Инструкция разработана ФГУ "ВИЭВ" и ФГУП "Щелковский биокомбинат". 141142, Московская обл., Щелковский район, п. Биокомбината, ФГУП "Щелковский биокомбинат".

Набор рекомендован к регистрации ФГУ "ВГНКИ". Регистрационный номер ПВР-1-2.3/01289.

С утверждением настоящей инструкции прекращает действие на территории России наставление по применению набора для диагностики инфекционной анемии лошадей в реакции диффузионной преципитации за N 13-5-02/0894 от 27.01.2004, утвержденное Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ.

Адрес предприятия-изготовителя: 141142, Московская область, Щелковский район, п. Биокомбината. Коммерческая служба: (495) 225-18-16, тел./факс МО (256) 3-23-48, регион (496-56) 3-23-48.

1. Набор для диагностики инфекционной анемии лошадей в реакции диффузионной преципитации (РДП).

2. Набор рассчитан на исследование 90 ... 120 проб сывороток крови.

Набор содержит:

3. Препараты, входящие в состав набора (антиген, антисыворотка, кислота борная, раствор натрия гидроокиси, агар "Дифко") расфасованы во флаконы вместимостью 10 см³, укупорены пробками, укрепленными алюминиевыми колпачками.

4. На каждый флакон с препаратами наклеена этикетка с указанием наименования препарата, его количества в объемных единицах, количества доз антигена и антисыворотки, объема растворителя, вносимого во флакон с антигеном и антисывороткой, необходимого для приготовления рабочего разведения, номера серии и срока годности.

5. Флаконы с препаратами, входящими в состав набора, уложены в картонные коробки с разделительными перегородками. В каждую коробку вложена инструкция по применению набора.

6. На коробке с флаконами наклеена этикетка, на которой должны быть указаны наименование предприятия-изготовителя, его товарный знак, полное наименование набора, номер серии и номер контроля, количество флаконов каждого препарата в коробке, количество препарата в объемных единицах и количество доз препарата во флаконе (для антигена и антисыворотки), дата изготовления, срок годности, условия хранения, обозначение нормативного документа и надпись "Для животных".

7. Флаконы с препаратами без этикеток, с трещинами, нарушенной укупоркой, содержащие посторонние примеси, хлопья, с истекшим сроком годности выбраковывают и обезвреживают кипячением в течение 15 мин.

8. Срок годности набора - 2 года с даты изготовления при хранении в сухом темном месте при температуре от 4 °C до 8 °C.

9. Антиген (экстракт гомогената селезенки) содержит внутренний структурный белок вируса с молекулярной массой g 26. Он относится к так называемым растворимым антигенам, способным диффундировать в агаровом геле. Является общим (группоспецифическим антигеном) для всех штаммов вируса ИНАН.

10. Принцип метода основан на встречной диффузии антител (иммунной сыворотки) и растворимого антигена в агаровом геле. При наличии в исследуемой сыворотке антител, гомологичных антигену, образуется полоса преципитации.

11. Набор применяют для лабораторной диагностики инфекционной анемии лошадей с целью обнаружения специфических антител в сыворотках крови лошадей, больных инфекционной анемией.

12. Специфические антитела появляются в крови животных через 2 ... 6 недель после инфицирования и сохраняются на протяжении длительного времени (более 7 лет).

13. Набор применяют для исследования сывороток крови лошадей на выявление антител к вирусу инфекционной анемии при остром, хроническом и латентном течении болезни. Набор рассчитан на исследование 90 ... 120 проб сывороток крови.

14. Антиген и антисыворотка, имеющиеся в наборе, используются в качестве тест-системы "антиген-антитело" при постановке реакции.

15. Перед постановкой реакции сухие антиген и антисыворотку растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке (приготовленные разведения являются рабочими разведениями). Антиген и сыворотка должны полностью раствориться в течение 3 ... 5 мин без образования не разбивающихся при встряхивании хлопьев.

Антиген и антисыворотку, неиспользованные в день растворения, сохраняют в замороженном состоянии при температуре -10 °C до повторного исследования. Повторное замораживание сыворотки не допускается.

16. Испытуемые сыворотки в количестве не менее 5 ... 6 см³ получают от исследуемых лошадей. Их консервируют путем добавления антибиотиков: пенициллина и стрептомицина - по 1000 ЕД/мл и хранят при температуре 4 ... 8 °C в течение 10 сут. Сыворотки без консерванта сохраняют в замороженном состоянии.

17. Для приготовления 1% геля агара "Дифко" в стеклянную колбу вместимостью 250 ... 300 см³ отмеряют 140 см³ дистиллированной воды, затем в нее последовательно вносят борную кислоту и раствор гидроокиси натрия 3%. Содержимое колбы перемешивают до полного растворения борной кислоты. Проверяют pH буфера. Буфер должен иметь pH в пределах 8,6 +/- 0,1.

В приготовленный боратный буфер вносят агар "Дифко" - 1,5 г. Колбу ставят на баню с водой, воду доводят до кипения и выдерживают на бане до полного расплавления агара. В чашки Петри диаметром 15 см вносят 15 см³ расплавленного агара, предварительно охладив его до 60 °C. Чашки оставляют на один час с приоткрытыми крышками и дают агару застыть.

18. Контроль качества агара проводят визуально, после его застывания. Слой агара должен быть ровным по всей поверхности чашки, без пузырьков газа. Толщина слоя 3 мм.

