Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным учреждением науки "Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи" (ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии") на основе собственного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 мая 2018 г. N 109-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 августа 2018 г. N 514-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 20633-2018 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 сентября 2019 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 20633:2015 "Смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смеси для энтерального питания взрослых. Определение содержания витамина E и витамина A с помощью нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии" ("Infant formula and adult nutritionals - Determination of vitamin E and vitamin A by normal phase high performance liquid chromatography", IDT)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Настоящий стандарт устанавливает метод одновременного количественного определения витамина E ( и ацетата) и витамина A (13-цис- и полного транс-изомера ретинола пальмитата и ретинола ацетата) в адаптированных смесях для искусственного вскармливания детей раннего возраста и в смесях для энтерального питания взрослых (порошкообразные смеси, готовые к употреблению жидкости и жидкие концентраты).

Ретинол не используется для обогащения пищевых продуктов, и поэтому стандарт не распространяется на его определение. Массовая доля ретинола, естественно присутствующего в продуктах, незначительна.

Настоящий стандарт не распространяется на определение стереоизомеров витамина и ацетата по отдельности.

2.1 смеси для энтерального питания взрослых (adult nutritional): Полноценный в питательном отношении специализированный пищевой продукт, изготовленный из молока, сои, риса, молочной сыворотки, гидролизата белка, крахмала и аминокислот в любом сочетании, содержащий или не содержащий интактный белок, употребляемый в жидком виде; может являться единственным источником питания.

2.2 смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста (infant formula): Заменитель грудного молока <*>, специально изготовленный для удовлетворения естественной потребности в питании младенцев в течение первых месяцев жизни до введения прикорма.

Примечание - Определение термина 2.2 <**>.

--------------------------------

<*> Термин в соответствии с ТР ТС 021/2011.

<**> Определение термина 2.2 взято из Codex Standard 72-1981.

Для гидролиза гидрофильного внешнего слоя жировых мицелл в воде, присутствующих в анализируемой пробе образца, изготовленного на основе молока или сои, используют протеолитический фермент папаин. Затем гидрофобные компоненты мицелл количественно извлекают однократной экстракцией изооктаном. Экстракт анализируют методом нормально-фазовой ВЭЖХ, используя аналитическую колонку и градиентное элюирование. Количественное определение и ацетата проводят с флуоресцентным детектированием при длине волны возбуждения 280 нм и длине волны эмиссии 310 нм. Ретинола пальмитат (цис- и транс-) и ретинола ацетат (цис- и транс-) количественно определяют с использованием УФ-детектирования при 325 нм.

Для проведения анализа при отсутствии особо оговоренных условий используют только реактивы гарантированной аналитической чистоты и дистиллированную или деминерализованную воду или аналогичную по чистоте воду.

4.1 Метил-трет-бутиловый эфир (МТБЭ) для ВЭЖХ.

4.2 n-Гексан для ВЭЖХ.

4.3 Этанол для ВЭЖХ.

4.4 Метанол для ВЭЖХ.

4.5 Изооктан (2,2,4-триметилпентан) для ВЭЖХ.

4.6 Фермент папаин [полученный из папайи (Carica papaya)], >= 3 ед./мг <*> или эквивалентный.

--------------------------------

<*> Например, фирмы Sigma 76220. Представлен пример доступной в коммерческой сети продукции. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламной поддержкой данной продукции. Допускается использование аналогичной продукции, обеспечивающей достоверные результаты.

4.7 Гидрохинон <**>.

--------------------------------

<**> Например, фирмы Sigma H9003. Представлен пример доступной в коммерческой сети продукции. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламной поддержкой данной продукции. Допускается использование аналогичной продукции, обеспечивающей достоверные результаты.

4.8 Ледяная уксусная кислота, аналитически чистая.

4.9 Ацетат натрия, безводный.

Разводят 100 см³ 36%-ного раствора соляной кислоты до 200 см³ водой.

4.11 Раствор папаина массовой концентрации 

Растворяют 100 мг гидрохинона и 4 г безводного ацетата натрия в объеме около 80 см³ воды в мерной колбе вместимостью 100 см³ (см. 5.11). pH раствора доводят до 5,0 добавлением разбавленного раствора соляной кислоты (см. 4.10). Добавляют 2 г папаина и объем доводят до метки водой. Раствор готовят в день использования.

