Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске продукта бактерий рода Salmonella.

1. Разработан и внесен Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП) и Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 "Продукты переработки плодов и овощей".

2. Принят Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации 23 апреля 1997 г. в качестве межгосударственного стандарта ГОСТ 30519-97.

За принятие проголосовали:

3. Введен впервые.

4. Ссылочные нормативно-технические документы

5. Постановлением Госстандарта России от 16 апреля 1998 г. N 122 ГОСТ 30519-97 введен в действие в качестве государственного стандарта Российской Федерации с момента принятия указанного постановления и признан имеющим одинаковую силу с ГОСТ Р 50480-93 на территории Российской Федерации в связи с полной аутентичностью их содержания.

Метод выявления бактерий рода Salmonella основан на высеве определенного количества продукта в жидкую неселективную среду, инкубировании посевов, последующем выявлении в этих посевах бактерий, способных развиваться в жидких селективных средах, образующих типичные колонии на агаризованных дифференциально-диагностических средах, имеющих типичные для бактерий рода Salmonella биохимические и серологические характеристики.

Отбор и подготовка проб - по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669 или по нормативно-технической документации на анализируемый продукт.

Для проведения анализа применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1, а также указанные ниже:

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности (для взвешивания реактивов);

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 1 кг, 4-го класса точности (для взвешивания продукта);

микроскоп световой биологический с увеличением 900 - ;

петлю бактериологическую;

стекла предметные по ГОСТ 9284;

стекла покровные по ГОСТ 6672;

термостат с диапазоном рабочих температур 28 - 55 °C, позволяющий поддерживать заданную температуру с допустимой погрешностью +/- 1 °C;

спирт изобутиловый по ГОСТ 9536;

бриллиантовый зеленый;

желчь сухую или натуральную;

контрольный штамм бактерий рода Salmonella, не относящихся к тифозной группе;

магний хлористый по ГОСТ 4209;

мочевину по ГОСТ 6691;

сухие агглютинирующие адсорбированные поливалентные сальмонеллезные сыворотки основных групп A, B, C, D, E, и редких групп;

феноловый красный.

4.1. Приготовление растворов и реактивов

4.1.1. Раствор бриллиантового зеленого концентрации 5 г/дм3: 0,5 г бриллиантового зеленого переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

4.1.2. Раствор фенолового красного концентрации 4 г/дм3: 0,4 г фенолового красного переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

4.1.3. Реактив Эрлиха: 1,0 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 95 см3 этилового спирта объемной концентрации 96% и прибавляют 80 см3 концентрированной соляной кислоты ( = 1,18 - 1,19 г/см3).

4.1.4. Реактив Ковача: перемешивают 5,0 г парадиметиламинобензальдегида, 25 см3 концентрированной соляной кислоты и 75 см3 изобутилового спирта.

4.1.5. Спиртовой раствор -нафтола концентрации 50 г/дм3: 5,0 г -нафтола помещают в колбу вместимостью 100 см3, растворяют в этиловом спирте объемной концентрации 96% и доводят раствор этиловым спиртом до метки. Раствор готовят непосредственно перед применением.

4.1.6. Спиртовой раствор фенолового красного концентрации 2 г/дм3: 0,2 г фенолового красного переносят в колбу вместимостью 100 см3, растворяют в этиловом спирте объемной концентрации 50% и доводят раствор этиловым спиртом до метки.

4.1.7. Сухие агглютинирующие адсорбционные поливалентные сальмонеллезные сыворотки готовят перед употреблением по прописи, указанной в прилагаемом к ним наставлении.

4.2. Приготовление питательных сред

4.2.1. Забуференная пептонная вода: 10,0 г пептона, 5,0 г хлористого натрия, 9,0 г двузамещенного фосфорнокислого натрия , 1,5 г однозамещенного фосфорнокислого калия растворяют при нагревании в 1000 см3 дистиллированной воды, устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25 °C 7,0 +/- 0,1. Разливают по колбам в количестве, зависящем от навески анализируемого продукта (если навеска равна 25 г, то разливают по 225 см3, то есть 1:9), и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 20 мин.

4.2.2. Магниевая среда: готовят путем соединения трех растворов.

