"ГОСТ ISO 20634-2018. Межгосударственный стандарт. Смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смеси для энтерального питания взрослых. Определение витамина B12 методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии" (введен в действие Приказом Росстандарта от 09.08.2018 N 478-ст)

Главная // Актуальные документы // ГОСТ (Государственный стандарт)

СПРАВКА

Источник публикации

М.: Стандартинформ, 2018

Примечание к документу

Текст данного документа приведен с учетом поправки, опубликованной в "ИУС", N 1, 2024.

Документ введен в действие с 01.09.2019.

Название документа

"ГОСТ ISO 20634-2018. Межгосударственный стандарт. Смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смеси для энтерального питания взрослых. Определение витамина B12 методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии"

(введен в действие Приказом Росстандарта от 09.08.2018 N 478-ст)

Содержание

ГОСТ ISO 20634-2018. Межгосударственный стандарт. Смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смеси для энтерального питания взрослых. Определение витамина B12 методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии

Предисловие

Сведения о стандарте

1 Область применения

2 Термины и определения

3 Сущность метода

4 Реактивы и материалы

5 Лабораторное оборудование

6 Процедура проведения испытания

7 Обработка результатов

Приложение A. Примеры хроматограмм

Приложение B. Данные по прецизионности метода

Приложение C. Типовая методика проверки пригодности патронов для твердофазной экстракции (ТФЭ)

Библиография

Введен в действие

Приказом Федерального

агентства по техническому

регулированию и метрологии

от 9 августа 2018 г. N 478-ст

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

СМЕСИ АДАПТИРОВАННЫЕ ДЛЯ ИСКУССТВЕННОГО ВСКАРМЛИВАНИЯ

ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА И СМЕСИ ДЛЯ ЭНТЕРАЛЬНОГО

ПИТАНИЯ ВЗРОСЛЫХ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА B₁₂ МЕТОДОМ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Infant formula and adult nutritionals.

Determination of vitamin B₁₂ by reversed phase high

performance liquid chromatography

(ISO 20634:2015, IDT)

ГОСТ ISO 20634-2018

МКС 67.050

Дата введения

1 сентября 2019 года

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (АО "ВНИИС") совместно с Федеральным государственным бюджетным учреждением науки Федеральным исследовательским центром питания, биотехнологии и безопасности пищи (ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии") на основе собственного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 мая 2018 г. N 109-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	ЗАО "Национальный орган по стандартизации и метрологии" Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Молдова	MD	Институт стандартизации Молдовы
Россия	RU	Росстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 августа 2018 г. N 478-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 20634-2018 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 сентября 2019 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 20634:2015 "Смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смеси для энтерального питания взрослых. Определение витамина B₁₂ методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии" ("Infant formula and adult nutritionals - Determination of vitamin B₁₂ by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC)", IDT)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод количественного определения витамина B₁₂ в адаптированных смесях для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смесях для энтерального питания для взрослых (порошках, готовых к употреблению жидких продуктах и жидких концентратах) методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1 витамин B₁₂: Цианкобаламин или другие корриноиды, содержащие кобальт, обладающие биологической активностью витамина B₁₂, такие как аквокобаламин, гидроксикобаламин, метилкобаламин и аденозилкобаламин, преобразуемые в цианкобаламин.

2.2 смесь для энтерального питания для взрослых (adult nutritional): Полноценный в питательном отношении специализированный пищевой продукт, изготовленный из молока, сои, риса, молочной сыворотки, гидролизата белка, крахмала и аминокислот в любом сочетании, содержащий или не содержащий интактный белок, употребляемый в жидком виде, который может являться единственным источником питания.

Примечание - Определение термина 2.2 <1>.

2.3 адаптированная смесь для искусственного вскармливания детей раннего возраста (infant formula): Заменитель грудного молока, специально изготовленный для того, чтобы полностью удовлетворять потребности в питании младенцев первых месяцев жизни до введения соответствующего дополнительного питания.

Примечание - Определение термина 2.3 <1>.

--------------------------------

<1> Определения терминов 2.2 и 2.3 взято из Codex Standard 72-1981.

3 Сущность метода

Цианкобаламин и другие корриноиды, содержащие кобальт, экстрагируют из пробы буферным раствором ацетата натрия (pH = 4,5 ед. pH), последние преобразуют в цианкобаламин с помощью цианида калия при 105 °C. Экстракт очищают и концентрируют на патронах для твердофазной экстракции с сорбентом - модифицированным C8 или C18 силикагелем, после чего анализируют методом эксклюзионной и обращенно-фазовой хроматографии. Количественное определение витамина B₁₂ проводят методом жидкостной хроматографии с детектированием в видимой области спектра при длине волны 550 нм.

