1. Разработано: ООО "Стайлаб"; Федеральным центром Госсанэпиднадзора Минздрава России.

2. Утверждено.

3. Вводится впервые.

Диапазоны определяемых концентраций микотоксинов приведены в таблице:

--------------------------------

<*> Диапазон определяемых концентраций при навеске образца 5 г.

В последнее время в целях скрининга за рубежом в рутинной лабораторной практике широко применяется метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Наборы RIDASCREEN FAST представляют собой тест-системы для иммуноферментного анализа в комплекте с необходимыми реагентами, выпускаются серийно и предназначены для экспресс-определения микотоксинов в зерновых культурах, комбикормах и орехах.

Принцип работы тест-систем RIDASCREEN FAST основан на методе прямого конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Поставляемый в комплекте набора планшет сенсибилизирован антителами "захвата", специфичными к антителам к микотоксинам.

Анализ выполняется следующим образом. Исследуемые и стандартные образцы, препарат, содержащий антитела к микотоксинам, и препарат, содержащий конъюгат микотоксинов с ферментом, последовательно дозируются в лунки активированного планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы микотоксинов и молекулы конъюгата, конкурируя между собой, связываются антителами к микотоксинам. В то же самое время, при инкубации происходит иммуносорбция этих антител на поверхность лунок планшета за счет их взаимодействия с антителами "захвата" на поверхности.

На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные молекулы конъюгата. После промывки планшета в его лунки дозируется раствор, содержащий субстрат и хромоген. В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы конъюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. После определенного времени развития данной цветной реакции, в результате которой хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.

Оптическая плотность в лунках, измеренная на планшетном фотометре (ридере) при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации микотоксинов в исследуемых образцах.

При выполнении измерений массовой концентрации микотоксинов применяются следующие средства измерения, реактивы, вспомогательные устройства и материалы.

Тест-система RIDASCREEN FAST для иммуноферментного анализа в стандартной комплектации, включая:

Микротитровальный планшет на 48 лунок (6 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированный антителами "захвата".

Комплект стандартных растворов микотоксинов в водном растворе метанола, объемом 1,3 куб. см, со следующими концентрациями:

Антитела к микотоксинам (черная крышка) объемом 3 куб. см.

Конъюгат микотоксинов с пероксидазой (красная крышка) объемом 3 куб. см.

Субстрат/хромоген (белая крышка) - подкрашенный раствор объемом 6 куб. см.

Стоп-реагент (желтая крышка), содержащий 1 N раствор серной к-ты, объемом 6 куб. см.

Инструкцию по использованию тест-системы на русском и английском языках.

Логарифмическую бумагу.

Мельница для размола сыпучих продуктов

Колба коническая со шлифом и притертой пробкой на 50 (100) куб. см типа КН-1 по ТУ 92-891.029-91

Пробирки П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками

Воронки лабораторные типа В-36 по ГОСТ 25336

Фильтровальная бумага "красная лента"

Наконечники для автоматических пипеток

Ванночки для реагентов

Листовая фильтровальная бумага

Разовые резиновые перчатки

Тара для лабораторных отходов

Замечания по использованию и хранению тест-систем RIDASCREEN FAST:

Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности. Срок годности тест-системы указан на этикетке.

Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии. Не используйте реагенты других производителей. Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения.

Храните набор при температуре 2 - 8 °C. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.

Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет вместе с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет.

Поскольку раствор хромогена светочувствителен, избегайте попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором.

В случае голубоватого окрашивания розового раствора хромогена не рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора является признаком его порчи.

Если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, не превышает 0,6, это также может быть признаком порчи реагентов.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные устройства.

4.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией.

4.3. Внимание! Стандартные растворы содержат токсичные микотоксины. При работе используйте разовые резиновые перчатки, избегайте контакта реагентов с кожей.

4.4. После каждого анализа следует тщательно промывать оборудование и лабораторную посуду для предотвращения перекрестного загрязнения от пробы к пробе. Все использованные материалы, жидкие отходы, расходные материалы и лабораторная посуда должны быть деконтаминированы путем замачивания в течение 30 минут в 5% растворе гипохлорита натрия с последующим добавлением в раствор ацетона 5% по объему и выдерживанием еще 30 минут. Для мытья стеклянной посуды, загрязненной микотоксинами, рекомендуется использовать 10% раствор гипохлорита натрия. С помощью раствора соляной кислоты подкислите раствор гипохлорита до pH 7, залейте раствором загрязненную посуду и оставьте в контакте с раствором на ночь. Затем лабораторную посуду следует отмыть обычными лабораторными моющими средствами и промыть дистиллированной водой.

4.5. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Избегайте контакта стоп-реагента с кожей.

4.6. Метанол относится к легковоспламеняющимся растворителям. Емкость с метанолом должна быть всегда плотно закрыта. Храните емкость с метанолом вдали от источников тепла, искр и открытого пламени. Не курите во время работы. Метанол токсичен при попадании внутрь! Пары метанола токсичны! Не вдыхайте пары метанола! Избегайте контакта метанола с кожей.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или среднее специальное образование, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе стажировки.