После застывания агара приступают к вырезанию лунок. Для этого используют специально подготовленные пробойники из 7 жестко закрепленных трубочек диаметром 7 мм - одна в центре и 6 по окружности на расстоянии 3 мм от центральной и друг от друга (см. приложение, рис. 13). Агаровые пробки удаляют иглой, пинцетом или канюлей, соединенной с вакуумной установкой. Если в лунках накапливается влага, то ее перед внесением реагентов отсасывают пипеткой.

19. Постановка реакции

Используют 2 схемы заполнения лунок. Первая - в центральную лунку вносят микропипеткой 0,05 ... 0,06 мл антигена, в три периферические лунки, через одну, закапывают по 0,05 ... 0,06 мл антисыворотку в рабочих разведениях (п. 3.2). Оставшиеся 3 свободные лунки заполняют с помощью тонко оттянутой пастеровской пипетки исследуемыми сыворотками. При этом в одной чашке исследуются 12 проб сыворотки (см. приложение, рис. 14).

20. В случае проведения массовых исследований может быть использована вторая схема заполнения лунок, которая позволяет в одной чашке одновременно исследовать 16 проб. В центральную лунку вносят антиген; в две периферические, диаметрально противоположные лунки вносят антисыворотку и в оставшиеся 4 - испытуемые сыворотки (см. приложение, рис. 15). Для каждой пробы сыворотки используют отдельную пастеровскую пипетку.

После заполнения лунок чашки Петри закрывают крышками и помещают во влажную камеру при температуре 18 ... 25°C.

21. Учет реакции

Реакцию учитывают через 48 ... 72 ч. Чашки просматривают на темном фоне в косо направленном пучке света. Для этой цели используют осветитель ОИ-19 или другой аналогичный прибор.

Оценку реакции делают по контрольной линии преципитации - линии преципитации между контрольными антигеном и антисывороткой. Если она отсутствует или слабо выражена, то исследование необходимо повторить. Контрольные линии преципитации должны быть четкими, располагаться посередине между лунками с антигеном и сывороткой.

22. Существенный сдвиг контрольных линий преципитации в сторону антигена или сыворотки, а также слабо выраженные контрольные линии являются показателем слабой активности одного или обоих компонентов набора. В этом случае проводят подтитровку антигена и антисыворотки. Для этого сухой препарат, антиген или антисыворотку, растворяют в два раза меньшем объеме дистиллированной воды, затем готовят разведения 1:1,25; 1:1,5, 1:1,75 и проверяют в РДП. За рабочее разведение принимают то разведение диагностикума, которое дает четкие линии преципитации, расположенные посередине между лунками с антигеном и антисывороткой.

23. Оценка результатов реакции

Отрицательная - контрольные линии продолжаются в сторону лунки с испытуемой сывороткой без изгибов или с небольшим изгибом в сторону контрольной сыворотки (см. приложение, рис. 15, лунка 3).

Положительная:

а) между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном образуется полоса преципитации, которая соединяется с контрольной линией (см. приложение, рис. 14 и 15, лунка 1);

б) линия преципитации отсутствует, но контрольные линии образуют вблизи с испытуемой сывороткой изгиб, направленный в сторону антигена, - слабоположительная сыворотка (см. приложение, рис. 14 и 15, лунка 2);

в) контрольные линии укорачиваются со стороны лунки с испытуемой сывороткой, в отдельных случаях контрольные линии полностью растворяются, что свидетельствует о высоком титре антител (см. приложение, рис. 14 и 15, лунка 6).

Более различимые линии преципитации будут образовываться, если эти пробы развести 1:4 или 1:8 и повторить реакцию.

Сомнительная реакция - слабый изгиб контрольной линии плохо просматривается; образуются интенсивные неспецифические линии или ореол вокруг лунок, что затрудняет учет реакции.

От животных, давших сомнительную реакцию, через 2 ... 3 недели берут кровь и исследование повторяют.

Пробы сыворотки, давшие при повторном исследовании отрицательный результат, считают отрицательными.

При получении повторной сомнительной реакции результат считают положительным.

Неспецифическая преципитация образуется с некоторыми пробами сыворотки, особенно полученными от старых лошадей. Признаком неспецифической реакции является перекрещивание линий преципитации с контрольными линиями (см. приложение, рис. 14 и 15, лунки 5 и 4).

В одной и той же пробе сыворотки могут быть специфические и неспецифические антитела.

24. При образовании вокруг лунок интенсивного ореола, затрудняющего учет реакции, эти пробы сыворотки исследуют повторно, добавив к агару 5% хлористого натрия. Для этого к 150 мл боратного буфера добавляют 7,5 г химически чистого хлористого натрия.

25. Жеребят, полученных от положительно реагирующих в реакции РДП кобыл, исследуют после отъема в возрасте 6 ... 8 мес.

26. Результаты учета реакции регистрируют в специальных журналах, которые должны быть прошнурованы, пронумерованы и скреплены печатью.

27. При работе с препаратами, входящими в состав набора, следует соблюдать общие правила личной гигиены и техники безопасности, предусмотренные при работе с ветеринарными препаратами. При попадании на открытые участки тела или слизистые оболочки глаз, рта, носа и после окончания работы руки и другие открытые участки тела моют водой с мылом.

28. Набор следует хранить в местах, не доступных для детей.

Условные обозначения: A - лунки с антигеном; C - лунки с контрольными антисыворотками; 1, 2, 3, 4, 5, 6 - лунки с испытуемыми сыворотками.