4 Реактивы и материалы

Для проведения анализа при отсутствии особо оговоренных условий используют только реактивы гарантированной аналитической чистоты и дистиллированную или деминерализованную воду или аналогичную по чистоте воду.

4.1 Кислота уксусная ледяная.

4.2 Ацетонитрил для ВЭЖХ.

4.3 Дриерит (осушающий агент, представляющий собой безводный сульфат кальция размером частиц 8 меш).

4.4 Этанол денатурированный.

4.5 Кислота муравьиная массовой долей основного вещества не менее 88%.

4.6 Калий цианистый массовой долей основного вещества не менее 97%.

4.7 Рибофлавин массовой долей основного вещества от 98% до 102%.

4.8 Натрий уксуснокислый безводный или трехводный.

4.9 Фермент така-диастаза <1>.

--------------------------------

<1> Например, производства Accurate Chemical Co или аналогичная. Это пример подходящего изделия, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

4.10 Триэтиламин для ВЭЖХ.

4.11 Витамин B₁₂ (цианкобаламин), первичный стандартный образец сравнения <2>. Следует хранить в эксикаторе в условиях защиты от дневного света.

--------------------------------

<2> Например, USP Reference 1152009 массовой долей (приблизительно 10 мкг/мг). Это пример подходящего изделия, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

4.12 Приготовление растворов реактивов и стандартных растворов

4.12.1 Общие положения

Все растворы допускается готовить в большем или меньшем объеме при условии соблюдения правил надлежащей лабораторной практики. Растворы можно хранить в охлажденном виде или при комнатной температуре в плотно укупоренных емкостях из инертных материалов, если не оговорено другое.

4.12.2 Приготовление растворов реактивов

4.12.2.1 Подвижная фаза A для ВЭЖХ

Растворяют 4,0 см³ триэтиламина в 1 000 см³ воды. Доводят pH раствора до значения, лежащего в интервале от 5 до 7, добавлением приблизительно 1,25 см³ концентрированной муравьиной кислоты (см. 4.5). Срок годности - одна неделя при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.2 Подвижная фаза B для ВЭЖХ

Смешивают 4,0 см³ триэтиламина и 250 см³ ацетонитрила с 750 см³ воды. Доводят pH раствора до значения, лежащего в интервале от 5 до 7 ед. pH, добавлением приблизительно 1,25 см³ концентрированной муравьиной кислоты (см. 4.5). Срок годности - одна неделя при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.3 Подвижная фаза C для ВЭЖХ

Смешивают 4,0 см³ триэтиламина и 750 см³ ацетонитрила с 250 см³ воды. Доводят pH раствора до значения, лежащего в интервале от 5 до 7, добавлением приблизительно 1,25 см³ концентрированной муравьиной кислоты (см. 4.5). Срок годности - одна неделя при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.4 Подвижная фаза D для ВЭЖХ

Разбавляют 50 см³ ацетонитрила водой до объема 2 000 см³. Срок годности - одна неделя при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.5 Смесь ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 10%

Разбавляют 150 см³ ацетонитрила водой до объема 1 500 см³. Срок годности - одна неделя при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.6 Смесь ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 30% (элюент для твердофазной экстракции)

Разбавляют 30 см³ ацетонитрила водой до объема 100 см³. Срок годности - 1 мес при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.7 Смесь ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 50% (раствор для промывки и хранения колонки)

Разбавляют 500 см³ ацетонитрила водой до объема 1 000 см³. Срок годности - 6 мес при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.8 Смесь этанола с водой объемной долей этанола 25%

Разбавляют 50 см³ этанола водой до объема 200 см³. Срок годности - один год при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.9 Раствор цианида калия массовой концентрации

Растворяют 0,02 г цианида калия в ацетатном буферном растворе (см. 4.12.2.11) концентрации 0,25 моль/дм³ и доводят объем раствора этим буферным раствором до 5 см³. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

4.12.2.10 Раствор цианида калия массовой концентрации

Растворяют 0,25 г цианида калия в воде и доводят объем раствора до 25 см³. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

4.12.2.11 Буферный раствор ацетата натрия концентрации c = 0,25 моль/дм³

Растворяют 41,0 г безводного ацетата натрия или 68,0 г трехводного ацетата натрия приблизительно в 1800 см³ воды. Значение pH раствора доводят до 4,6 ед. pH концентрированной уксусной кислотой (около 40 см³). Разбавляют водой до 2000 см³. Срок годности раствора - 3 мес.

4.12.2.12 Раствор для проверки степени хроматографического разделения

Берут навеску около 0,005 г рибофлавина на бумаге для взвешивания. Навеску переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем содержимого колбы до метки смесью ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 10%. Раствор перемешивают до достижения растворения. Смешивают равные объемы полученного раствора и градуировочного раствора витамина B₁₂ самой высокой концентрации. Срок годности раствора - одна неделя.

4.12.2.13 Раствор така-диастазы массовой концентрации

Растворяют 0,6 г така-диастазы в 10 см³ воды. Раствор готовят в день использования.

4.12.3 Приготовление стандартных растворов

4.12.3.1 Общие положения

Все стандартные растворы готовят при свете люминесцентной лампы с применением светового экрана, задерживающего ультрафиолетовое излучение, и хранят при температуре от 2 °C до 8 °C в плотно укупоренных мерных колбах.

4.12.3.2 Основной стандартный раствор витамина B₁₂ массовой концентрации

Берут точную навеску стандартного образца витамина B₁₂ (см. 4.11) такой массы, чтобы концентрация основного стандартного раствора составила 10 000 мкг/дм³. Растворяют в смеси этанола с водой объемной долей этанола 25% (см. 4.12.2.8), объем раствора доводят до 100 см³ тем же растворителем. Срок годности раствора - 6 мес.

Необходимую массу навески стандартного образца витамина B₁₂ m_w, мг, вычисляют по формуле

(1)

где 10 000 - требуемая концентрация основного стандартного раствора, мкг/дм³;

0,1 - объем разбавления, дм³;

P - чистота стандартного образца витамина B₁₂ (см. 4.11) в микрограммах цианкобаламина на миллиграмм стандартного образца.

4.12.3.3 Стандартный раствор витамина B₁₂ промежуточной концентрации

Разбавляют 10 см³ основного стандартного раствора (см. 4.12.3.2) до 100 см³ водой. Срок годности раствора - одна неделя.

4.12.3.4 Градуировочные стандартные растворы витамина B₁₂ массовыми концентрациями от

до

В отдельных мерных колбах разбавляют 0,5 см³, 1 см³, 2 см³, 3 см³, 4 см³ и 5 см³ стандартного раствора промежуточной концентрации (см. 4.12.3.3) до 200 см³ смесью ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 10% (см. 4.12.2.5). Срок годности растворов - 1 мес.

5 Лабораторное оборудование

5.1 Система для ВЭЖХ, состоящая из градиентного насоса, крана переключения колонок, изократического насоса, спектрофотометрического детектора с вольфрамовой лампой накаливания, пригодного для детектирования при 550 нм и автосамплера, пригодного для ввода проб объемом от 900 мм³ до 2 000 мм³.

5.2 Колонка для ВЭЖХ аналитическая эксклюзионная со следующими характеристиками:

- размером частиц сорбента 4 мкм, длиной 250 мм, внутренним диаметром 9,4 мм <1>;

- размером частиц сорбента 5 мкм, длиной 300 мм, внутренним диаметром 8 мм <2>.

--------------------------------

<1> Например, Zorbax GF-250, каталожный номер 884973-901. Это пример подходящего продукта, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

<2> Например,

, каталожный номер F6989000 или аналогичная. Это пример подходящего продукта, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

5.3 Колонка для ВЭЖХ аналитическая обращенно-фазовая со следующими характеристиками:

- заполненная сорбентом типа C18, размером частиц сорбента 3 мкм, длиной 100 мм, внутренним диаметром 4,6 мм <3> с предколонкой размером частиц сорбента 3 мкм, длиной 10 мм, внутренним диаметром 4,6 мм <4>;

- заполненная фенилгексильным сорбентом размером частиц 3 мкм и размером пор 120 ангстрем, длиной 100 мм и внутренним диаметром 4,6 мм <5>, с подходящей предколонкой, или аналогичная обращенно-фазовая колонка, совместимая с подвижной фазой, состоящей на 100% из воды.

--------------------------------

<3> Например, Thermo Scientific Aquasil^TM, каталожный номер 77503-104630. Это пример подходящего продукта, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

<4> Например, Thermo Scientific Aquasil^TM, каталожный номер 77503-014001. Это пример подходящего продукта, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

<5> Например, Epic Phenyl Hexyl, ES Industries 125191-EPHX. Это пример подходящего продукта, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

5.4 Термостат суховоздушный, пригодный для поддержания температур (95 +/- 5) °C и (105 +/- 5) °C.

5.5 pH-метр в комплекте с калибровочными буферными растворами.

5.6 Весы аналитические точностью не менее 0,00001 г.

5.7 Стаканы лабораторные стеклянные различной вместимости.

5.8 Дозирующая насадка на бутыль, обеспечивающая объем дозирования 30 см³ или аналогичная.

5.9 Цилиндры градуированные стеклянные различной вместимости.

5.10 Эксикатор.

5.11 Колбы конические вместимостью 125 см³ или аналогичная стеклянная посуда.

5.12 Бумага фильтровальная <6> или аналогичная.

--------------------------------

<6> Например, Whatman 2V. Это пример подходящего изделия, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

5.13 Воронки пластиковые, пригодные для использования с фильтровальной бумагой.

5.14 Перчатки одноразовые.

5.15 Дозатор пипеточный переменного объема дозирования от 100 мм³ до 1 000 мм³.

5.16 Лабораторные световые экраны, желтые или бесцветные экраны с границей пропускания не ниже 385 нм.

5.17 Патроны для твердофазной экстракции (ТФЭ) с сорбентом - силикагелем, модифицированным группами C8, массой сорбента 900 мг <1>, или модифицированным группами C18, массой сорбента 900 мг <2> или аналогичные. Типовая методика проверки пригодности патронов для ТФЭ приведена в приложении C.

--------------------------------

<1> Например, Alltech/Grace Davidson, каталожный номер 20966. Это пример подходящего изделия, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

<2> Например, Alltech/Grace Davidson, каталожный номер 20942. Это пример подходящего изделия, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

5.18 Шприцы одноразовые различной вместимости.

5.19 Насадка на шприц фильтрующая, с нейлоновым фильтром диаметром пор 0,45 мкм.

5.20 Установка вакуумная для твердофазной экстракции (манифолд) на 24 гнезда с запорными кранами или аналогичная установка.

5.21 Пипетки с одной отметкой различной вместимости.

5.22 Колбы мерные различной вместимости.

6 Процедура проведения испытания

6.1 Общие положения

Подготовку всех проб проводят при свете люминесцентной лампы с применением светового экрана, задерживающего ультрафиолетовое излучение. Анализ приготовленных растворов проб можно провести не позднее чем через 14 дней после их приготовления при хранении растворов проб при температуре от 2 °C до 8 °C в плотно укупоренных мерных колбах. Все пробы продуктов должны быть однородными и представительными, насколько это возможно. Этого достигают путем тщательного перемешивания или взбалтывания продукта перед отбором пробы.

6.2 Приготовление растворов проб для анализа

6.2.1 Общие положения

При испытании продуктов, содержащих крахмал, добавляют 1 см³ раствора така-диастазы (см. 4.12.2.13). Дожидаются прохождения реакции така-диастазы с пробой в течение 30 мин прежде, чем перейти к этапу экстракции.

6.2.1.1 Жидкие пробы

При испытании жидких продуктов, готовых к употреблению, лабораторную пробу тщательно перемешивают для обеспечения гомогенности и берут точную навеску смеси для энтерального питания для взрослых массой около 20,0 г или адаптированной смеси для искусственного вскармливания детей раннего возраста массой около 25,0 г, которую помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³. Далее переходят к этапу экстракции.

6.2.1.2 Порошкообразные пробы

Если степень гомогенности порошкообразной пробы неизвестна, исходят из предположения, что проба не гомогенна, и все операции с ней проводят, как с пробами сухих порошкообразных смесей (см. 6.2.1.3).

6.2.1.3 Пробы сухих порошкообразных смесей

При испытании проб негомогенных сухих порошкообразных смесей берут точную навеску массой около 25,0 г. Добавляют 200,0 г воды, предварительно нагретой до 40 °C, и перемешивают до получения гомогенной суспензии. При необходимости используют гомогенизатор. Из полученной суспензии берут точную навеску смеси для энтерального питания для взрослых массой около 20,0 г или адаптированной смеси для искусственного вскармливания детей раннего возраста массой около 25,0 г, которую помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³.

6.2.1.4 Пробы влажных порошкообразных смесей

При испытании проб влажных порошкообразных смесей точную навеску пробы массой около 3,0 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³. Добавляют 25 см³ воды и перемешивают до полного растворения порошка.

6.2.1.5 Смеси, предназначенные для элементного питания

При испытании продуктов, содержащих свободные аминокислоты и не содержащих интактный белок, добавляют 0,5 г казеината кальция или обезжиренного сухого молока к навеске пробы гомогенной влажной порошкообразной смеси массой 3,0 г, разбавленной 25 см³ воды, или к навеске негомогенной жидкой пробы или восстановленной сухой порошкообразной смеси массой от 20 до 25 г. Тщательно перемешивают для растворения белка, после чего сразу же добавляют 30 см³ буферного раствора ацетата натрия (см. 4.12.2.11) и 1 см³ раствора цианида калия массовой концентрации 10 г/дм³. Разбавляют до требуемого объема водой, фильтруют, фильтрат подвергают очистке и концентрированию до 60 см³ на предварительно кондиционированном патроне C8 или C18 массой сорбента 900 мг. Нагрев пробы в термостате при 105 °C не проводят.

