Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Автономной некоммерческой организацией "ПАРФЮМТЕСТ" (АНО "ПАРФЮМТЕСТ") на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 октября 2015 г. N 81-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 ноября 2015 г. N 1800-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 7358-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 7358:2002 "Масла бергамотовое, лимонное, горького померанца и лайма, полностью или частично очищенные от бергаптена. Определение содержания бергаптена методом жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД)" ["Oils of bergamot, lemon, citron and lime, fully and partially reduced in bergapten - Determination of bergapten content by high-pressure liquid chromatography (HPLC)", IDT].

Международный стандарт разработан Техническим комитетом по стандартизации ISO/TC 54 "Эфирные масла" Международной организации по стандартизации (ISO).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

7 Некоторые элементы настоящего стандарта могут являться объектом патентных прав

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1. Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с использованием метода "внутреннего стандарта" и метода "внешнего стандарта" для определения содержания бергаптена в бергамотовом эфирном масле [Citrus aurantium ssp. bergamia (Risso et Poit.) Wight et Arn. ex Engl.], лимонном эфирном масле [Citrus limon (L.) Burm. f.], эфирном масле горького померанца (Citrus bigaradia Risso) и эфирном масле лайма [Citrus aurantifolia (Chrisym.) Swingle and Citrus latifolia Tanaka], которые полностью или частично очищены от бергаптена.

Метод "внутреннего стандарта" применяют для эфирных масел с массовой долей бергаптена >= 0,001%.

Метод "внешнего стандарта" применяют для эфирных масел с массовой долей бергаптена от 0,0001% до 0,001%.

2. Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные документы. Для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного документа, для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного документа (включая его изменения).

ISO 356, Essential oils - Preparation of test samples (Масла эфирные. Подготовка образцов для испытаний)

ISO 8432:1987, Essential oils - Analysis by high performance liquid chromatography - General method (Масла эфирные. Анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Общий метод)

3. Сущность метода

Жидкостная хроматография основана на физико-химических процессах адсорбции, разделения, ионного обмена или эксклюзии. Метод дает возможность анализировать небольшое количество эфирного масла с использованием хроматографической колонки с подходящей насадкой, в подходящих условиях, с определением различных компонентов и количественным определением специфических соединений.

4. Реактивы

Необходимо использовать только реактивы аналитической степени чистоты.

Примечание - Особое внимание необходимо обратить на опасность, связанную с использованием хлороформа, как токсичного растворителя.

4.1 Контрольное вещество: бергаптен, известной чистоты большей или равной 95%.

4.2 Внутренний стандарт: кумарин, известной чистоты большей или равной 98%.

4.3 Растворители

4.3.1 Хлороформ, ч.д.а., содержащий менее 2% (по объему) этанола, для использования в подготовке пробы эфирного масла, содержащего бергаптен, и подготовке как внутреннего стандарта, так и подвижной фазы.

4.3.2 Гексан, чистый для хроматографии, для использования в подвижной фазе (см. 4.3.4).

4.3.3 Этилацетат, чистый для хроматографии, для использования в подвижной фазе (см. 4.3.4).

4.3.4 Подвижная фаза

Для подвижной фазы используют растворители качества, совместимого с системой обнаружения, и готовят их в количестве, достаточным для полного анализа. Смешивают, например, одни из следующих:

4.3.4.1 Гексан (см. 4.3.2) и этилацетат (см. 4.3.3) в отношении 80:20 по объему.

4.3.4.2 Гексан (см. 4.3.2) и хлороформ (см. 4.3.1) в отношении 85:15 по объему.

5. Оборудование

5.1 Система для ВЭЖХ, состоящая из следующего оборудования.

5.1.1 Жидкостный хроматограф.

5.1.2 Колонка, из нержавеющей стали, длиной от 150 до 250 мм, внутренним диаметром от 4 до 5 мм и заполненная неподвижной фазой, состоящей из гранулированного диоксида кремния, чистого для хроматографии, с размером гранул около 5 мкм.

5.1.2 <*> Система подачи растворителя, способная подавать подвижную фазу при постоянной или программируемой скорости потока.

--------------------------------

<*> Так в оригинале ISO 7358:2002.

5.1.3 Система дегазации растворителя (не обязательно).

5.1.4 УФ детектор со спектральным диапазоном длин волн от 254 до 313 нм.

5.1.5 Записывающее устройство и (не обязательно) интегратор, подходящие для данной системы ВЭЖХ.

5.2 Мерные колбы, вместимостью от 15 до 150 см³, в зависимости от предполагаемого содержания бергаптена в пробе.

6. Подготовка пробы для испытания

Подготовка пробы для испытания в соответствии с ISO 356.

При наличии небольшого осадка пробу слегка подогревают.

7. Проведение испытания

7.1 Условия проведения ВЭЖХ

Настраивают скорость потока подвижной фазы (см. 4.3.4) так, чтобы получить хорошее разделение пиков, соответствующих бергаптену и кумарину, от других компонентов эфирного масла, обнаруживаемых УФ детектором (см. 5.1.4). Скорость потока обычно составляет от 0,5 до 1 см³/мин.

Следуют процедуре, указанной в ISO 8432.

7.2 Определение

7.2.1 Метод внутреннего стандарта для эфирных масел с массовой долей бергаптена от 0,001%

7.2.1.1 Оптимизация условий проведения анализа ВЭЖХ

7.2.1.1.1 Разделение

Удостоверяются, что пик бергаптена полностью отделен от пиков других компонентов эфирного масла на полученных хроматограммах. Кроме того, проверяют, чтобы пик внутреннего стандарта, кумарина (см. 4.2), не маскировал и (или) частично не перекрывал пики других компонентов эфирного масла. Определяют время удерживания бергаптена и кумарина.

7.2.1.1.2 Количество внутреннего стандарта

Количество кумарина (внутреннего стандарта), добавленного в пробу, считают подходящим, когда площади пиков бергаптена (в масле) и кумарина приблизительно равны на хроматограммах. Для определения этого количества вводят в колонку ВЭЖХ (например, 10 мм³) раствор, содержащий данное количество (например, 10 мг) кумарина (см. 4.2), растворенного в хлороформе (см. 4.3.1, например, 10 см³). Затем вводят такой же объем раствора анализируемого эфирного масла, разведенного в хлороформе (см. 4.3.1). Регулируют массовые концентрации обоих растворов так, чтобы получить сопоставимые площади пиков.

7.2.1.2 Коэффициент чувствительности детектора K

Готовят градуировочный раствор. В мерной колбе (см. 5.2) подходящего объема взвешивают 20 мг кумарина (см. 4.2) с точностью до 0,1 мг. В такой же мерной колбе взвешивают 10 мг бергаптена (см. 4.1) приблизительно с точностью до 0,1 мг и растворяют оба компонента примерно в 20 см³ хлороформа (см. 4.3.1).

Вводят подходящее количество (см. 7.2.1.1) градуировочного раствора так, чтобы остаться внутри диапазона чувствительности детектора.

Измеряют площади пиков на хроматограмме. Типичная хроматограмма стандартных веществ представлена в приложении A.

Вычисляют коэффициент чувствительности детектора K по формуле (1):

где m_R - масса бергаптена (контрольное вещество) (см. 4.1), добавленная к раствору, мг;

m_IS - масса кумарина (внутренний стандарт) (см. 4.2), добавленная к раствору, мг;

A_R - площадь пика, соответствующая бергаптену (стандартное вещество) (см. 4.1), в единицах измерения интегратора;

A_IS - площадь пика, соответствующая кумарину (внутренний стандарт) (см. 4.2), в единицах измерения интегратора.

Примечание - В ISO 8432 данная формула эквивалентна следующей:

где m_R - масса бергаптена (контрольное вещество) (см. 4.1), добавленная к раствору, мг;

m_E - масса кумарина (внутренний стандарт) (см. 4.2), добавленная к раствору, мг;

A_R - площадь пика, соответствующая бергаптену (стандартное вещество) (см. 4.1), в единицах измерения интегратора;

A_E - площадь пика, соответствующая кумарину (внутренний стандарт) (см. 4.2), в единицах измерения интегратора.

7.2.1.3 Определение бергаптена

Готовят испытуемый раствор в мерной колбе (см. 5.2) подходящего объема (например, 15 см³). Взвешивают с точностью до 0,1 мг подходящее количество кумарина (m_IS) (приблизительно 10 мг), как определено в 7.2.1.2, и порцию пробы эфирного масла для испытания (m_S) так, чтобы получилась хроматограмма с сопоставимыми площадями пиков для бергаптена и кумарина.

Добавляют хлороформ (см. 4.3.1, приблизительно 8 см³) и аккуратно встряхивают, чтобы растворить кумарин.

Необходимо приготовить столько разведений испытуемого раствора, сколько необходимо для получения хроматограммы с сопоставимыми площадями пиков бергаптена и кумарина, поскольку содержание бергаптена в эфирных маслах неизвестно (полностью или частично очищены от бергаптена). Выбирают мерную колбу такой вместимости, чтобы поместились необходимое количество кумарина и хлороформа.

Используя те же условия проведения анализа ВЭЖХ, установленные в 7.2.1.1, вводят подходящее количество испытуемого раствора так, чтобы остаться внутри диапазона чувствительности детектора.

Измеряют площади пиков хроматограммы.

Измеряют и записывают площади пиков хроматограммы, соответствующих бергаптену (A_X) и кумарину (A_IS).

Типичная хроматограмма представлена в приложении A.

7.2.2 Метод внешнего стандарта для эфирных масел с массовой долей бергаптена от 0,0001% до 0,001%

Следуют процедуре для метода "внешнего стандарта", установленной в ISO 8432.

8. Вычисления

8.1 Метод "внутреннего стандарта" для эфирных масел с массовой долей бергаптена большим или равным 0,001%

Используя коэффициент чувствительности детектора K, определяемого в 7.2.1.2, вычисляют массовую доля бергаптена w_x, %, в эфирном масле по формуле (2):

где K - коэффициент чувствительности, вычисленный по формуле (1) (см. 7.2.1.2);

m_IS - масса анализируемой пробы кумарина, добавленного в качестве внутреннего стандарта (см. 7.2.1.3), мг;

m_s - масса анализируемой пробы эфирного масла для испытания (см. 7.2.1.3), мг;

A_x - площадь пика, соответствующая бергаптену в пробе для испытания (см. 7.2.1.3), в единицах измерения интегратора;

A_IS - площадь пика, соответствующая кумарину (см. 7.2.1.3), в единицах измерения интегратора.

Примечание - В пункте 10.1 ISO 8432:1987 массовую долю бергаптена c_x, %, в эфирном масле определяют по следующей формуле:

где A_x - площадь пика, соответствующая бергаптену в пробе для испытания, в единицах измерения интегратора (см. 7.2.1.3);

A_E - площадь пика, соответствующая кумарину, в единицах измерения интегратора (см. 7.2.1.3);

m_x - масса эфирного масла в пробе для испытания, мг (см. 7.2.1.3);

m_E - масса кумарина, добавленного в качестве внутреннего стандарта в пробу для испытания, мг (см. 7.2.1.3);

K - коэффициент чувствительности, вычисленный по формуле (1) (см. 7.2.1.2).

8.2 Метод внешнего стандарта для эфирных масел с массовой долей бергаптена от 0,0001% до 0,001%

Вычисляют количественное содержание бергаптена, установленное в ISO 8432.

9. Прецизионность

9.1 Повторяемость: эфирные масла с массовой долей бергаптена >= 0,001%

Для K и для выражения результатов (%) принимают среднее значение нескольких испытаний (по меньшей мере, трех), выполненных на одной и той же пробе. Значения (K или %), используемые для вычисления данного среднего значения, должны различаться не более чем на +/- 5%.

9.2 Повторяемость: эфирные масла с массовой долей бергаптена от 0,0001% до 0,001%

Принимают среднее значение нескольких испытаний (по меньшей мере, трех), выполненных на одной и той же пробе. Значения, используемые для вычисления данного среднего значения, не должны различаться более чем на +/- 20%.

10. Протокол испытания

Протокол испытания должен включать следующую информацию:

a) составные части системы ВЭЖХ;

b) ссылку на настоящий стандарт;

c) характеристики колонки (материал, размеры, насадка, неподвижная фаза);

d) характеристики детектора (не обязательно) и условия проведения анализа;

e) характеристики подвижной фазы (скорость потока и ее природа);

f) идентификацию пробы для испытания (введенное количество и конечное разбавление);

g) полученные результаты.

--------------------------------

<1> Spherisorb 5 - пример подходящей неподвижной фазы, доступный на рынке. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не указывает на предпочтение со стороны ISO в отношении названной продукции. Могут быть использованы аналогичные продукты, если можно показать, что будут получены равноценные результаты.