20 см³ ледяной уксусной кислоты добавляют к 1 дм³ метанола и перемешивают. Раствор готовят в день использования.

н-Гексан фильтруют и дегазируют в течение 15 мин с помощью ультразвуковой бани.

Смешивают 750 см³ н-гексана и 250 см³ метил-трет-бутилового эфира. Затем добавляют 3 см³ метанола, фильтруют и дегазируют в течение 15 мин с помощью ультразвуковой бани.

4.15.1 Ретинола пальмитат, первичный стандартный образец сравнения, содержащий антиоксидант (CAS 78-81-2).

4.15.2 Ретинола ацетат, первичный стандартный образец сравнения (CAS 127-47-9).

4.15.3 ацетат, первичный стандартный образец сравнения (CAS 7695-91-2).

4.15.4 , первичный стандартный образец сравнения (CAS 10191-41-0).

Взвешивают около 70 мг ретинола пальмитата (см. 4.15.1) с точностью до 0,01 мг в мерную колбу вместимостью 50 см³ (см. 5.11), растворяют в изооктане и доводят до метки изооктаном (см. 4.5).

Взвешивают около 35 мг ретинола ацетата (см. 4.15.2) с точностью до 0,01 мг в мерную колбу вместимостью 50 см³ (см. 5.11), растворяют в этаноле и доводят до метки этанолом (см. 4.3).

Взвешивают около 180 мг ацетата (см. 4.15.3) с точностью до 0,01 мг в мерную колбу вместимостью 50 см³ (см. 5.11), растворяют в изооктане и доводят до метки изооктаном (см. 4.5).

4.16.4 Основной стандартный раствор 

Взвешивают около 100 мг (см. 4.15.4) с точностью до 0,01 мг в мерную колбу вместимостью 50 см³ (см. 5.11), растворяют в изооктане и доводят до метки изооктаном (см. 4.5).

Примечание - Срок хранения приготовленных растворов - семь дней при температуре от 4 до 8 °C.

4 см³ основного стандартного раствора ретинола пальмитата (см. 4.16.1), 4 см³ основного стандартного раствора ретинола ацетата (см. 4.16.2), 7 см³ основного стандартного раствора ацетата (см. 4.16.3) и 20 см³ основного стандартного раствора (см. 4.16.4) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 50 см³ (см. 5.11) и доводят до метки изооктаном. Раствор готовят в день использования.

8 см³ стандартного раствора N 1 (см. 4.16.5) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см³ (см. 5.11) и доводят до метки изооктаном. Раствор готовят в день использования.

В мерные колбы вместимостью 50 см³ (см. 5.11) переносят пипеткой 0,5; 2,0; 4,0; 8,0; 16,0 и 32,0 см³ стандартного раствора смеси витаминов N 2 (см. 4.16.6) и доводят до метки изооктаном. Эти растворы используют для построения градуировочного графика по нескольким точкам. Раствор готовят в день использования.

Примечание - Для текущего контроля градуировочного графика и в зависимости от диапазона концентрации определяемых витаминов в исследуемых образцах можно использовать три или четыре градуировочных раствора, минимальная и максимальная массовая концентрация витаминов которых находятся внутри диапазона концентраций 6 точечного градуировочного графика.

1 см³ стандартного раствора ретинола пальмитата (см. 4.16.1) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см³ (см. 5.11) и доводят до метки этанолом. Измеряют оптическую плотность раствора в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при длине волны 325 нм относительно этанола. Измерение повторяют два раза, каждый раз заполняя кювету раствором. Рассчитывают среднее величины оптической плотности. Рассчитывают чистоту ретинола пальмитата SP_RP в виде десятичных долей по формуле

где A - среднее величины оптической плотности;

975 - коэффициент поглощения ретинола пальмитата при 325 нм (см. [1]);

m_st - масса образца сравнения, мг.

1 см³ стандартного раствора ретинола ацетата (см. 4.16.2) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см³ (см. 5.11) и доводят до метки этанолом. Измеряют оптическую плотность раствора в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при длине волны 325 нм относительно этанола. Измерение повторяют два раза, каждый раз заполняя кювету раствором. Рассчитывают среднее величины оптической плотности. Рассчитывают чистоту ретинола ацетата SP_RA в виде десятичных долей по формуле

где A - среднее величины оптической плотности;

1560 - коэффициент поглощения ретинола ацетата при 325 нм (см. [1]);

m_st - масса образца сравнения, мг.

3 см³ стандартного раствора ацетата (см. 4.16.3) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см³ (см. 5.11) и доводят до метки этанолом. Измеряют оптическую плотность раствора в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при длине волны 284 нм относительно этанола. Измерение повторяют два раза, каждый раз заполняя кювету раствором. Рассчитывают среднее величины оптической плотности. Рассчитывают чистоту ацетата SP_TA в виде десятичных долей по формуле

где A - среднее величины оптической плотности;

43,6 - коэффициент поглощения ацетата при 284 нм (см. [1]);

m_st - масса образца сравнения, мг.

4.17.4 Спектрофотометрическое определение чистоты стандартного раствора 

3 см³ стандартного раствора (см. 4.16.4) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см³ (см. 5.11) и доводят до метки этанолом. Измеряют оптическую плотность раствора в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при длине волны 292 нм относительно этанола. Измерение повторяют два раза, каждый раз заполняя кювету раствором. Рассчитывают среднее величины оптической плотности. Рассчитывают чистоту SP_T в виде десятичных долей по формуле

где A - среднее величины оптической плотности;

75,8 - коэффициент поглощения при 292 нм (см. [1]);

m_st - масса образца сравнения, мг.

Готовят ряд стандартных растворов согласно следующей процедуре.

В четыре мерные колбы вместимостью 100 см³ (см. 5.11) переносят пипеткой по 1 см³ стандартного раствора ретинола пальмитата (см. 4.16.1), ретинола ацетата (см. 4.16.2), ацетата (см. 4.16.3), (см. 4.16.4) и каждый раствор доводят до метки изооктаном. На каждой колбе отмечают наименование стандарта.

В четыре флакона автосамплера вместимостью 2 см³ переносят автоматическим дозатором 60 мм³ раствора ретинола пальмитата, 30 мм³ ретинола ацетата, 100 мм³ ацетата и 400 мм³ . Добавляют в каждый флакон изооктан до 2 см³.

Растворы во флаконах быстро перемешивают и проводят хроматографический анализ в соответствии с параметрами системы для ВЭЖХ (см. 6.2). Детектирование ретинола пальмитата и ретинола ацетата проводят при 325 нм. Детектирование ацетата проводят при 284 нм, - при 292 нм.

Рассчитывают хроматографическую чистоту стандартов (CP) в виде десятичных долей после интегрирования всех пиков на хроматограмме каждого стандарта по формуле

При расчете чистоты стандарта ретинола пальмитата (ацетата) учитывают только площадь транс-пиков.

Рассчитывают концентрацию, , каждого витамина в градуировочном стандартном растворе ретинола пальмитата (RP) и ретинола ацетата (RA) в мкг/см³, (T) и ацетата (TA), мг/дм³, по формулам:

где V_a - объем градуировочного раствора соответственно 0,5; 2,0; 4,0; 8,0; 16,0 и 32,0 см³;

m_st - масса стандартного образца сравнения, мг;

SP - спектрофотометрическая чистота;

CP - хроматографическая чистота;

1000 - коэффициент пересчета мг/см³ в мкг/см³.

При проведении испытания используют обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

5.1 Система для ВЭЖХ, состоящая из насоса, автоматического устройства для ввода проб, программируемого УФ-детектора для определения витамина A при длине волны детектирования 325 нм и флуоресцентного детектора для определения витамина E при длине волны возбуждения 280 нм и длине волны эмиссии 310 нм.

5.2 Колонка для ВЭЖХ <*> аналитическая, заполненная нормально-фазовым сорбентом, или эквивалентная.

--------------------------------

<*> Например, (5 мкм, 150 x 4,6 мм). Представлен пример доступной в коммерческой сети продукции. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламной поддержкой данной продукции. Допускается использование аналогичной продукции, обеспечивающей достоверные результаты.

5.3 Баня водяная, обеспечивающая поддержание температуры (37 +/- 2) °C.

5.4 Центрифуга с адаптерами для пробирок вместимостью 50 см³, обеспечивающая центрифугирование при 4000 об./мин.

5.5 Спектрофотометр, пригодный для измерений оптической плотности в ультрафиолетовом и видимом спектральном диапазоне в комплекте с 1 см кварцевой кюветой.

5.6 Весы аналитические, обеспечивающие точность взвешивания до четвертого десятичного знака после запятой.

5.7 Флаконы для автоматического ввода пробы в систему для ВЭЖХ из темного стекла вместимостью 2 см³ с пластиковой крышкой и пломбой из политетрафторэтилена (ПТФЭ).

5.8 Пробирки центрифужные вместимостью 50 см³.

5.9 Встряхиватель механический лабораторный для пробирок.

5.10 Баня ультразвуковая.

5.11 Колбы мерные вместимостью 50 и 100 см³.

5.12 Устройство для фильтрования под вакуумом через фильтр из нейлона с диаметром пор 0,45 мкм.

5.13 Колбы стеклянные лабораторные вместимостью 250 см³, 1 и 2 дм³.

5.14 Пипетки и наконечники.

Если технологический процесс производства испытуемого образца неизвестен, пробоподготовку проводят в соответствии с 6.1.2.

Если образец получен смешиванием в сухом состоянии или является негомогенным, аккуратно взвешивают около 25 г (m₁) пробы в колбе вместимостью 250 см³ (см. 5.13). Пробу разводят теплой водой (от 40 до 45 °C), охлаждают и добавляют 200 г воды. Записывают конечную массу (m₂). Аккуратно из колбы отбирают и взвешивают около 5 г (m₃) восстановленного образца в центрифужной пробирке с завинчивающейся крышкой. Рассчитывают массу (эквивалентную сухому образцу) m_s по формуле

Если образец является гомогенным или получен смешиванием с увлажнением, аккуратно взвешивают около 0,525 г пробы в центрифужной пробирке вместимостью 50 см³ с завинчивающейся крышкой. Добавляют 5 см³ теплой воды с температурой около 40 °C и встряхивают для растворения.

Если образец является жидкой смесью, готовой к употреблению, или жидким концентратом, после тщательного перемешивания аккуратно взвешивают около 5 г пробы в центрифужной пробирке вместимостью 50 см³ с завинчивающейся крышкой.

К взвешенной пробе в центрифужной пробирке добавляют 5 см³ раствора папаина (см. 4.11) и тщательно перемешивают. Пробирку закрывают крышкой и нагревают на водяной бане при температуре (37 +/- 2) °C в течение 20 - 25 мин. По окончании нагревания пробирки снимают с водяной бани и охлаждают. Добавляют 20 см³ подкисленного метанола (см. 4.12) и встряхивают в течение 10 мин, используя механический встряхиватель.

10 см³ изооктана переносят пипеткой в пробирку с анализируемым образцом. Пробирку аккуратно закрывают крышкой, чтобы предотвратить протекание, и встряхивают в течение 10 мин, используя механический встряхиватель. Затем центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об./мин для получения прозрачного изооктанового слоя. Переносят аликвоту прозрачного изооктанового слоя во флакон из темного стекла, используемый для автоматического ввода в систему для ВЭЖХ-анализа.

Для оптимального разделения и количественного определения рекомендуются:

- колонка аналитическая для ВЭЖХ <*>;

- подвижная фаза A: n-гексан;

- подвижная фаза B: смесь 750 см³ n-гексана, 250 см³ метил-трет-бутилового эфира, 3 см³ метанола;

- скорость элюирования: 1,5 см³/мин;

- вводимый объем: 50 мм³;

- температура термостата колонки: (40 +/- 2) °C;

- время хроматографического анализа: 20 мин.

--------------------------------

<*> Например, (5 мкм, 150 x 4,6 мм). Представлен пример доступной в коммерческой сети продукции. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламной поддержкой данной продукции. Допускается использование аналогичной продукции, обеспечивающей достоверные результаты.

Примеры хроматограмм - в приложении A.

Для спектрофотометрического (УФ) или диодно-матричного (ДАД) детектирования ретинола пальмитата или ретинола ацетата устанавливают длину волны 325 нм. Для флуоресцентного детектирования ацетата или устанавливают длину волны возбуждения 280 нм, эмиссии - 310 нм.

Цикл насоса градиентного элюирования представлен в таблице 1.

Условия хроматографического анализа должны быть подобраны таким образом, чтобы достигалось полное отделение пиков цис- от пиков транс-изомеров ретинола пальмитата (ацетата); т.е. коэффициент разделения соседних пиков стандартов должен быть более 1,5.

Пики цис- и транс-изомеров ретинола пальмитата и ретинола ацетата, и ацетата на хроматограмме раствора пробы идентифицируют по совпадению значений времени удерживания с соответствующими значениями времени удерживания пиков витаминов на хроматограммах стандартных растворов при одинаковых хроматографических условиях.

Целью настоящего стандарта не является установление индивидуального вклада цис- и транс-изомеров пальмитата или ацетата ретинола в общую A-витаминную ценность.

При интегрировании пиков витамина A суммируют площади пиков 13-цис- и полного транс-изомеров ретинола пальмитата или ацетата в пересчете на транс-изомер.

Рассчитывают массовую концентрацию, w, в исследуемом образце (порошкообразном или жидком) ретинола пальмитата и ретинола ацетата в мкг/100 г, или ацетата в мг/100 г по формуле

где A_s - площадь пика или высота пика ретинола пальмитата или ацетата (сумма площадей или высот пиков 13-цис- и полного транс-изомеров), или ацетата в растворе исследуемого образца;

I - постоянная градуировочной кривой для каждого анализируемого вещества;

S - наклон калибровочной кривой для каждого анализируемого вещества;

V_iso - использованный объем изооктана (здесь V_iso = 10 см³);

100 - коэффициент пересчета на 100 г образца;

m_s - масса пробы (для жидкого образца) или масса сухого эквивалента в г (для порошкообразного образца).

Массовую долю витамина A пересчитывают на массовую долю ретинола по формуле

Массовую долю витамина E пересчитывают на массовую долю , используя стехиометрические соотношения:

- 1,10 мг ацетата эквивалентен 1 мг и

- 1 мг = 1,10 (синтетический витамин E; полностью рацемический ).

Данные, приведенные в таблицах B.1, B.2 и B.3, были опубликованы в 2015 г. [2] и получены в результате проведения межлабораторных испытаний в соответствии с ISO 5725-2 [3] и Согласованным протоколом AOAC-IUPAC по проведению межлабораторных испытаний для оценки характеристик прецизионности методов анализа [4]. В основе процедуры проведения испытаний лежали требования, указанные в библиографических ссылках [5] и [6].

Дополнительную информацию по валидации метода анализа можно получить по адресу http://standards.iso.org/iso/20633.

Для обеспечения сопоставимости данных, полученных методами EN 12822 [8], EN 12823-1 [9] и AOAC 2012.10 [10], были проанализированы одинаковые образцы. Для сравнения данные представлены в таблицах C.1 и C.2 и показаны на рисунках C.1 и C.2.

На рисунке C.1 значения, полученные методом EN 12823-1 тремя участвующими лабораториями, нанесены на график против данных +/- 2C_V,R, полученных методом AOAC 2012.10 входе межлабораторных испытаний (MLT), в которых приняли участие от 11 до 15 лабораторий. Границы 2C_V,R включали 95% данных, полученных методом AOAC 2012.10.

Примечание - Результаты, полученные методом EN 12823-1 тремя участвующими лабораториями, нанесены на график против данных +/- 2C_V,R, полученных методом AOAC 2012.10 в ходе межлабораторных испытаний (MLT), в которых приняли участие от 11 до 15 лабораторий. Данные трех участвующих лабораторий были стандартизованы относительно среднего значения, полученного методом AOAC 2012.10.

На рисунке C.2 данные испытаний, полученные методом EN 12822 тремя лабораториями, нанесены на график против данных +/- 2C_V,R, полученных методом AOAC 2012.10 в ходе межлабораторных испытаний (MLT), в которых приняли участие от 11 до 15 лабораторий. Границы 2C_V,R включали 95% данных, полученных с помощью метода валидации AOAC 2012.10.

Примечание - На рисунке приведены результаты определения витамина E ( ацетат плюс в пересчете на ), полученные методом EN 12822 тремя лабораториями. Данные испытаний нанесены на график против данных 2C_V,R, полученных методом AOAC 2012.10 в ходе межлабораторных испытаний, в которых приняли участие от 11 до 15 лабораторий. Данные трех участвующих лабораторий были стандартизованы относительно среднего значения, полученного методом AOAC 2012.10.

--------------------------------

<*> Официальный перевод этого стандарта находится в Федеральном информационном фонде стандартов.