1. Разработаны: ООО "Стайлаб"; Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России.

2. Утверждено.

3. Вводятся в первые.

На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные молекулы конъюгата и другие несвязанные молекулы.

После промывки в лунки дозируется раствор, содержащий субстрат. В процессе инкубации развивается цветная реакция, в которой ферментный фрагмент молекулы конъюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора. После определенного времени развития данной цветной реакции, в результате которой субстрат окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.

Тест-система AFLAPLATE для иммуноферментного анализа, включая:

48 микротитровальных лунок, сенсибилизированных моноклональными антителами;

48 микротитровальных белых лунок для смешения реагентов;

конъюгат (красная этикетка) объемом 11 куб. см;

субстрат, ТМБ (голубая этикетка) объемом 15 куб. см;

2%-ный раствор серной кислоты - стоп-реагент (желтая этикетка) объемом 15 куб. см;

концентрирующий моющий буфер (зеленая этикетка) объемом 20 куб. см;

инструкцию по использованию тест-системы на русском и английском языках;

логарифмическую бумагу;

Мельница для размола сыпучих продуктов

Высокоскоростной блендер с кувшином на 1 л (для использования с растворителями) или лабораторный шейкер

Колбы конические со шлифом и притертой пробкой на 250 (50) куб. см типа КН-1 по ТУ 92-891.029-91

Пробирки П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками

Воронки лабораторные типа В-36 по ГОСТ 25336

Фильтровальная бумага "белая лента"

Наконечники для автоматических пипеток

Ванночки для реагентов

Листовая фильтровальная бумага

Разовые резиновые перчатки

Тара для лабораторных отходов.

Замечания по использованию и хранению тест-системы AFLAPLATE:

Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности. Срок годности тест-системы указан на этикетке.

Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии. Не используйте реагенты других производителей. Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения.

Храните набор при температуре 2 - 8 °С. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.

Поскольку субстрат и стандартные растворы светочувствительны, избегайте попадания прямых солнечных лучей на флаконы с этими растворами.

В случае окрашивания субстрата не рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора субстрата является признаком его порчи.

Если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, не превышает 0,8, это также может быть признаком порчи реагентов.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные устройства.

4.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией.

4.3. Внимание! Стандартные растворы содержат токсичные афлатоксины. При работе используйте разовые резиновые перчатки, избегайте контакта реагентов с кожей.

4.4. После каждого анализа следует тщательно промывать оборудование, кувшин блендера (лабораторный шейкер) и лабораторную посуду для предотвращения перекрестного загрязнения от пробы к пробе. Все использованные материалы, жидкие отходы, расходные материалы и лабораторная посуда должны быть деконтаминированы путем замачивания в течение 30 минут в 5%-ном растворе гипохлорита натрия с последующим добавлением в раствор ацетона 5% по объему и выдерживанием еще 30 минут. Для мытья стеклянной посуды, загрязненной афлатоксинами, рекомендуется использовать 10%-ный раствор гипохлорита натрия. С помощью раствора соляной кислоты подкислите раствор гипохлорита до рН 7, залейте раствором загрязненную посуду и оставьте в контакте с раствором на ночь. Затем лабораторную посуду следует отмыть обычными лабораторными моющими средствами и промыть дистиллированной водой.

4.5. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Избегайте контакта стоп-реагента с кожей.

4.6. Метанол относится к легковоспламеняющимся растворителям. Емкость с метанолом должна быть всегда плотно закрыта. Храните емкость с метанолом вдали от источников тепла, искр и открытого пламени. Не курите во время работы. Метанол токсичен при попадании внутрь! Пары метанола токсичны! Не вдыхайте пары метанола! Избегайте контакта метанола с кожей.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или среднее специальное образование, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе стажировки.

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

Температура воздуха 20 - 25 °С;

Атмосферное давление 84,0 - 106,7 кПа (630 - 800 мм. рт. ст.);

Влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °С;

Напряжение в сети 220 + 10 В;

Частота переменного тока 50 +/- 1 Гц

Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией по отбору проб. Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора. Пробы, предназначенные для анализа, должны хранится в холодном темном месте.

Перед использованием доведите температуру всех реагентов (включая дистиллированную воду) до комнатной (20 - 25°С). Это займет около 1 часа.

Стандартные растворы. Стандартные растворы афлатоксина поставляются готовыми для использования. Величина концентрации афлатоксина, нанесенная на флаконы с растворами, дана с учетом фактора разбавления исследуемых образцов при пробоподготовке, поэтому результат определения может быть получен непосредственно по калибровочной кривой.

Приготовление 60%-ного раствора метанола. В мерную колбу на 250 куб. см помещают 150 куб. см метанола и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.

Приготовление буферного раствора. Приготовьте буферный раствор, смешивая 1 часть концентрированного буфера (зеленая этикетка) и 24 части дистиллированной воды. На каждый стрип из 8 лунок требуется примерно 50 куб. см готового буферного раствора. Готовый буфер может храниться в течение 6 месяцев при 4 °С.

Микротитровальный планшет. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов вместе с рамкой. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет с силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 - 8 °С.

7.3.1. Исследуемую пробу размалывают с помощью мельницы для размола сыпучих продуктов до размера частиц 0,85 мм.

7.3.2. Навеску размолотой пробы массой 50 г смешивают в блендере с 4 г хлорида натрия и 250 куб. см 60%-ного раствора метанола.

7.3.3. Перемешивают 1 мин. на высокой скорости.

7.3.4. Фильтруют раствор через фильтровальную бумагу типа "белая лента".

7.3.5. Фильтрат готов для постановки иммуноферментной реакции.

7.3.6. Для анализа используют 100 мкл фильтрата.

8.1. Предварительные замечания к проведению измерений с помощью тест-системы AFLAPLATE:

- После использования немедленно охладите все оставшиеся реагенты до температуры 2 - 8 °С, избегайте длительного хранения реагентов при комнатной температуре;

- В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета. Избегайте перерывов при выполнении анализа;

- Воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета;

- На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света. Во время инкубации рекомендуется помещать планшет в темное место или прикрывать планшет непрозрачным экраном.

8.2. Проведение измерений

8.2.1. Извлеките из фольгированного пакета необходимое количество лунок белого цвета для смешения растворов - по одной лунке на каждую пробу и 6 лунок - для стандартных растворов. Поместите лунки в рамку.

8.2.2. Извлеките из фольгированного пакета необходимое количество прозрачных лунок с антителами - по одной лунке на каждую пробу и 6 лунок - для стандартных растворов. Поместите лунки в рамку.

8.2.3. Немедленно упакуйте оставшиеся лунки в фольгированный пакет вместе с осушителем и поместите на хранение при 4 °С.

8.2.4. Нанесите координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов, на разграфленную бумагу, как это показано на рисунке (Ст. - стандарты, Пр. - пробы, показаны только прозрачные лунки):

8.2.5. Пометьте лунки с антителами, чтобы идентифицировать их после промывки.

8.2.6. Осторожно, не допуская вспенивания, перемешайте флаконы с реагентами.

8.2.7. Перед пипетированием смачивайте каждый свежий наконечник пипетки дозируемым раствором (наберите и выпустите раствор).

8.2.8. Внесите по 100 мкл конъюгата (красная этикетка) в белые лунки смешения.

8.2.9. Используя каждый раз свежий наконечник пипетки, добавьте по 100 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие лунки смешения согласно рисунку на разграфленной бумаге (см. п. 8.2.5).

8.2.10. С помощью 8-канальной пипетки на 100 мкл перемешайте растворы в лунках, набирая растворы в наконечники и выпуская их обратно в лунки 3 раза подряд (для каждого стрипа из 8 лунок используйте свежие наконечники!). При использовании автоматических пипеток всегда старайтесь избежать образования пузырьков в лунках.

8.2.11. Поменяйте наконечники.

8.2.12. Перенесите по 100 мкл растворов из лунок смешения в соответствующие лунки с антителами.

8.2.13. Перемешайте растворы в лунках с антителами, передвигая рамку с лунками по гладкой поверхности быстрыми поступательными движениями.

8.2.14. Извлеките из рамки лунки смешения (белого цвета) и поместите их в раствор для деконтаминации.

8.2.15. Прозрачные лунки с антителами поставьте на 15 мин. в темное место при комнатной температуре для инкубации. Несоблюдение времени инкубации в процессе постановки иммуноферментного анализа может привести к недостоверным результатам!

8.2.16. После инкубации вылейте содержимое лунок в деконтаминирующий раствор.

8.2.17. С помощью промывалки (или 8-канальной пипетки на 250 мкл) заполните лунки готовым моющим буфером и снова опорожните лунки.

8.2.18. Вылейте жидкость из лунок. Во избежание появления пленки поверхностного натяжения, препятствующий добавлению промывочного раствора в лунки, переверните рамку планшета и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного (не более!) постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой.

8.2.19. Повторите процедуру отмывки еще 4 раза.

8.2.20. Отберите необходимый объем субстрата (голубая этикетка) из флакона в чистую ванночку для реагентов (на 1 стрип требуется 1 куб. см).

8.2.21. С помощью 8-канальной пипетки перенесите из ванночки по 100 мкл субстрата в каждую лунку с антителами.

8.2.22. Перемешайте растворы в лунках, передвигая рамку по гладкой поверхности быстрыми поступательными движениями.

8.2.23. Инкубируйте лунки в течение 20 мин. в темноте.

8.2.24. Отберите необходимый объем стоп-раствора (желтая этикетка) из флакона в новую чистую ванночку для реагентов (на 1 стрип требуется 1 куб. см).

8.2.25. С помощью 8-канальной пипетки с новыми наконечниками перенесите из ванночки по 100 мкл стоп - раствора в каждую лунку.

8.2.26. Перемешайте растворы в лунках, передвигая рамку по гладкой поверхности быстрыми поступательными движениями.

8.2.27. Протрите донышки лунок фильтровальной бумагой.

8.2.28. В течение 5-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм относительно воздуха.

Значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами, делятся на значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:

Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например, РИДА(R) Софт. При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения.