1. Разработан Московской государственной академией пищевых производств.

Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность".

2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 28 августа 1998 г. N 334.

3. Настоящий стандарт представляет собой аутентичный текст международного стандарта ИСО 8069-86 "Сухое молоко. Определение содержания молочной кислоты и лактатов. Ферментативный метод" с дополнительными требованиями, отражающими потребности экономики страны (2, 3 и 7.1).

4. Введен впервые.

Настоящий стандарт распространяется на сухое молоко всех видов и устанавливает метод определения молочной кислоты и ее солей - лактатов.

ГОСТ 26809-86. Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовки проб к анализу.

Массовая доля молочной кислоты и лактатов в сухом молоке, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в граммах молочной кислоты на 100 г сухого обезжиренного вещества.

Восстанавливают пробу сухого молока в теплой воде, осаждают жиры и белки и фильтруют пробу. Полученный фильтрат обрабатывают ферментами и биохимическими реагентами, добавляемыми одновременно, но действующими последовательно:

- L-лактатдегидрогеназа (L-ЛДГ) и D-лактатдегидрогеназа (D-ЛДГ) в присутствии никотинамидадениндинуклеотида (НАД) окисляют лактат до пирувата, восстанавливая НАД до НАДH:

- глутаматпируваттрансфераза (ГПТ) в присутствии L-глутамата преобразует пируват в L-аланин и L-глутамат в альфа-кетоглутарат:

Измеряют массовую долю образовавшегося НАДH, эквивалентную массовой доле молочной кислоты и лактатов в пробе, на спектрофотометре при длине волны 340 нм.

Все реактивы должны быть аналитического качества (не ниже х.ч.). Вода, используемая для приготовления растворов ферментов, должна быть бидистиллированной. Вода для приготовления растворов других реактивов и проб должна быть дистиллированной.

Препарат НАД должен содержать не менее 90% основного вещества.

5.1. Раствор гексацианоферрата (II) калия

Растворяют 35,9 г гексацианоферрата (II) калия в воде и доводят объем раствора до 1 дм3. Раствор перемешивают.

5.2. Раствор сульфата цинка

Растворяют 71,8 г сульфата цинка гептагидрата в воде и доводят объем раствора до 1 дм3. Раствор перемешивают.

5.3. Раствор гидроксида натрия c (NaOH) = 0,1 моль/дм3

Растворяют 4,00 г гидроксида натрия (NaOH) в воде и доводят объем раствора до 1 дм3. Раствор перемешивают.

5.4. Буферный раствор активной кислотности 10,0 pH

Растворяют 7,92 г глицилглицина и 1,47 г L-глутаминовой кислоты в 80 см3 воды. Устанавливают активную кислотность раствора (10,0 +/- 0,1) pH при 20 °C раствором гидроксида натрия c (NaOH) = 10 моль/дм3 и доводят объем раствора водой до 100 см3. Раствор перемешивают.

Раствор устойчив 3 мес при температуре от 0 до 5 °C.

5.5. Раствор НАД

Растворяют 350 мг НАД в 10 см3 воды.

Раствор устойчив 1 мес при температуре от 0 до 5 °C.

Во время использования сосуд с раствором должен быть погружен в емкость с колотым льдом.

5.6. Раствор L-ЛДГ

Растворяют 10 мг L-ЛДГ из мускульных тканей свиньи в 1 см3 раствора глицерина массовой доли 50% (активная кислотность приблизительно 7 pH).

Удельная активность раствора L-ЛДГ должна быть не менее 5500 Е/см3 при 25 °C. Раствор устойчив 12 мес при температуре от 0 до 5 °C.

Во время использования сосуд с раствором должен быть погружен в емкость с колотым льдом.

5.7. Суспензия D-ЛДГ

Смешивают 5 мг D-ЛДГ из Lactobacillus leichmannii с 1 см3 раствора сульфата аммония (активная кислотность приблизительно 6 pH).

Удельная активность суспензии D-ЛДГ должна быть не менее 1500 Е/см3 при 25 °C. Суспензия устойчива 12 мес при температуре от 0 до 5 °C. Во время использования сосуд с суспензией должен быть погружен в емкость с колотым льдом.

5.8. Суспензия ГПТ

Суспензию ГПТ из сердца свиньи концентрации 20 мг/см3 удельной активности 1600 Е/см3 при 25 °C в растворе сульфата аммония готовят центрифугированием 2 см3 суспензии концентрации 10 мг/см3 в течение 10 мин (при факторе разделения центрифуги 4000g). Отбирают 1 см3 надосадочной жидкости и отбрасывают, а оставшуюся суспензию используют для анализа.

Готовая суспензия устойчива при температуре от 0 до 5 °C 12 мес. На время работы сосуд с суспензией помещают в емкость со льдом.

5.9. Раствор L-лактата лития

Растворяют 50 мг L-лактата лития в воде и доводят объем раствора до 500 см3. Раствор перемешивают.

5.10. Раствор D-лактата лития

Растворяют 50 мг D-лактата лития в воде и доводят объем раствора до 500 см3. Раствор перемешивают.

Обычная лабораторная аппаратура, в том числе указанная в 6.1 - 6.11.

6.1. Весы лабораторные общего назначения наибольшим пределом взвешивания 200 г и допускаемой погрешностью +/- 0,001 г.

6.2. Стаканчик стеклянный для взвешивания или бюкса вместимостью 50 см3.

6.3. Цилиндр градуированный вместимостью 50 см3 и допускаемой относительной погрешностью +/- 2%.

6.4. Колбы мерные вместимостью 100 см3 и допускаемой относительной погрешностью +/- 0,2%.

6.5. Дозаторы пипеточные объемами доз 0,02; 0,05; 0,2; 1 и 2 см3 и относительной погрешностью дозирования +/- 1%.

6.6. Пипетки градуированные вместимостью 2, 5 и 10 см3 и допускаемой относительной погрешностью +/- 1%.

6.7. Воронка стеклянная для фильтрования диаметром 7 см.

6.8. Фильтры бумажные гофрированные диаметром 15 см, свободные от молочной кислоты и лактатов.

6.9. Палочка стеклянная.

6.10. Палочки пластиковые или иные для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.

6.11. Спектрофотометр (фотометр) со следующими техническими характеристиками: длина волны 340 нм; спектральный интервал - не более 10 нм; интервал измерений оптической плотности - от 0,000 до 2,000; погрешность установки длины волны - +/- 3 нм; среднее квадратическое отклонение случайной составляющей погрешности измерений - не более 0,15%.

Кюветы фотометрические толщиной поглощающего слоя 1 см.

7.1. Отбор проб - по ГОСТ 26809.

7.2. Пробу хранят в условиях, предотвращающих порчу и изменение состава.

При проведении измерений следует избегать загрязнений, в том числе связанных с поглощением влаги или конденсацией ее на стенках сосудов.

8.1. Проверка активности реактивов

При приготовлении новой порции реактивов (5.5 - 5.8) и хранении готовых реактивов без использования более двух недель или изменении условий хранения проверяют активность реактивов.

8.1.1. Для проверки активности реактивов в две мерные колбы (6.4) вместимостью 100 см3 вносят по 10 см3 L-лактата лития (5.9), в две другие мерные колбы (6.4) вместимостью 100 см3 вносят по 10 см3 D-лактата лития (5.10). Определяют концентрации L-молочной кислоты и ее лактатов, а также концентрацию D-молочной кислоты и ее лактатов (8.5.2 - 8.6).

8.1.2. Концентрации D-лактата лития и L-лактата лития , мг/дм3, вычисляют по формулам:

где - разность оптических плотностей, рассчитанная по 8.6.4.

8.1.3. Принимая во внимание чистоту реактивов, определенная концентрация лактата лития при проверке активности реактивов должна составлять (100 +/- 5)% концентрации приготовленных растворов.

Если определяемое значение не попадает в этот интервал, проверяют реактивы, технику измерения, точность пипеток и дозаторов, а также исправность спектрофотометра. После этого тестирование повторяют до получения удовлетворительных результатов.

8.2. Подготовка пробы

Пробу продукта помещают в контейнер вместимостью, в два раза превышающей объем пробы, с герметично закрывающейся крышкой, тщательно перемешивают, энергично встряхивая и переворачивая контейнер.

В процессе подготовки пробы необходимо исключить ее контакт с атмосферой, чтобы уменьшить абсорбцию влаги.

8.3. Масса навески

В стеклянном стаканчике (6.2) взвешивают 1,000 г пробы.

8.4. Подготовка контрольной пробы

Контрольное испытание проводят, как описано в 8.5 - 8.6, используя те же реактивы, но без пробы продукта. Для испытания пробы продукта (8.6) берут 1,0 см3 фильтрата (8.5.3).

8.5. Приготовление раствора пробы и удаление белка

8.5.1. Навеску сухого молока (8.3) растворяют при помешивании стеклянной палочкой (6.9) в 20 см3 воды температурой от 40 до 50 °C, количественно переносят в мерную колбу (6.4) вместимостью 100 см3 и охлаждают до комнатной температуры (20 °C).

8.5.2. К раствору в колбе (8.5.1) последовательно добавляют 5,0 см3 раствора гексацианоферрата (II) калия (5.1), 5,0 см3 раствора сульфата цинка (5.2), 10 см3 раствора гидроксида натрия (5.3), тщательно перемешивая содержимое колбы после добавления каждого компонента, и доводят объем раствора водой до 100 см3. Снова тщательно перемешивают раствор и выдерживают 30 мин при комнатной температуре.

8.5.3. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр (6.8), отбрасывая первую порцию фильтрата.

8.6. Определение

8.6.1. В спектрофотометрическую кювету (6.11) пипеточным дозатором (6.5) вносят:

- 1,0 см3 фильтрата (8.5.3);

- 1,0 см3 буферного раствора (5.4);

- 0,20 см3 раствора НАД (5.5);

- 0,02 см3 суспензии ГПТ (5.8).

Содержимое кюветы перемешивают палочкой (6.10).

8.6.2. Кювету выдерживают 5 мин, затем измеряют оптическую плотность раствора относительно воды при длине волны 340 нм.

В кювету добавляют 0,02 см3 раствора L-ЛДГ (5.6) и 0,05 см3 раствора D-ЛДГ (5.7). Раствор перемешивают палочкой (6.10).

Примечание. Раздельное определение L- и D-молочных кислот и их лактатов в пробе можно осуществить добавлением или L-ЛДГ или D-ЛДГ.

8.6.3. Раствор (8.6.2) выдерживают при комнатной температуре 45 мин и измеряют оптическую плотность. Раствор выдерживают еще 15 мин и снова измеряют оптическую плотность (измерения после 60 мин реакции).

Примечание. Если требуется определить содержание только L-молочной кислоты и ее лактатов, измерения производят соответственно через 30 и 45 мин.

8.6.4. Рассчитывают разность измеренных значений оптических плотностей по формуле

где - оптическая плотность пробы через 60 мин (8.6.3);

- оптическая плотность пробы через 5 мин (8.6.2);

- оптическая плотность пробы через 45 мин (8.6.3);

- оптическая плотность контрольной пробы через 60 мин (8.6.3);

- оптическая плотность контрольной пробы через 5 мин (8.6.2);

- оптическая плотность контрольной пробы через 45 мин (8.6.3).

Примечания

1. В некоторых случаях может иметь место медленно текущая побочная реакция. Изменение оптической плотности, вызванное этой реакцией, исключают экстраполяцией оптической плотности на нулевой момент времени.

2. Если оптическую плотность измеряют через 30 и 45 мин, формула имеет вид

где - оптическая плотность пробы через 30 мин (8.6.3);

- оптическая плотность контрольной пробы через 30 мин (8.6.3).

8.6.5. Если разность оптических плотностей, рассчитанная в соответствии с 8.6.4, превышает 0,500, определение повторяют (8.6.1 - 8.6.4), разводя дистиллированной водой растворы пробы продукта (8.5.3) и контрольной пробы (8.4).

9.1. Метод расчета

Массовую долю молочной кислоты и лактатов X в сухом молоке, выраженную в г молочной кислоты на 100 г сухого обезжиренного вещества, вычисляют по формуле

где A - разность оптических плотностей (8.6.4);

M - молярная масса молочной кислоты, M = 90,1 г/моль;

- объем раствора в кювете (8.6.2), см3

(для определения D- и L-молочных кислот ,

для определения L-молочной кислоты ,

для определения D-молочной кислоты );

- объем подготовленного к анализу раствора (8.5.2), см3 ;

- объем разведенного фильтрата (8.6.5), см3 (если испытание проводилось без разведения фильтрата, то );

- коэффициент оптической плотности НАДH, , равный:

при длине волны 340 нм - 6,3,

при длине волны 365 нм - 3,5,

при длине волны 334 нм - 6,18;

l - толщина поглощающего слоя в кювете, см;

m - масса навески сухого молока, г (8.3);

- объем фильтрата (8.5.3) в спектрофотометрической кювете (8.6.4), см3;

- объем фильтрата (8.5.3), взятый для разведения (8.6.5), см3 (если испытание проводилось без разведения фильтрата, то );

- массовая доля сухого обезжиренного вещества в пробе продукта, %.

Результат определяют с точностью 0,001% (г/100 г).

9.2. Точность

Примечание. Сходимость и воспроизводимость были рассчитаны по результатам межлабораторных испытаний.

9.2.1. Сходимость

Абсолютное расхождение результатов двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать r = 0,010 г/100 г, если среднее арифметическое результатов не превышает 0,060 г/100 г включительно.

Относительное расхождение результатов двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать 15% среднего арифметического значения, если оно превышает 0,060 г/100 г.

9.2.2. Воспроизводимость

Абсолютное расхождение результатов двух измерений, выполненных в двух лабораториях, не должно превышать R = 0,015 г/100 г, если среднее арифметическое результатов не превышает 0,100 г/100 г включительно.

Относительное расхождение результатов двух измерений, выполненных в двух лабораториях, не должно превышать 20% среднего арифметического значения, если оно превышает 0,100 г/100 г.

В отчете об испытании должны быть указаны:

- используемый метод;

- полученные результаты;

- любые условия проведения испытаний, не установленные данным стандартом и касающиеся подробностей, которые могут повлиять на конечный результат.

В отчете должны быть все данные, необходимые для полной идентификации пробы.