Приготовление раствора 1: 8,4 г пептона, 14,3 г хлористого натрия, 40 см3 дрожжевого экстракта, приготовленного по ГОСТ 10444.1, 2,85 г однозамещенного фосфорнокислого калия растворяют при нагревании в 1780 см3 дистиллированной воды.

Приготовление раствора 2: 71,4 г хлористого магния растворяют при нагревании в 180 см3 дистиллированной воды.

Раствор 3: берут 1,8 см3 раствора бриллиантового зеленого, приготовленного по 4.1.1.

Приготовленные растворы соединяют, устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25 °C 7,2 +/- 0,2, разливают в колбы или флаконы по 100 см3 и стерилизуют при температуре (112 +/- 1) °C в течение 30 мин.

4.2.3. Селенитовая среда: готовят из двух растворов.

Приготовление раствора 1: 5,0 г пептона, 7,0 г безводного двузамещенного фосфорнокислого натрия, 3,0 г безводного однозамещенного фосфорнокислого натрия, 4,0 г лактозы растворяют при нагревании в 1000 см3 дистиллированной воды, охлаждают до 45 - 55 °C, если необходимо, путем изменения соотношения фосфатных солей устанавливают pH 7,0 +/- 0,1. Среду разливают по 100 см3 в колбы или флаконы и стерилизуют текучим паром по 30 мин в течение двух дней или при температуре (112 +/- 1) °C в течение 30 мин.

Приготовление раствора 2: 10,0 г кислого селенисто-кислого натрия растворяют асептически в 100 см3 стерильной дистиллированной воды. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

Приготовление среды: к 100 см3 раствора 1 прибавляют 4 см3 раствора 2.

Стерилизация приготовленной среды не допускается, так как при этом происходит редукция кислого селенисто-кислого натрия, выпадает осадок красного цвета и среда становится непригодной.

Селенитовая среда выпускается в сухом виде и готовится по прописи, указанной на этикетке.

4.2.4. Тетратионатная среда (Мюллер-Кауфман)

Приготовление основы среды: в 100 см3 мясопептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, помещают 4,5 г стерильного углекислого кальция. Углекислый кальций стерилизуют по ГОСТ 10444.1.

Приготовленную основу стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 20 мин.

При приготовлении среды к 100 см3 основы среды асептически прибавляют:

10 см3 раствора гипосульфита натрия ;

2 см3 йодного раствора;

0,2 см3 раствора бриллиантового зеленого;

5 см3 раствора желчи.

Указанные растворы прибавляют к основе среды в приведенном выше порядке, перемешивая смесь после каждого прибавления.

Среду допускается использовать в течение одной недели после приготовления.

Указанные выше растворы, прибавляемые к основе среды, готовят следующим образом:

раствор гипосульфита натрия: 50,0 г гипосульфита натрия помещают в колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор переливают в колбу или флакон и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин или при температуре (121 +/- 1) °C в течение 20 мин;

йодный раствор: 25,0 г йодистого калия помещают в колбу вместимостью 100 см3, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, прибавляют 20,0 г кристаллического йода, растворяют его. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.

Раствор хранят в плотно закрытом темном сосуде;

раствор бриллиантового зеленого готовят по 4.1.1;

раствор желчи: 10,0 г сухой желчи растворяют в 100 см3 дистиллированной воды или используют натуральную желчь. Раствор желчи или натуральную желчь стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 20 мин.

4.2.5. Дифференциально-диагностические среды (сухие):

висмут-сульфит агар (Вильсон-Блера);

среда Плоскирева;

среда Эндо;

среда Левина.

Среды готовят по прописи, указанной на этикетке.

4.2.6. Трехсахарный агар: 10,0 г пептона, 3,0 г сухого дрожжевого экстракта или 15 см3 дрожжевого экстракта, приготовленного по ГОСТ 10444.1, 10,0 г лактозы, 10,0 г сахарозы, 1,0 г глюкозы, 0,3 г цитрата железа (или 0,2 г аммоний-железо сульфата или 0,2 г сернокислого железа ), 0,3 г гипосульфита натрия, 6 см3 раствора фенолового красного, приготовленного по п. 4.1.2, 15,0 г агара растворяют при нагревании в 1000 см3 мясопептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, охлаждают до 45 - 55 °C и устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25 °C 7,2 +/- 0,2. Среду разливают в пробирки по 6 - 7 см3 и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 10 мин.

4.2.7. Агар Кристенсена с мочевиной: среда готовится путем соединения основы среды и раствора мочевины.

Основа среды: 1,0 г пептона, 1,0 г глюкозы, 5,0 г хлористого натрия, 2,0 г безводного однозамещенного фосфорнокислого калия, 3 см3 раствора фенолового красного, приготовленного по 4.1.2, 15,0 г агара растворяют при нагревании в 1000 см3 дистиллированной воды, охлаждают до 45 - 55 °C и устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25 °C 6,7 +/- 0,1.

Основу среды мерно разливают в колбы или флаконы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 20 мин.

Раствор мочевины концентрации 400 г/дм3: 40,0 г мочевины помещают в колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде, объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.

Раствор мочевины стерилизуют фильтрацией по ГОСТ 26670 или текучим паром в течение 30 мин.

При приготовлении среды к 950 см3 основы прибавляют асептически 50 см3 раствора мочевины, разливают в стерильные пробирки по 6 - 7 см3.

4.2.8. После стерилизации среды, приготовленные по 4.2.6 и 4.2.7, скашивают так, чтобы оставался столбик высотой 2 - 2,5 см.

4.2.9. Полужидкий мясопептонный агар: готовят по ГОСТ 10444.1 так же, как мясопептонный агар, но при приготовлении добавляют 4,0 - 8,0 г агара на 1000 см3 мясопептонного бульона, перед стерилизацией среду разливают по 6 - 7 см3 в пробирки.

4.2.10. Мясопептонный бульон с глюкозой: готовят по ГОСТ 10444.1. Для посевов используют среду, разлитую в пробирки по 6 - 7 см3.

4.2.11. Бульон Хоттингера: готовят по ГОСТ 10444.1. Для посевов используют среду, разлитую в пробирки по 6 - 7 см3.

4.2.12. Мясопептонный бульон с 0,05% L-триптофана: 0,05 г L-триптофана растворяют в 100 см3 мясопептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, разливают в пробирки по 6 - 7 см3 и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 20 мин.

4.2.13. Среды с углеводами (среды Гисса): готовят по ГОСТ 10444.1 или используют сухие среды с углеводами, которые готовят по прописи, указанной на этикетке.

4.2.14. Мясопептонный агар: готовят по ГОСТ 10444.1 или используют среду, приготовленную из сухого питательного агара.

Среду из сухого питательного агара готовят по прописи, указанной на этикетке.

5.1. Неселективное предварительное обогащение

Навеску продукта, в массе (объеме) которой нормативно-технической документацией на анализируемый продукт предусматривается отсутствие бактерий рода Salmonella, высевают в забуференную пептонную воду, приготовленную по 4.2.1. Соотношение массы (объема) продукта и забуференной пептонной воды 1:9.

При посеве жидких высококислотных продуктов для предотвращения снижения pH питательных сред на 0,5 и более pH продукта перед посевом доводят до 7,0 +/- 0,2.

При посеве твердых высококислотных продуктов доводят pH до 7,0 +/- 0,2 в посевах.

Доведение pH проводят асептически с помощью стерильных растворов гидроокиси натрия и соляной кислоты, приготовленных по ГОСТ 10444.1. Количество добавляемого раствора гидроокиси натрия устанавливают опытным путем.

Посевы инкубируют при температуре (36 +/- 1) °C в течение 18 - 20 ч.

5.2. Селективное обогащение

Культуры, полученные после инкубирования по 5.1, пересевают в две среды для селективного обогащения. Для этого по 10 см3 культуры переносят в 100 см3 магниевой среды, приготовленной по 4.2.2, и в 100 см3 тетратионатной среды, приготовленной по 4.2.4, или по 10 см3 культуры переносят в 100 см3 селенитовой среды, приготовленной по 4.2.3, и в 100 см3 тетратионатной среды.

Посевы инкубируют в течение 24 - 48 ч на магниевой и селенитовой средах при температуре (36 +/- 1) °C, а на тетратионатной среде при температуре (43 +/- 1) °C.

5.3. Выделение и идентификация культур на агаризованных дифференциально-диагностических средах

Культуры через 24 и 48 ч инкубирования по 5.2 пересевают (по ГОСТ 26670) на три агаризованные среды, приготовленные по 4.2.5: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева и среду Эндо (или среду Левина).