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

7.1. Отбор проб

Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией по отбору проб. Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора. Пробы, предназначенные для анализа, должны хранится в холодном темном месте.

7.2. Подготовка реактивов и материалов

Перед использованием доведите температуру всех реагентов (включая дистиллированную воду) до комнатной (20 - 25 °C). Это займет около 1 часа.

Стандартные растворы. Стандартные растворы микотоксинов поставляются готовыми для использования. Величина концентрации микотоксинов, нанесенная на флаконы с растворами, дана с учетом фактора разбавления исследуемых образцов при пробоподготовке, поэтому результат определения может быть получен непосредственно по калибровочной кривой.

Приготовление 70%-ного раствора метанола. В мерную колбу на 100 куб. см помещают 70 куб. см метанола и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.

Микротитровальный планшет. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов вместе с рамкой. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет с силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 - 8 °C.

7.3. Пробоподготовка

7.3.1. Исследуемую пробу размалывают с помощью мельницы для размола сыпучих продуктов.

7.3.2. Взвешивают 5 г размолотой пробы, переносят в колбу с притертой пробкой, приливают 25 куб. см 70%-го водного раствора метанола.

7.3.3. Тщательно встряхивают колбу в течение трех минут (рекомендуется использовать аппарат для встряхивания).

7.3.4. Фильтруют раствор через фильтровальную бумагу типа "красная лента".

7.3.5. Смешивают в пробирке 1 куб. см фильтрата и 1 куб. см дистиллированной воды.

7.3.6. Для анализа используют 50 мкл раствора.

8.1. Предварительные замечания к проведению измерений с помощью тест-системы RIDASCREEN FAST:

- немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры 2 - 8 °C, избегайте длительного хранения реагентов при комнатной температуре;

- иммуноферментная реакция начинается после добавления в лунки планшета препарата антител. При дозировании рекомендуется использовать многоканальную пипетку;

- в процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета. Избегайте перерывов при выполнении анализа;

- воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета;

- на всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света. Во время инкубации рекомендуется ставить планшет в темное место или прикрывать планшет непрозрачным экраном.

8.2. Проведение измерений

8.2.1. Извлеките из фольгированного пакета необходимое количество лунок - по одной лунке на каждую пробу. Поместите лунки в рамку.

8.2.2. Немедленно упакуйте оставшиеся лунки в фольгированный пакет вместе с осушителем и поместите на хранение при 4 °C.

8.2.3. Нанесите координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов, на разграфленную бумагу, как это показано на рисунке (Ст. - стандарты, Пр. - пробы):

8.2.4. Пометьте лунки, чтобы идентифицировать их после промывки.

8.2.5. Осторожно, не допуская вспенивания, перемешайте флаконы с реагентами.

8.2.6. Перед пипетированием смачивайте каждый свежий наконечник пипетки дозируемым раствором (наберите и выпустите раствор).

8.2.7. Добавьте по 50 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие лунки. При каждом дозировании используйте новый наконечник дозатора.

8.2.8. Осторожно, не касаясь лунок, добавьте по 50 мкл препарата конъюгата в каждую лунку, согласно рисунку на разграфленной бумаге (см. п. 8.2.3).

8.2.9. Таким же образом добавьте в каждую лунку по 50 мкл препарата антител.

8.2.10. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию в темном месте при комнатной температуре в течение 10 мин. (+/- 1 мин.). Не встряхивайте планшет во время инкубации!

8.2.11. Вылейте жидкость из лунок. Во избежание появления пленки поверхностного натяжения, препятствующей добавлению промывочного раствора в лунки, переверните рамку планшета и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного (не более!) постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой.

8.2.12. При помощи многоканальной пипетки или специальной промывалки наполните лунки 250 мкл дистиллированной воды и снова опорожните лунки. Выбейте капельки жидкости, как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок еще два раза.

8.2.13. Как можно быстрее добавьте по 2 капли (100 мкл) раствора хромогена/субстрата (белая крышка) в каждую лунку (лучше использовать многоканальную пипетку).

8.2.14. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию при комнатной температуре в течение 5 минут (+/- 0,5 мин.) в темноте. Не встряхивайте планшет во время инкубации!

8.2.15. Быстро добавьте в каждую лунку по 2 капли (100 мкл) стоп-реагента (желтая крышка) и хорошо перемешайте (лучше также использовать многоканальную пипетку).

8.2.16. В течение 10-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм относительно воздуха.

Значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами делятся на значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:

По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим значениям концентрации микотоксинов в мкг/кг (ppb) строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат (не приводится).

Концентрация микотоксинов в исследуемых растворах в мкг/кг (ppb) считывается по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов. Положительные результаты количественного определения концентрации микотоксинов следует подтверждать с помощью хроматографических методов.

Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например, РИДА(R) Софт. При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения.