируют сырье по норме 5 - 15 мг/кг гистамина).

Традиционный фотоколориметрический метод контроля гистамина в рыбе трудоемок, занимает длительное время и характеризуется малой производительностью. В последнее время в рутинной лабораторной практике широко применяется более удобный иммуноферментный метод анализа (ИФА, ELISA), являющийся официальным методом контроля, принятым в странах Евросоюза (Директива 93/257/ЕЕС).

Использованы ссылки на следующие нормативные документы:

ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие правила безопасности.

ГОСТ 12.1.018-86 ССБТ. Пожарная безопасность. Электростатическая искробезопасность. Общие требования.

ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура средств защиты.

ГОСТ 1770-74Е. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия.

ГОСТ 4025-83. Мясорубки бытовые. Технические условия.

ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия.

ГОСТ 7269-79. Мясо. Методы отбора образцов. Органолептические методы определения свежести.

ГОСТ 7328-82Е. Меры массы общего назначения и образцовые. Технические условия.

ГОСТ 7702.0-74. Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органолептические методы определения качества.

ГОСТ 24104-88Е. Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия.

ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры.

ГОСТ 29169-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой.

ГОСТ 29224-91. Термометры ртутные стеклянные лабораторные. Технические условия.

ГОСТ 29227-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Общие требования.

В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Планшет, входящий в состав набора Histamin, сенсибилизирован гистамином. Анализ выполняется следующим образом.

Исследуемые (стандартные) образцы и раствор, содержащий антитела к гистамину дозируются в лунки планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы гистамина, содержащегося в пробе (в стандартном растворе) и молекулы гистамина, адсорбированные на поверхности планшета, конкурируя между собой, взаимодействуют с внесенными антителами к гистамину.

После промывки планшета в лунки вносится раствор, содержащий вторичные антитела конъюгированные с пероксидазой, которые во время второй инкубации связываются комплексом гистамин-антитело на поверхности планшета. Несвязанные молекулы конъюгата удаляются при очередной промывке.

В лунки затем дозируется раствор субстрата (пероксид карбамида) и раствор хромогена (тетраметилбензидин). В процессе очередной инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы конъюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. Через определенное время развития цветной реакции, в результате которой бесцветный хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.

Оптическая плотность в лунках, измеренная на спектрофотометре (ридере) при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации гистамина в исследуемых образцах.

6.1. Предел обнаружения гистамина составляет: 2,5 мг/кг при навеске образца 2 г.

6.2. Диапазон определяемых концентраций гистамина составляет: 2,5 - 202,5 мкг/л при навеске образца 2 г.

7.1. Средства измерения

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104

Меры массы по ГОСТ 7328

Спектрофотометр (ридер), снабженный фильтром на 450 нм

Дозаторы на 50, 100 и 250 мкл

Колба мерная 2-го класса точности вместимостью 1000 мл исп. 2 по ГОСТ 1770

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1 и 10 мл по ГОСТ 29227

7.2. Вспомогательные устройства

Мясорубка по ГОСТ 4025

Центрифуга охлаждаемая с устанавливаемым ускорением 3000 д

Центрифужная пробирка на 20 мл с завинчивающейся крышкой

Устройство для встряхивания проб

Пипетки Пастера

Пробирки типа П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками

Стакан химический вместимостью 100 мл по ГОСТ 25336

Воронки лабораторные типа В-36 или В-75 по ГОСТ 25336

Стеклянный бюкс (стаканчик для взвешивания) по ГОСТ 25336

Груша резиновая

Холодильник бытовой

7.3. Реактивы и материалы

Тест-система для иммуноферментного анализа Histamin в стандартной комплектации, включая:

Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности. Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения. Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии. Храните набор при температуре 2 - 8 °C. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР. Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет вместе с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет. Поскольку стандартные растворы и раствор хромогена светочувствительны, избегайте попадания прямых солнечных лучей на флаконы с растворами.

Признаки порчи реагентов: В случае окрашивания раствора хромогена не рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора хромогена является признаком его порчи. В случае, если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, не превышает 0,6, это также может быть признаком порчи реагентов.

8.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные устройства.

8.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалиста, имеющего высшее или среднее специальное химическое образование или опыт работы в химической лаборатории, владеющего техникой иммуноферментного анализа и освоившего метод в процессе стажировки.

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

11.1. Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией по отбору проб. Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора.

11.2. Анализ необходимо начать в день доставки пробы в лабораторию. При отсутствии такой возможности допускается хранение образцов не более чем 2 суток с момента отбора при температуре 2 - 8 °C, либо 5 - 6 месяцев при температуре -20 °C.

11.3. Приготовление вспомогательных растворов.

11.3.1. Приготовление 0,02 М фосфатного буферного раствора с твином, pH 7,2. Взвешивают 2,3 г безводного гидрофосфата натрия, 0,62 г дигидрата дигидрофосфата натрия и 9,0 г хлорида натрия. Навески переносят в мерную колбу на 1000 мл, добавляют 1 мл твин-20 и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения раствора при температуре 2 - 8 °C - 4 дня.

12.1. Пробу рыбы измельчают с помощью мясорубки либо другим способом.

12.2. Навеску 2 г фарша и 10 мл 0,02 М фосфатного буферного раствора с твином переносят в центрифужную пробирку на 20 мл, закрывают пробирку герметичной крышкой и энергично встряхивают в течение 30-ти минут с помощью устройства для встряхивания проб, либо вручную.

12.3. Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют при ускорении 3000 д и температуре 4 °C в течение 10 мин.

12.4. Верхний слой жира удаляется.

12.5. Часть водной вытяжки переносят в чистую пробирку на 5 мл.

12.6. Раствор разбавляют в десять раз фосфатным буферным раствором, например, переносят дозатором в чистую пробирку 100 мкл водной вытяжки, добавляют 0,9 мл фосфатного буфера и тщательно перемешивают.

12.7. Для анализа используют 50 мкл раствора.

13.1. Предварительные замечания по проведению измерений с помощью тест-системы Histamin.

Перед использованием тест-системы доведите температуру всех реагентов до комнатной (30 - 40 минут до температуры 18 - 20 °C).

Немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры 28 °C.

В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета.

Воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета.

На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света.

13.2. Подготовка к измерениям

13.2.1. Микротитровальный планшет, сенсибилизированный гистамином.

Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 - 8 °C.

13.2.2. Стандартные растворы.

Стандартные растворы гистамина поставляются готовыми для использования в следующих концентрациях:

Примечание: 1 ppb = 1 мкг/кг

13.3. Процедура анализа

13.3.1. Вставьте в рамку планшета лунки в количестве, необходимом для выполнения всех запланированных определений в дубле (по 2 раза). Запишите координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов. Пример формы записи приведен на Рис. 1.

13.3.2. С помощью дозатора добавьте по 50 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие пары лунок.

13.3.3. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл препарата антител (здесь и далее предпочтительно использование 8-канального дозатора, при этом раствор удобно отбирать из специальной ванночки или из чашки Петри). Путем осторожного постукивания по краям планшета перемешайте раствор в лунках и оставьте планшет на инкубацию в темноте в течение одного часа при комнатной температуре.

13.3.4. Вылейте жидкость из лунок, переверните рамку планшета и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполните лунки 250 мкл фосфатного буферного раствора и снова опорожните лунки. Выбейте капельки жидкости как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок еще два раза.

13.3.5. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл препарата конъюгата. Путем осторожного постукивания по краям планшета перемешайте раствор в лунках и оставьте планшет на инкубацию в темноте в течение получаса при комнатной температуре.

13.3.6. Промойте лунки планшета, следуя процедуре по п. 13.3.4.

13.3.7. Добавьте по 50 мкл субстрата и по 50 мкл хромогена в каждую лунку. Тщательно перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.

13.3.6. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента и хорошо перемешайте. В течение 60-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм.

Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами делятся на среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:

По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов и соответствующим значениям концентрации гистамина в мкг/кг (ppb) строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат. Калибровочная кривая должна быть почти линейна в диапазоне 150 - 1350 мкг/кг (см. Рис. 2).

Концентрация гистамина в исследуемых растворах в мкг/кг (ppb) считывается по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов. Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например, . При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения. Внимание: Для того чтобы вычислить концентрацию гистамина в исследуемой исходной пробе, величину концентрации гистамина, полученную по калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий фактор разбавления. При выполнении пробоподготовки и анализа в полном соответствии с приведенной методикой фактор разбавления принимает следующие значения:

Фактор разбавления для проб рыбы равен 50.

При контроле проб рыбы на соответствие санитарно-гигиеническим требованиям к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, принятым в Российской Федерации, найденная концентрация гистамина более 100 мг/кг (более 2000 мкг/кг по калибровочной кривой) позволяет рассматривать исследуемую рыбу как несоответствующую санитарно-гигиеническим требованиям. При меньшем содержании гистамина в рыбе найденная величина концентрации позволяет классифицировать рыбу по уровню свежести.