Допускается использование одной чашки каждой из сред для одновременного высева с двух селективных сред.

Посевы инкубируют при температуре (36 +/- 1) °C в течение 24 - 48 ч.

После 24 ч инкубирования посевов проводят предварительный учет результатов, а после 48 ч - окончательный.

После инкубирования посевов отмечают на дифференциально-диагностических средах рост колоний, характерных для бактерий рода Salmonella:

на висмут-сульфит агаре колонии черные с характерным металлическим блеском, а также зеленоватые с темно-зеленым ободком и с пигментированием среды под колониями;

на среде Плоскирева колонии бесцветные прозрачные, но более плотные, чем на среде Эндо;

на среде Эндо колонии круглые бесцветные или слегка розоватые, прозрачные;

на среде Левина колонии прозрачные, слабо-розовые или розовато-фиолетовые.

При отсутствии в посевах на дифференциально-диагностических средах характерных для бактерий рода Salmonella колоний дают заключение об отсутствии бактерий рода Salmonella в анализируемой навеске продукта.

При наличии хотя бы на одной дифференциально-диагностической среде характерных для бактерий рода Salmonella колоний проводят их дальнейшее изучение.

5.4. Биохимическое подтверждение принадлежности выделенных характерных колоний к бактериям рода Salmonella

5.4.1. Не менее трех характерных колоний с каждой дифференциально-диагностической среды (см. 5.3) пересевают на скошенную поверхность мясопептонного агара или среды из сухого питательного агара, приготовленных по 4.2.14, и часть колоний пересевают штрихом по поверхности и уколом в столбик трехсахарного агара, приготовленного по 4.2.6.

Посевы инкубируют при температуре (36 +/- 1)°C в течение 24 ч.

5.4.2. Из отобранных по п. 5.4.1 для биохимического подтверждения колоний приготовляют мазки и окрашивают по Граму.

Бактерии рода Salmonella являются грамотрицательными палочками с закругленными концами.

5.4.3. После инкубирования посевов, как указано в 5.4.1, проводят учет результатов ферментации лактозы, глюкозы и сахарозы на трехсахарном агаре:

пожелтение скошенной части среды указывает на ферментацию лактозы или сахарозы или обоих сахаров;

пожелтение столбика среды с разрывом агара или пузырьками газа указывает на ферментацию глюкозы с образованием газа, пожелтение столбика среды без разрывов или пузырьков газа указывает на ферментацию глюкозы без образования газа;

почернение среды в столбике указывает на образование сероводорода.

Типичными для бактерий рода Salmonella являются культуры, ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, образующие сероводород.

Дальнейшему изучению подвергают также лактозоположительные бактерии или бактерии, не образующие сероводород, но обязательно ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа.

5.4.4. У культур, отобранных согласно 5.4.3 и пересеянных предварительно, как указано в 5.4.1, на поверхность мясопептонного агара или среды, приготовленной из сухого питательного агара, изучают возможность расщепления мочевины, образования ацетоина и индола, ферментации сахарозы и маннита и подвижность.

5.4.5. Определение расщепления мочевины

Культуры пересевают штрихом на поверхность агара Кристенсена с мочевиной, приготовленного по 4.2.7.

Посевы инкубируют при температуре (36 +/- 1) °C в течение 24 ч.

При положительной реакции - расщеплении мочевины - цвет среды от розового до светло-вишневого. Для уреазоположительных бактерий реакция часто становится видимой после 2 ч инкубирования.

Бактерии рода Salmonella не расщепляют мочевину.

5.4.6. Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера)

Культуры пересевают в мясопептонный бульон с глюкозой, приготовленный по 4.2.10.

Посевы инкубируют при температуре (36 +/- 1) °C в течение 48 ч.

После инкубирования к 1 см3 отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 см3 раствора -нафтола, приготовленного по 4.1.5, и 0,2 см3 раствора гидроокиси калия концентрации 400 г/дм3. После прибавления каждого реактива пробирку встряхивают. Появление розового окрашивания через 15 мин указывает на положительную реакцию.

Бактерии рода Salmonella не образуют ацетоина (реакция Фогес-Проскауера отрицательная).