6.2.2 Экстракция

К каждому раствору пробы для анализа добавляют 30 см³ буферного раствора ацетата натрия (см. 4.12.2.11) и взбалтывают до полного перемешивания. В вытяжном шкафу к раствору каждой пробы добавляют 1 см³ свежеприготовленного раствора цианида калия массовой концентрации 10 г/дм³ (см. 4.12.2.10) и взбалтывают до перемешивания. Растворы проб выдерживают в термостате при 105 °C в течение не менее 60 мин, но не более 120 мин. Следует принимать во внимание, что температура в термостате понизится при открывании дверцы. Отсчет времени начинают с момента повторного достижения температуры в термостате 105 °C.

Вынимают растворы проб из термостата и сразу же охлаждают на бане со льдом. Разбавляют растворы проб до заданного объема водой и тщательно перемешивают. Растворы проб фильтруют через фильтровальную бумагу (см. 5.12) в коническую колбу вместимостью 125 см³ или аналогичную стеклянную емкость. При необходимости допускается заменять фильтр, если он засоряется. Если приготовленные растворы проб непрозрачны и содержат нерастворимые частицы очень малого размера, их центрифугируют и переносят надосадочную жидкость в воронки с уложенной в них фильтровальной бумагой. Растворы проб, в которые был добавлен казеинат кальция, нагревать не допускается (см. 6.2.1.5).

6.2.3 Концентрирование растворов проб

Для очистки и концентрирования раствора пробы поверх запорного крана вакуумного манифолда помещают патрон для ТФЭ массой сорбента 900 мг (см. 5.17) и в верхнее отверстие патрона устанавливают цилиндр одноразового шприца вместимостью 30 см³. Каждый патрон кондиционируют не менее 20 см³ ацетонитрила (пропускание под действием силы тяжести), после чего промывают не менее 20 см³ воды. С помощью пипеток с одной отметкой в патроны вносят фильтраты растворов проб, руководствуясь указаниями в таблице 1. Если концентрация витамина B₁₂ неизвестна, руководствуются указаниями для готовых к употреблению продуктов, содержащих от 1 мкг/дм³ до 10 мкг/дм³ витамина B₁₂. При необходимости применяют вакуум так, чтобы обеспечивалась постоянная скорость протекания растворов проб через патроны. Скорость протекания растворов проб через патроны не должна превышать 120 капель в минуту. Элюат отбрасывают.

Таблица 1

Указания по внесению фильтратов растворов проб

в патроны для ТФЭ

Витамин B₁₂ в продуктах, готовых к употреблению, мкг/дм³	Объем фильтрата, внесенный в патрон для ТФЭ, см³	Конечный объем разбавления, см³
< 1	80	5
1 - 10	70 - 80	10
11 - 20	50 - 60	10
21 - 50	20 - 40	10
Примечание - Не следует вносить более 60 см³ растворов проб смесей для энтерального питания для взрослых на патроны Alltech C8 или C18.

После протекания через патрон всего фильтрата раствора пробы каждый патрон промывают 5 см³ воды, элюат отбрасывают. Высушивают каждый патрон потоком воздуха путем приложения вакуума до полного прекращения вытекания элюата. Закрывают все запорные краны.

Руководствуясь указаниями в таблице 1, под каждый патрон помещают мерную колбу вместимостью 5 см³ или 10 см³. В каждый патрон вносят 4,4 см³ смеси ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 30% (см. 4.12.2.6). Открывают все запорные краны и элюируют витамин B₁₂ с применением вакуума в мерные колбы. Элюент должен протекать через патроны со скоростью не более 120 капель в минуту.

При разбавлении на конечной стадии растворы проб, собранные в мерные колбы вместимостью 10 см³, разбавляют до метки водой.

В случае растворов проб, собранных в мерные колбы вместимостью 5 см³, в вытяжном шкафу в каждую колбу добавляют по 0,1 см³ свежеприготовленного раствора цианида калия концентрации 4 г/дм³ (см. 4.12.2.9). Подготовленные таким образом растворы проб помещают в термостат, нагретый до температуры 95 °C, не менее чем на 1,5 ч, но не более чем на 4 ч. Далее вынимают растворы проб из термостата и охлаждают до комнатной температуры. Объем содержимого в колбах доводят водой до метки.

Фильтруют аликвоты каждого стандартного раствора и приготовленного раствора пробы через фильтрующую насадку на шприц (см. 5.19) в виалу автосамплера.

6.3 Хроматографический анализ

6.3.1 Устройство и конфигурация хроматографической системы

Устройство и конфигурация системы для ВЭЖХ приведены на рисунке 1.

1 - изократический насос; 2 - автосамплер;

3 - аналитическая эксклюзионная колонка;

4 - аналитическая колонка C18; 5 - градиентный насос;

6 - спектрофотометрический детектор;

7 - емкость для сбора элюата

Рисунок 1 - Устройство и конфигурация системы для ВЭЖХ

6.3.2 Параметры работы хроматографической системы:

- продолжительность одного анализа: от 30 до 35 мин;

- объем инжекции: от 0,9 до 2,0 см³;

- конфигурация системы: см. таблицу 2;

- параметры работы изократического насоса:

- подвижная фаза D (см. 4.12.2.4);

- подбирают такую скорость подачи подвижной фазы, чтобы витамин B12

элюировался с эксклюзионной колонки между 10,5 мин и 14,5 мин. Типичные

значения скорости подачи подвижной фазы составляют от 1,1 до

Таблица 2

Конфигурация системы для ВЭЖХ

Время, мин	Конфигурация крана-переключателя потока (см. рисунок 1)
0 - 10,5	1
10,5 - 14,5	2
14,5 - 30,0 (или 35,0)	1

Для определения подходящей скорости подачи подвижной фазы эксклюзионную колонку присоединяют непосредственно к спектрофотометрическому детектору и инжектируют стандартный раствор высокой концентрации. Подбирают такую скорость подачи подвижной фазы, чтобы витамин B₁₂ элюировался с эксклюзионной колонки между 10,5 мин и 14,5 мин;

- параметры работы градиентного насоса:

- подвижная фаза A (см. 4.12.2.1), B (см. 4.12.2.2) и C (см. 4.12.2.3);

- градиентная программа, обеспечивающая элюирование витамина B12

в промежуток между 24 мин и 30 мин, приведена в таблице 3;

- скорость подачи подвижной фазы

;

- параметры работы детектора: длина волны детектирования 550 нм и

ширина полосы светопропускания 10 нм.

Таблица 3

Градиентная программа для обращенно-фазовой колонки

(см. 5.3)

Время, мин	Объемная доля подвижной фазы A, %	Объемная доля подвижной фазы B, %	Объемная доля подвижной фазы C, %
0	90	10	0
14,5	90	10	0
14,6	40 - 60 <a>	60 - 40 <a>	0
27,0 - 30,0	40 - 60 <a>	60 - 40 <a>	0
27,1 - 30,1	0	10	90
29,9 - 33,0	0	10	90
<a> Применительно к каждой колонке следует устанавливать подходящие условия градиентного элюирования так, чтобы обеспечивалось достаточное разделение витамина B₁₂ и рибофлавина в промежуток приблизительно между 24 мин и 30 мин. Для определения подходящих условий градиентного элюирования применительно к новой колонке устанавливают соотношение подвижных фаз в моменты времени 14,6 мин и от 27,0 мин до 30,0 мин на середине диапазона, указанного в таблице. Инжектируют раствор для проверки степени хроматографического разделения (см. 4.12.2.12) и рассчитывают степень хроматографического разделения (R) пиков витамина B₁₂ и рибофлавина. Подбирают состав подвижной фазы в моменты времени 14,6 мин и от 27,0 мин до 30,0 мин для достижения R > 1,5. После элюирования витамина B₁₂ с колонки C18 или фенильной колонки, колонку промывают подвижной фазой, состоящей на 90% из подвижной фазы C, в течение не менее 2,8 мин.

После уравновешивания системы проводят анализ градуировочных стандартных растворов и серии растворов проб. После анализа последнего раствора пробы анализируют как минимум один градуировочный стандартный раствор для проверки стабильности системы.

Образцы хроматограмм приведены в приложении A.

7 Обработка результатов

7.1 Общие положения

Содержание витамина B₁₂ в пробах рассчитывают путем соотнесения площади пика на хроматограмме раствора пробы известной массы навески с площадями пиков на хроматограммах стандартных растворов известной концентрации.

Просматривают все хроматограммы градуировочных растворов и растворов проб и контролируют, чтобы пик витамина B₁₂ был разделен со всеми остальными пиками на хроматограммах.

Площади пиков измеряются системой обработки данных. Перед расчетом содержания витамина B₁₂ в пробах сопоставляют площади пиков витамина B₁₂ на хроматограммах стандартных растворов с площадями пиков витамина B₁₂ на хроматограммах растворов проб и контролируют, чтобы площади пиков на хроматограммах растворов проб находились в границах диапазона площадей пиков на хроматограммах стандартных растворов.

7.2 Расчет концентрации стандартных растворов

Массовую концентрацию витамина B₁₂

, мкг/дм³, в градуировочных стандартных растворах (см. 4.12.3.4) вычисляют по формуле

(2)

где S_w - масса навески стандартного образца витамина B₁₂, мг;

P - чистота стандартного образца витамина B₁₂ (см. 4.11) в микрограммах цианкобаламина (витамина B₁₂) на миллиграмм стандартного образца;

A - использованная аликвота стандартного раствора витамина B₁₂ промежуточной концентрации (см. 4.12.3.3), см³ (здесь: 0,5 см³, 1,0 см³, 2,0 см³, 3,0 см³, 4,0 см³ или 5,0 см³);

200 - объем приготовленного градуировочного стандартного раствора, см³.

7.3 Построение градуировочного графика

Для каждой концентрации градуировочных растворов определяют среднее арифметическое значение из площадей пиков аналита, полученных при анализе соответствующего градуировочного раствора до и после анализа серии растворов проб. Градуировочный график строят с помощью линейного регрессионного анализа методом наименьших квадратов в системе координат "концентрация градуировочного раствора - площадь пика аналита".

7.4 Расчет содержания витамина B₁₂ в пробах

По градуировочному графику, построенному по 7.3, определяют массовую концентрацию витамина B₁₂ в каждом анализированном растворе пробы.

Массовую долю витамина B₁₂ в каждой пробе w_p, мг/100 г, вычисляют по формуле

(3)

где

- массовая концентрация витамина B₁₂ в растворе пробы для анализа, определенная по градуировочному графику, мкг/дм³;

V₁ - объем первого разбавления, см³ (здесь V₁ = 100 см³);

m_s - масса навески пробы, г;

V₂ - объем второго (окончательного) разбавления, см³;

V_f - объем фильтрата, внесенный в патрон для ТФЭ, см³;

m_pr - общая масса пробы, полученной после восстановления порошкообразной пробы, г (если применимо для данного случая);

m_rp - масса порошкообразной пробы, взятая для восстановления, г (если применимо для данного случая).

Примечание - m_pr и m_rp равны 1 для жидких проб и проб, испытываемых без восстановления.

Приложение A

(справочное)

ПРИМЕРЫ ХРОМАТОГРАММ

Рисунок A.1 - Типичная хроматограмма стандартного раствора

Рисунок A.2 - Типичная хроматограмма раствора пробы

Приложение B

(справочное)

ДАННЫЕ ПО ПРЕЦИЗИОННОСТИ МЕТОДА

Данные, приведенные в таблице B.1, опубликованы в 2015 г. [1] и получены в результате межлабораторных испытаний, проведенных в соответствии с ISO 5725-2 [2] и Согласованным Протоколом по проведению межлабораторных испытаний для оценки характеристик прецизионности методов анализа [3]. В основе процедуры проведения испытаний лежали требования, указанные в библиографической ссылке [4].

Дополнительная информация о валидации метода может быть получена по ссылке http://standards.iso.org/iso/20634.

Таблица B.1

Данные по прецизионности метода определения витамина B₁₂

Образец	NIST SRM 1849 <a>	1 <a>	2 <b>	3 <c>	4 <d>	5 <e>	6 <f>	7 <g>	8 <h>	9 <i>	10 <j>	11 <k>
Год проведения межлабораторных испытаний	2014	2014	2014	2014	2014	2014	2014	2014	2014	2014	2014	2014
Число лабораторий	11	9	10	11	10	10	10	10	11	10	9	10
Число лабораторий, не отвечающих требованиям	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Число лабораторий, оставшихся после исключения выбросов	10	9	10	11	9	10	10	9	10	9	8	10
Число выбросов (лабораторий)	1	0	0	0	1	0	0	1	1	1	1	0
Число принятых результатов	20	18	20	22	18	20	20	14	20	20	16	20
Среднее значение , мкг/100 г	43,7 <l>	0,272	0,300	0,373	0,543	0,250	0,636	1,48	0,428	0,227	0,967	1,08
Стандартное отклонение повторяемости s_r, мкг/100 г	3,01 <l>	0,0257	0,0270	0,0200	0,0169	0,0244	0,0348	0,122	0,0208	0,0111	0,0289	0,0730
Коэффициент вариации повторяемости C_V_,_r, %	6,90	9,46	8,99	5,35	3,11	9,77	5,47	8,23	4,85	4,90	2,98	6,74
Предел повторяемости r (r = 2,8s_r), мкг/100 г	8,43 <l>	0,0720	0,0756	0,0560	0,0473	0,0683	0,0974	0,342	0,0582	0,0311	0,0809	0,204
Стандартное отклонение воспроизводимости s_R, мкг/100 г	3,86 <l>	0,0427	0,0416	0,0694	0,0603	0,0487	0,0587	0,171	0,0305	0,0202	0,0342	0,190
Коэффициент вариации воспроизводимости C_V_,_R, %	8,84	15,7	13,8	18,6	11,1	19,5	9,23	11,5	7,13	8,90	3,54	17,5
Предел воспроизводимости R (R = 2,8s_R), мкг/100 г	10,8 <l>	0,120	0,116	0,194	0,169	0,136	0,164	0,479	0,0854	0,0566	0,0958	0,532
Индекс Горвица HorRat в соответствии с библиографической ссылкой [5]	0,34	0,40	0,36	0,50	0,32	0,50	0,27	0,38	0,20	0,22	0,11	0,55
<a> Готовая к употреблению адаптированная смесь для искусственного вскармливания детей раннего возраста на молочной основе. <b> Порошкообразная смесь для энтерального питания для взрослых на молочной основе. <c> Порошкообразная адаптированная смесь для искусственного вскармливания детей раннего возраста на молочной основе, частично гидролизованная. <d> Порошкообразная смесь для элементного питания для детей раннего возраста. <e> Порошкообразная адаптированная смесь для искусственного вскармливания детей раннего возраста на соевой основе, частично гидролизованная. <f> Порошкообразная смесь для энтерального питания для взрослых с низким содержанием жира. <g> Готовая к употреблению смесь для энтерального питания для взрослых с высоким содержанием жира (единичное определение в четырех лабораториях из-за неправильной маркировки банок с продуктом). <h> Порошкообразная адаптированная смесь для искусственного вскармливания детей раннего возраста на соевой основе. <i> Порошкообразная адаптированная смесь для искусственного вскармливания детей раннего возраста на молочной основе. <j> Порошкообразная смесь для детского питания. <k> Готовая к употреблению высокобелковая порошкообразная смесь для энтерального питания для взрослых. <l> Результаты приведены в мкг/кг для продукта в порошкообразной форме.

Приложение C

(справочное)

ТИПОВАЯ МЕТОДИКА

ПРОВЕРКИ ПРИГОДНОСТИ ПАТРОНОВ ДЛЯ ТВЕРДОФАЗНОЙ

ЭКСТРАКЦИИ (ТФЭ)

Для установления пригодности патронов для ТФЭ или для подтверждения пригодности новой партии патронов, может использоваться следующая методика.

Готовят водный раствор витамина B₁₂ массовой концентрации 160 мкг/дм³.

Готовят три раствора пробы для анализа из одной представительной лабораторной пробы любого продукта с самым высоким содержанием белка из всех продуктов, которые предполагается анализировать по этой методике, при этом проводят экстракцию по методике, описанной в 6.2.1 и 6.2.2.

Объединяют все фильтраты растворов проб. Добавляют 1 см³ водного раствора витамина B₁₂ массовой концентрации 160 мкг/дм³ к порции фильтрата раствора пробы объемом 80 см³ или 100 см³ (проба с добавкой аналита) и 1 см³ воды к другой порции фильтрата раствора пробы объемом 80 см³ или 100 см³ (проба без добавки аналита).

Продолжают подготовку растворов проб для анализа с добавкой и без добавки аналита, при этом проводят концентрирование, и конечное разбавление проводят по методике, описанной в 6.2.3.

Проводят хроматографический анализ обоих растворов проб. Рассчитывают содержание витамина B₁₂ в пробах с добавкой и без добавки аналита и полноту обнаружения добавки.

Патроны считаются пригодными для применения, если полнота обнаружения добавки составляет не менее 90%.

БИБЛИОГРАФИЯ

[1]	2011.10, Determination of Vitamin B₁₂ in Infant, Adult, and Pediatric Formulas by HPLC-UV and Column Switching: Collaborative Study
[2]	ISO 5725-2:1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method <1>
[3]	AOAC International. AOAC Official Methods Program, Associate Referee's Manual on development, Study, Review, and Approval Process. Part IV AOAC Guidelines for Collaborative Studies, 1995, pp. 23 - 51
[4]	AOAC SMPR 2011.005, Standard Method Performance Requirements for Vitamin B₁₂ in infant formula and Adult/Pediatric Nutritional formula
[5]	Thompson M. Recent Trends in Inter-Laboratory Precision at ppb and sub-ppb Concentrations in Relation to Fitness for Purpose Criteria in Proficiency Testing. Analyst (Lond.). 2000, 125 pp. 385 - 386

--------------------------------

<1> Официальный перевод этого стандарта находится в Федеральном информационном фонде стандартов.

УДК 613.22:664:543.544.5.068.7:006.354

МКС 67.050

Ключевые слова: смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста, смеси для энтерального питания для взрослых, определение витамина B₁₂, цианкобаламин, метод высокоэффективной жидкостной хроматографии