1. Разработаны Научно-техническим центром "Аргумент" и биологическим факультетом МГУ.

2. Исполнители: А.Н. Суслов, В.С. Данилов.

Методика предназначена для быстрого и количественного контроля степени интегральной токсичности проб воды и водных вытяжек различных объектов окружающей среды в лабораторных и полевых условиях с использованием в качестве тест-объекта препаратов лиофилизированных люминесцентных бактерий "Эколюм" и измерительного прибора серии "Биотокс".

Объектами исследования могут быть пробы природных вод, льда и осадков; вод хозяйственно-питьевого назначения; промышленных и сточных вод; почв; материалов и изделий.

Тест-система реагирует на токсические соединения разнообразной химической природы (например: металлы, фенолы, углеводороды, пестициды, микотоксины и многие другие с порогом определения порядка 0,01 мг/л), а также в смеси веществ позволяет определить эффект синергизма токсического действия.

Метрологические характеристики биотеста соответствуют аттестации 4/7-93, проведенной органами Госстандарта.

Сходимость результатов определения тест-параметра - 5%.

Воспроизводимость результатов определения тест-параметра - 5%.

Метод определения токсичности основан на том, что тест-объект (люминесцентные, светящиеся бактерии) при действии поллютантов изменяет свои физиолого-биохимические функции, в том числе активность фермента бактериальной люциферазы, ответственного за интенсивность биолюминесценции, и реагирует на действие различных химических и биологических факторов аналогично высшим животным. Оценка токсичности основана на определении величины изменения интенсивности биолюминесценции бактерий при действии токсических веществ, содержащихся в тестируемой воде, водорастворимых форм поллютантов, содержащихся в почве и материалах, по сравнению с контролем.

Критерием токсического действия является изменение интенсивности биолюминесценции тест-объекта в исследуемой пробе по сравнению с таковой для пробы с раствором, не содержащим токсических веществ. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.

Количественная оценка параметра тест-реакции выражается в виде безразмерной величины - индекса токсичности Т, равного отношению:

где Io и I - соответственно интенсивности биолюминесценции контрольной и исследуемой пробы через определенный интервал времени экспозиции исследуемого раствора с тест-объектом.

В качестве критериев токсичности принимаются величины Т:

1) меньше 20 - образец "не токсичен";

2) от 20 до 40 - образец токсичен;

3) равно или больше 50 - образец сильно токсичен.

Вся посуда для отбора проб и биотестирования должна быть тщательно вымыта, сполоснута дистиллированной водой и высушена. Не разрешается пользоваться синтетическими поверхностно-активными веществами и органическими растворителями.

На методику распространяются общие правила безопасности при работе с химическими реактивами общего применения ГОСТ 12.4.021 и электробезопасности при работе с приборами - ГОСТ 12.1.019.

Определение токсичности по методике выполняется оператором с квалификацией лаборанта со средним специальным образованием.

9.1. Отбор проб, их хранение и транспортировка осуществляется в соответствии с руководящими документами, действующими в системе Государственного санитарно-эпидемиологического и экологического контроля.

ГОСТ 17.1.5.05-85. ОПГ. Общие требования к отбору проб поверхностных и морских вод, льда и осадков.

ГОСТ 17.1.5.94-81. ОПГ. Приборы и устройства для отбора, первичной обработки и хранения проб природных вод. Общие технические условия.

НВН 33-5.3.01-85. Инструкция по отбору проб для анализа сточных вод.

ИСО 5667/2. Качество воды. Отбор проб. Ч. 2. ГОСТ 2874-82. Вода питьевая.

ГОСТ 2481-80. Вода питьевая. Отбор проб.

ГОСТ 14.4.4.02-84. Охрана природы. Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического и гельминтологического анализа.

Инструкция по санитарно-химическому исследованию изделий. М., 1972, МЗ СССР.

ГОСТ 2761-84. Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения. Гигиенические и технические требования и правила выбора. М., 1985.

9.2. Биотестирование проб воды и водных вытяжек проводят не позднее 6 ч после их отбора. При невозможности проведения анализа в указанный срок пробы воды охлаждают (4 - 6 °С). Не допускается консервирование проб с помощью химических веществ.

9.3. Необходимый для выполнения анализа (в трех повторностях) объем водной пробы составляет не более 1,5 мл.

9.4. При проведении биотестирования температура исследуемой пробы должна соответствовать температуре тест-объекта. Температурный оптимум для биотеста составляет 15 - 25 °С.

9.5. Извлечение водорастворимых форм химических соединений из проб почвы.

Приготовляют навеску воздушно-сухой почвы (массой не менее 5,00 г с точностью 0,01 г), растирают в ступе и переносят ее в коническую колбу: мерным цилиндром отбирают пятикратный объем (5 мл/г образца почвы) дистиллированной воды (рН - 7,0 - 7,4), доливают в коническую колбу, несколько раз встряхивают и оставляют на экстракцию и отстаивание в течение 12 ч. Отфильтрованный экстракт в объеме 0,5 мл тестируют на токсичность. Предварительные результаты можно получить через 2 ч экстракции.

9.6. Извлечение водорастворимых форм химических соединений из материалов и изделий.

В сосуд помещают изделие, и заливают 5-кратным объемом (5 мл на 1 г образца) дистиллированной воды (рН - 7,0 - 7,4), и выдерживают в течение 12 ч. Полученный экстракт тестируют на токсичность в объеме 0,5 мл. Предварительные результаты можно получить через 2 ч экстракции.

9.7. При наличии в сточных водах крупнодисперсных включений необходима фильтрация пробы через фильтры обеззоленные, ТУ 6-09-1678-86.

9.8. Природные воды фильтруют через фильтр диаметром 0,45 - 0,5 мкм.

9.9. При анализе морской воды используют препараты "Эколюм" на основе морских люминесцентных бактерий. В случае использования в качестве тест-объекта морских люминесцентных бактерий в качестве маточного раствора используют 2%-ный раствор натрия хлористого на дистиллированной воде.

10.1.1. Приготовляют тест-систему путем вскрытия флаконов с лиофилизованными бактериями, добавлением 10 мл охлажденной до температуры 4 - 8 °С дистиллированной воды (рН - 7,0 - 7,4) и интенсивного встряхивания. Регидратацию лиофилизованных бактерий проводят в течение 30 мин. Затем полученную суспензию бактерий выдерживают не менее 30 мин. до достижения температуры 15 - 25 °С и разбавляют дистиллированной водой.

10.1.2. Подготовку прибора "Биотокс" проводят в соответствии с методикой поверки прибора и инструкцией по эксплуатации.

Для биотестирования из колбы отбирают по 0,5 мл суспензии бактерий и добавляют в три опытных и три контрольных кюветы объемом по 1,5 мл. В три контрольных кюветы добавляют по 0,5 мл дистиллированной воды, в три опытных - по 0,5 мл исследуемого раствора.

Объем добавляемой суспензии бактерий к пробе может быть произвольным, но равным в контроле и исследуемой пробе. Объемы контрольной и исследуемой пробы должны составлять по 1 мл.

Измерение интенсивности биолюминесценции проводят с помощью прибора "Биотокс" спустя 30 мин. попарно контроль-опыт. В экспрессном варианте допустимо время экспозиции биосенсора с пробой в течение 5 мин.

- вставить кювету с контролем в кюветный модуль, нажать кнопку "КОНТРОЛЬ", через 10 сек. на индикационном табло появляется усредненная величина интенсивности биолюминесценции тест-объекта (в относительных единицах);

- вставить кювету с опытным образцом в кюветный модуль, нажать кнопку "ПРОБА", через 10 сек. на индикационном табло появляется усредненная величина интенсивности биолюминесценции тест-объекта (в относительных единицах);

- нажать кнопку "ТОКСИЧНОСТЬ" - на индикационном табло появляется значение индекса токсичности (в относительных единицах);

- нажать кнопку "СБРОС" для обнуления памяти прибора;

- повторить операции определенное количество раз для пар контроль-опыт (для одного измеряемого образца), записать в протокол результаты определения токсичности;

- при использовании одного контрольного образца для серии различных проб измерение контроля проводится один раз и прибор соотносит автоматически показания проб и контроля с индикацией индекса токсичности для каждой пробы.

11.1. Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию и интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности Т (прибор "Биотокс" позволяет автоматически вычислять индекс токсичности). Абсолютная величина интенсивности биолюминесценции контроля не имеет принципиального значения в диапазоне допустимых значений прибора "Биотокс".

11.2. Индекс токсичности Т есть величина безразмерная и определяется по формуле:

где Io и I соответственно интенсивность биолюминесценции в контроле и опыте через определенное время экспозиции исследуемого раствора с тест-объектом.

Обработку результатов измерений токсичности выполняют путем расчета среднеарифметического значения величины токсичности Т по формуле:

11.3. В случае определения токсичности пробы (Т равно и больше 20) можно определить, насколько это связано со значениями рН исследуемого раствора. Для этого измеряют рН пробы, и если величина рН находится за пределами 6,5 - 8,0, приводят рН до значений 7,0 - 7,4 и повторяют измерение токсичности.

11.4. В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле - индекс Т принимает отрицательные значения. При Т меньше 10, проба содержит токсические соединения.

При Т, равном от -10 до +5, для всех проб для более достоверного вывода о "нетоксичности" образца, следует провести дополнительные измерения с кратным (в два раза) разбавлением анализируемой пробы. В случае, когда индекс Т не будет выходить за рамки от -10 до +5 - проба "не токсична".

11.5. По величине индекса токсичности анализируемые пробы классифицируются на четыре группы.

11.6. Результаты измерений оформляют протоколом.

Пример записи:

Оперативный контроль погрешности проводится в соответствии с аттестацией 4/7-93, проведенной органами Госстандарта путем действия раствора, содержащего 1 мкг цинка сернокислого 7-водного в 1 куб. см дистиллированной воды (модельный токсикант), при времени инкубации 15 мин., вызывающего уменьшение интенсивности свечения биолюминесценции биосенсора "Эколюм" более чем в 2 раза по сравнению с контролем. В случае если это отношение меньше двух, биосенсор "Эколюм" не используется.

Для доказательства правильности вывода о степени токсичности образца каждое определение необходимо проводить в трех повторностях.