5.4.7. Определение образования индола

Культуры пересевают в бульон Хоттингера, приготовленный по 4.2.11, или в мясопептонный бульон с L-триптофаном, приготовленный по 4.2.12.

Посевы инкубируют при температуре (36 +/- 1) °C в течение 24 ч.

После инкубирования к посевам прибавляют по 1 см3 реактива Эрлиха или Ковача, приготовленных соответственно по 4.1.3 и 4.1.4.

Образование красного слоя указывает на положительную реакцию.

Бактерии рода Salmonella не образуют индол.

5.4.8. Определение ферментации маннита и сахарозы

Культуры пересевают в среды Гисса с маннитом или сахарозой, приготовленные по 4.2.13. Посевы инкубируют при температуре (36 +/- 1) °C в течение 24 ч.

Бактерии рода Salmonella не сбраживают сахарозу, не сбраживают маннит. При сбраживании маннита цвет среды изменяется, образуется или не образуется газ.

5.4.9. Определение подвижности

Культуры пересевают уколом в полужидкий мясопептонный агар. Посевы инкубируют при температуре (36 +/- 1) °C в течение 24 ч.

При росте подвижных культур отмечается диффузный рост по всему столбику агара, при росте неподвижных культур - вдоль места укола.

Большинство штаммов бактерий рода Salmonella подвижны.

5.5. Результаты биохимического подтверждения культур оценивают, пользуясь таблицей Приложения.

5.6. Серологическое подтверждение принадлежности культур к бактериям рода Salmonella

Серологическое подтверждение принадлежности к бактериям рода Salmonella проводят с культурами, давшими типичные биохимические реакции согласно Приложению, и предварительно пересеянными, как указано в 5.4.1, на поверхность мясопептонного агара или среды, приготовленной из сухого питательного агара.

5.6.1. Определение самоагглютинирующих штаммов

Помещают каплю физиологического раствора, приготовленного по ГОСТ 10444.1, на тщательно очищенное предметное стекло. Диспергируют в этой капле часть тестируемой колонии так, чтобы получилась гомогенная и густая суспензия.

Покачивают осторожно стекло в течение 30 - 60 с. Отмечают результаты на темном фоне, лучше с помощью увеличительного стекла. Если наблюдается в разной степени склеивание бактерий, то есть образование осадка, то считают, что тестируемые штаммы обладают самоагглютинацией.

Штаммы бактерий, обладающие самоагглютинацией, не подвергают дальнейшей серологической идентификации.

5.6.2. Определение наличия 0-антигенов

Штаммы, у которых не выявлено самоагглютинации, испытывают в реакции агглютинации с агглютинирующими адсорбированными поливалентными сальмонеллезными сыворотками основных групп A, B, C, D, E, а затем, если не выявлено 0-антигенов с сыворотками основных групп, ставят реакцию с сыворотками редких групп.

Подготовка сывороток к постановке реакции агглютинации и методика ее проведения указаны в наставлении, прилагаемом к сывороткам.

Агглютинация (наличие 0-антигенов) проявляется в виде склеивания бактериальной массы и полного или частичного просветления жидкости.

При отрицательной реакции агглютинации культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки образует гомогенную смесь.

5.7. При определении биохимических и серологических характеристик выделенных культур в качестве контроля используют типичный по этим показателям штамм бактерий рода Salmonella, указанный в разд. 3.

6.1. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

6.2. Интерпретация биохимических и серологических испытаний

Культуры, показавшие типичные биохимические и серологические реакции, относят к бактериям рода Salmonella.

Предположительно к бактериям рода Salmonella относят:

культуры, у которых не обнаружено самоагглютинации и 0-антигенов, но показавшие типичные биохимические реакции;

культуры, у которых обнаружена самоагглютинация и типичные биохимические реакции.

Культуры, у которых не обнаружено самоагглютинации, не давшие типичных биохимических и серологических реакций, не относят к бактериям рода Salmonella.

6.3. Результаты выявления бактерий рода Salmonella в определенной навеске продукта записывают: "Бактерии рода Salmonella обнаружены в X г (см3) продукта" или "Бактерии рода Salmonella не обнаружены в X г (см3) продукта".

X - масса (объем) навески продукта, в которой выявляли бактерии рода Salmonella.