Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН Республиканским унитарным предприятием "Республиканский научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по продовольствию"

2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 февраля 2015 г. N 75-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 16 июня 2016 г. N 642-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 9231-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 9231/IDF 139:2008 "Молоко и молочные продукты. Определение бензойной и сорбиновой кислот" ("Milk and milk products - Determination of the benzoic and sorbic acids contents").

Международный стандарт ISO 9231/IDF 139 был подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 34 "Пищевые продукты", Подкомитетом SC 5 "Молоко и молочные продукты" и Международной молочной федерацией (IDF). Документ издается совместно ISO и IDF.

В разделе "Нормативные ссылки" и тексте стандарта ссылки на международный стандарт актуализированы.

В стандарт внесены незначительные редакционные изменения.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования международного стандарта в связи с особенностями системы межгосударственной стандартизации.

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и международного стандарта, на который дана ссылка, имеются в Федеральном органе по техническому регулированию и метрологии.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания бензойной и сорбиновой кислот в молоке и молочных продуктах.

Метод применим для молока, сухого молока, йогурта и других кисломолочных продуктов, для сыра и плавленого сыра и позволяет определять содержание сорбиновой и бензойной кислот в концентрациях более 5 мг/кг.

Для применения данного стандарта необходимы следующие документы, которые представлены в виде ссылок. Для ссылок на публикации с указанием года их издания действительны только указанные издания. Для ссылок на публикации без указания года издания действительно последнее издание приведенной публикации (включая поправки и изменения).

ISO 1042 Посуда лабораторная стеклянная. Мерные колбы с одной меткой

Для целей настоящего стандарта применяются следующие термины и определения:

3.1 содержание бензойной и сорбиновой кислот: Количество бензойной и сорбиновой кислот в миллиграммах на килограмм молока или молочного продукта, определенное по настоящему стандарту.

Жиры и белки удаляют из слабого щелочного раствора продукта осаждением растворами Карреза. Надосадочную жидкость фильтруют и добавляют метанол. Бензойную и сорбиновую кислоты разделяют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с применением обращенно-фазовой колонки C₁₈, измеряя поглощение на длинах волн 227 и 250 нм.

Используют только реагенты признанной аналитической чистоты и дистиллированная или деионизированная вода или вода соответствующей чистоты.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ (6.3) помещают 10,6 г гексацианоферрата (II) калия трехводного (K₄[Fe(CN)₆] 3H₂O) и растворяют в воде. Доводят водой до метки и перемешивают.

Примечание - 100 см³ раствора достаточно для проведения 40 анализов.

Растворяют 21,9 г ацетата цинка двухводного [(CH₃COO)₂Zn 2H₂O] и 32 см³ уксусной кислоты (CH₃COOH) в воде в мерной колбе вместимостью 100 см³ (6.3).

Доводят водой до метки и перемешивают.

Если двухводный ацетат цинка полностью не растворяется, нагревают колбу и ее содержимое на водяной бане (6.2) при температуре 70 °C и постоянном перемешивании. После растворения двухводного ацетата цинка раствор охлаждают до комнатной температуры. Доводят водой до метки и перемешивают.

Примечание - 100 см³ раствора достаточно для проведения 40 анализов.

Растворяют 2,5 г дигидрофосфата калия (KH₂PO₄) и 2,5 г гидрофосфата калия трехводного (K₂HPO₄·3H₂O) в 1 дм³ воды и перемешивают. Полученный раствор фильтруют с помощью системы фильтрации растворителей (6.8).

Смешивают 10 объемных частей метанола (5.1) с 90 объемными частями раствора фосфатного буфера (5.3). Излишки газа удаляют легким вакуумом.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ (6.3) помещают 4,0 г гранул гидроокиси натрия и растворяют в воде (6.3). Доводят водой до метки и перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 500 см³ (6.3), содержащую 250 см³ воды, осторожно вносят 15 см³ концентрированной серной кислоты с массовой долей от 95 до 98% и охлаждают. Полученный раствор доводят водой до метки и перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ (6.3) помещают 50 мг сорбиновой кислоты и 50 мг бензойной кислоты и растворяют в метаноле (5.1). Доводят метанолом (5.1) до метки и перемешивают.

Основной стандартный раствор годен в течение трех недель при хранении в холодильнике при температуре 4 - 7 °C.

Для получения водно-метанольного раствора с объемными долями 50% смешивают 500 см³ метанола (5.1) с 500 см³ воды.

В день проведения испытания пипеткой отбирают 5 см³ основного раствора (5.7.1) и помещают в мерную колбу вместимостью 250 см³ (6.3). Доводят 50% водно-метанольным раствором до метки и перемешивают. Полученный рабочий раствор содержит 10 мкг/см³ сорбиновой и бензойной кислот.

6.1 Весы аналитические с наименьшим пределом взвешивания 1 мг и ценой деления 0,1 мг.

6.2 Водяная баня с возможностью поддерживания температуры (70 +/- 2) °C.

6.3 Мерные колбы вместимостью 100, 250, 500 и 1000 см³, соответствующие требованиям ISO 1042 для класса A.

6.4 Жидкостной хроматограф, оснащенный насосом высокого давления с верхним пределом давления не менее 4,37 мПа (6000 PSI), двухволновым УФ-детектором или УФ-детектором с диодной матрицей, самописцем или интегратором.

Двухволновой детектор должен иметь длину оптического пути, равную 1 см, и возможность измерения оптической плотности на длине волны 227 нм - для бензойной кислоты и 250 нм - для сорбиновой кислоты.

6.5 Колонка для ВЭЖХ, изготовленная из нержавеющей стали, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4 мм, заполненная обращенно-фазовым кремниевым сорбентом с привитыми октадецильными группами, например, Micro-Bondapak C18 <1> или ее аналог.

--------------------------------

<1> Micro-Bondapak C18 доступное коммерческое название продукта. Эта информация дана для удобства пользователей стандарта, но не является рекомендацией названного продукта.

6.6 Шприц для ВЭЖХ.

6.7 Набор мембранных фильтров для водных проб с размерами пор фильтра 0,45 мкм.

6.8 Система фильтрации растворов, включая мембранные фильтры для водных растворов, размером пор 0,45 мкм.

6.9 Ультразвуковая баня.

6.10 pH-метр.

В лабораторию направляется репрезентативная проба без повреждений или изменений во время транспортировки или при хранении.

Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора приведен в [1].

При хранении испытуемого образца необходимо принимать меры, не допускающие порчи образца и изменения его состава.

Перед началом анализа образец гомогенизируют, осторожно нагревая при температуре 40 °C при постоянном перемешивании. В мерную колбу вместимостью 100 см³ (6.3) помещают 20 +/- 0,1 г гомогенизированного образца.

В стеклянный лабораторный стакан вместимостью 20 см³ помещают 3 +/- 0,1 г пробы. Испытуемый образец полностью диспергируют в 10 см³ воды, добавляя воду небольшими порциями при постоянном перемешивании стеклянной палочкой.

Раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ (6.3), дважды ополоснув стакан 5 см³ воды.

К испытуемой пробе (по 8.1 или 8.2) прибавляют 25 см³ раствора гидроокиси натрия (5.5) и перемешивают. Колбу и ее содержимое помещают в ультразвуковую баню (6.9) на 15 мин. или нагревают на водяной бане (6.2) при температуре 70 °C в течение 15 мин. Затем раствор охлаждают до комнатной температуры.

К испытуемому раствору при постоянном перемешивании добавляют раствор серной кислоты (5.6) и доводят pH раствора до 8 +/- 1 ед. pH. Для осаждения жиров и белков добавляют 2 см³ раствора гексацианоферрата (II) калия (5.2.1) и 2 см³ раствора ацетата цинка (5.2.2). Энергично встряхивают и оставляют полученную суспензию для отстаивания на 15 мин. Затем добавляют 40 см³ метанола и перемешивают. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры.

Метанолом (5.1) доводят раствор до метки и снова перемешивают. Раствор оставляют на 15 мин. Надосадочную жидкость фильтруют при помощи мембранных фильтров (6.7).

ВЭЖХ-анализ проводят при комнатной температуре с использованием подвижной фазы (5.4) и скоростью потока 1,2 см³/мин. Перед началом анализа в течение 30 мин. хроматографическую систему промывают элюирующим раствором до установления стабильной нулевой линии.

Затем хроматографируют прозрачный раствор пробы, подготовленной по 9.1, и рабочий градуировочный раствор (5.7.2), инжектируя равные объемы в диапазоне от 5 до 20 мм³. Выходящий из колонки элюат анализируют УФ-детектором при длинах волн 227 и 250 нм, используя последовательное детектирование при настройках на две длины волны или одновременное двухволновое детектирование.

Примечание - Для проверки линейности градуировочного графика проводят точечную градуировку.

Количество метанола в стандартных растворах и испытуемом образце намного выше, чем в подвижной фазе, что в некоторых случаях может повлиять на форму и разделение пиков. В таких случаях проверяют форму и разделение пиков, сравнивая их с пиками, полученными при хроматографировании стандартного раствора (5.7.1), в котором метанол (5.1) замещен на мобильную фазу (5.4) в эквивалентном количестве.

В данных условиях ориентировочное время удерживания бензойной и сорбиновой кислот составляет 5,5 и 7 мин. соответственно. Если пики выходят за пределы градуировочного графика, образец разбавляют необходимым объемом 50% водного метанола и вводят в хроматограф от 5 до 20 мм³ полученного раствора для получения пиков нужной высоты.

Чтобы определить, элюируются ли в пробе какие-либо мешающие компоненты одновременно с сорбиновой кислотой, проверяют отношение УФ-сигналов при длине волны 250 и 227 нм.

В ходе анализа молока или сухого молока на хроматограмме после 8 мин. удерживания появляется третий пик. Этот пик соответствует природному продукту - гиппуровой кислоте. Пик гиппуровой кислоты может частично накладываться на сорбиновую кислоту. Поэтому разрешение сорбиновой и гиппуровой кислот на колонке должно быть больше 1.

Содержание сорбиновой кислоты w_s и/или бензойной кислоты w_b, выраженное в миллиграммах на килограмм, рассчитывают по формуле:

где H_ts - высота или площадь пика, в соответствующих единицах, полученные для испытуемого раствора (см. 9.2);

H_st - высота или площадь пика, в соответствующих единицах, полученные для рабочего стандартного раствора (см. 9.2);

m_s - масса, в микрограммах, введенного рабочего стандартного раствора (5.7.2);

m - масса, в граммах, испытуемого образца (см. 8.1 или 8.2);

V₁ - объем, в см³, экстракта, приготовленного в 9.1 (= 100 см³);

V₂ - объем, в мм³, введенного испытуемого раствора;

1000 - коэффициент пересчета миллилитров в микролитры.

Результаты испытания представляют с точностью до целого числа.

Значения, полученные в ходе межлабораторных испытаний, могут быть не применимы для иных, отличных от указанных, матриц и уровней содержания кислот.

Значения повторяемости и воспроизводимости были получены на основании результатов двух межлабораторных испытаний, проводимых в 1984 и 2004 годах (см. приложение A). Испытания проводились на образцах с уровнем содержания бензойной и сорбиновой кислот в пределах от 6 до 920 мг/кг.

Абсолютная разность между результатами двух параллельных испытаний, полученными с использованием одного и того же метода в одной и той же пробе в одной и той же лаборатории одним и тем же оператором, использующим то же самое оборудование, в короткий интервал времени, не должна превышать значения, рассчитанного по уравнению: , более чем в 5% случаев.

Абсолютная разность между результатами двух отдельных испытаний, полученными с использованием одного и того же метода в одной и той же пробе в различных лабораториях различными операторами, использующими различное оборудование, не должна превышать значения, рассчитанного по уравнению: , более чем в 5% случаев.

Протокол испытания должен содержать как минимум следующую информацию:

a) всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;

b) используемый метод отбора проб;

c) используемый метод испытания со ссылкой на этот стандарт;

d) все рабочие детали, не установленные в этом стандарте или рассматриваемые как факультативные, вместе с деталями всех нюансов, которые могли повлиять на результат(ы) испытания;

e) полученные результаты анализа и, если выполняется условие повторяемости, окончательный средний результат.

Значения повторяемости и воспроизводимости были получены на основании результатов двух международных межлабораторных испытаний, проводимых в 1984 [4] и 2004 [6] годах соответственно.

Результаты, полученные в ходе этих испытаний, были подвергнуты статистическому анализу в соответствии с [2] <*> и [3] <*>. Данные прецизионности приведены в таблице A.1.

--------------------------------

<**> В Российской Федерации действуют ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения", ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений", ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений" и ГОСТ Р ИСО 5725-4-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода".

Используя линейный регрессионный анализ, была получена следующая линейная регрессия x = b + ay с коэффициентом корреляции 0,9973486 для n = 7, s = 0,8249 и t_0,95 = 2,57 (см. рисунок A.1)

для сорбиновой кислоты и

для бензойной кислоты 

X - среднее значение (мг/кг)

Y - повторяемость, r (мг/кг)

Используя линейный регрессионный анализ, была получена следующая линейная регрессия, x = b + ay с коэффициентом корреляции 0,9989653, для n = 7, s = 2,1815 и t_0,95 = 2,57 (см. рисунок A.2)

для сорбиновой кислоты и

для бензойной кислоты .

X - среднее значение (мг/кг)

Y - воспроизводимость, R (мг/кг)

--------------------------------

<1> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 707-2010 "Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб".

<2> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений".