Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения".

1. Подготовлен Государственным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт птицеперерабатывающей промышленности" Российской академии сельскохозяйственных наук (ГУ ВНИИПП Россельхозакадемии) на основе собственно аутентичного перевода, указанного в пункте 4.

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 116 "Продукты переработки птицы, яиц и сублимационной сушки".

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 16 декабря 2005 г. N 314-ст.

4. Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 13493:1998 "Мясо и мясные продукты. Определение содержания хлорамфеникола. Метод жидкостной хроматографии" (ISO 13493:1998 "Meat and meat products - Determination of chloramphenicol content - Method using liquid chromatography"). Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5-2004 (пункт 3.5).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных (региональных) стандартов соответствующие им национальные стандарты Российской Федерации, сведения о которых приведены в дополнительном Приложении Б.

5. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет.

Настоящий стандарт устанавливает метод определения с помощью жидкостной хроматографии содержания хлорамфеникола в мышечной ткани мяса, включая мясо птицы, где массовая доля хлорамфеникола составляет не менее 6,5 мкг/кг.

Данный метод неприменим к испорченным образцам.

Примечание. Настоящий стандарт допускается применять для определения содержания хлорамфеникола во всех видах мяса и мясопродуктов. Однако межлабораторные испытания по установлению точности метода были проведены только на образцах мышечной ткани.

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ИСО 3100-1:1991 Мясо и мясные продукты. Методы отбора и подготовки образцов. Часть 1. Отбор образцов

ИСО 3696:1987 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний

ИСО 5725-1:1994 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ИСО 5725-2:1994 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений.

В настоящем стандарте применяют следующий термин с соответствующим определением:

3.1. содержание хлорамфеникола в мясе и мясных продуктах: Массовая доля хлорамфеникола, измеренная с помощью метода, установленного в настоящем стандарте.

Примечание. Содержание хлорамфеникола выражают в микрограммах на килограмм.

Хлорамфеникол из пробы экстрагируют водой. Экстракт фильтруют и полученный водный раствор очищают от липофильных компонентов методом твердофазной экстракции. Хлорамфеникол элюируют с экстракционного патрона дихлорметаном. Органический растворитель выпаривают и остаток очищают с помощью жидко-жидкостной экстракции в системе вода-толуол. Хлорамфеникол определяют методом обращенно-фазной хроматографии с детектированием в ультрафиолетовой (УФ) области спектра.

При отсутствии специальных указаний используют реактивы только признанных аналитических марок.

5.1. Вода должна соответствовать требованиям квалификации не ниже 3-й степени чистоты согласно ИСО 3696. Вода не должна содержать органические примеси.

5.2. Азот, пригодный для выпаривания растворителей.

5.3. Дихлорметан.

5.4. Толуол.

5.5. Ацетатный буфер, , pH = 4,3.

Растворяют 0,82 г безводного ацетата натрия примерно в 970 см3 воды. С помощью pH-метра (6.1) доводят pH до 4,3 добавлением раствора уксусной кислоты массовой долей 50%. Переносят раствор в мерную колбу вместимостью 1000 см3. Доводят водой до метки и перемешивают.

5.6. Ацетонитрил для УФ спектроскопии.

5.7. Подвижная фаза.

К 250 см3 ацетонитрила (5.6) добавляют 750 см3 ацетатного буфера (5.5) и тщательно перемешивают.

Перед использованием элюент фильтруют через мембранный фильтр 0,22 мкм (6.2) и дегазируют.

5.8. Основной раствор хлорамфеникола массовой концентрации 100 мкг/см3.

Взвешивают 10 мг хлорамфеникола с точностью 0,1 мг и переносят навеску в мерную колбу вместимостью 100 см3. Добавляют метанол до метки и перемешивают.

Приготовленный основной раствор стабилен в течение 1 мес при хранении в темноте.

5.9. Стандартные растворы хлорамфеникола.

Пипеткой вносят 5,0 см3 основного раствора (5.8) в мерную колбу вместимостью 100 см3. Разбавляют водой до метки и перемешивают. Разбавляют 1,0, 2,0, 5,0 и 15,0 см3 этого раствора до 100 см3 для получения четырех стандартных растворов с массовой концентрацией хлорамфеникола соответственно 0,05; 0,10; 0,25 и 0,75 мкг/см3.

Эти стандартные растворы стабильны в течение одной недели при хранении в темноте.

Используют обычное лабораторное оборудование, в частности:

6.1. pH-метр

6.2. Мембранный фильтр с малым мертвым объемом и размером пор 0,22 мкм.

6.3. Механическое или электрическое устройство, пригодное для измельчения образца.

В качестве такого устройства может быть использован высокоскоростной ротационный куттер или мясорубка с решеткой, диаметр отверстий которой не превышает 4 мм.

6.4. Лабораторный гомогенизатор (например гомогенизатор типа Стомахер или Вортекс) <1>.

--------------------------------

<1> Это примеры коммерчески доступной продукции. Данная информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой этой продукции.

6.5. Фильтровальная бумага обеззоленная быстрофильтрующая диаметром примерно 15 см.

Примечание. Например, можно использовать Ватман 41 <1>.

--------------------------------

<1> Это примеры коммерчески доступной продукции. Данная информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой этой продукции.

6.6. Экстракционные патроны вместимостью 20 см3 с диатомитовой землей, которая задерживает липофильные компоненты из водных растворов.

Примечание. Можно использовать, например, картриджи производства фирмы Merck, Дармштадт, Германия (N 11737) <1>.

--------------------------------

<1> Это примеры коммерчески доступной продукции. Данная информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой этой продукции.

6.7. Водяная баня или нагревательный блок, позволяющие поддерживать температуру (40 +/- 1) °C и имеющие устройство для выпаривания потоком азота (5.2), или ротационный вакуумный испаритель.

6.8. Центрифужные пробирки вместимостью 25 см3.

6.9. Смеситель для пробирок типа Вортекс, обеспечивающий частоту вращения примерно .

6.10. Центрифуга, обеспечивающая радиальное ускорение примерно 1000 g.

6.11. Микропипетки вместимостью 300 мм3.

6.12. Жидкостной хроматограф, оборудованный:

- насосом постоянного потока;

- инжектором;

- хроматографической колонкой внутренним диаметром 3 мм, длиной 20 см, заполненную обращенной фазой или с размером частиц 5 мкм, или другой колонкой с эквивалентными характеристиками;

- детектором УФ/ВИД, обеспечивающим измерение при длине волны 285 нм, если возможно - диодно-матричным детектором (используется для подтверждения обнаружения хлорамфеникола);

- самописцем с регулируемым диапазоном измерения или интегратором.

Отбор образцов не является частью метода, изложенного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора образцов приведен в ИСО 3100-1.

Очень важно, чтобы в лабораторию поступали представительные образцы, которые в процессе хранения и транспортирования не были испорчены или изменены.

От представительного образца, поступившего в лабораторию, отбирают для анализа образец массой не менее 200 г. Образец хранят в условиях, исключающих его порчу и изменение состава.

Доводят температуру образца до комнатной температуры. Удаляют жировую ткань и несъедобные части образца.

Измельчают образец с помощью устройства (6.3). При этом необходимо следить за тем, чтобы температура образца не превышала 25 °C. При использовании мясорубки образец пропускают через нее не менее двух раз.

Приготовленный образец помещают в герметично закрываемую емкость. Закрывают и хранят так, чтобы не допустить порчи и изменения его состава.

В случае необходимости образец хранят при температуре ниже минус 18 °C.

Анализ образца проводят как можно быстрее, но не позднее 24 ч после измельчения.

Примечание. Для контроля повторяемости результатов (см. 11.2) проводят два параллельных определения в соответствии с 9.1 - 9.6.

9.1. Общая часть

Параллельно с анализом раствора (или серии растворов), полученного из испытуемого образца, проводят анализ раствора, полученного из образца, заведомо не содержащего хлорамфеникол (образец-бланк), и раствора, полученного из образца, в который добавлен хлорамфеникол в количестве 10 мкг/кг (образец-бланк с внесенным хлорамфениколом).

9.2. Подготовка пробы

В конической колбе вместимостью 100 см3 взвешивают 10 г (m) измельченного образца (8) с точностью 0,1 г.

9.3. Получение экстракта

Добавляют 40,0 см3 воды и энергично перемешивают в течение 3 мин с помощью лабораторного гомогенизатора (6.4).

Общий объем образующейся водной фазы равен 40,0 см3 плюс объем воды, содержащейся в пробе (обычно в 10 г пробы содержится примерно 7,5 см3 воды).

Гомогенат фильтруют через бумажный фильтр (5).

9.4. Твердофазная экстракция

Переносят 20,0 см3 фильтрата в экстракционный патрон (6.6).

Через (15 +/- 2) мин элюируют хлорамфеникол с помощью 70 см3 дихлорметана (5.3). Выпаривают органическую фазу до объема примерно 1 см3 на водяной бане (6.7) в слабом потоке азота (5.2) или с помощью ротационного вакуумного испарителя (6.7).

С помощью примерно 10 см3 дихлорметана (5.3) переносят остаток в центрифужную пробирку (6.8).

Осторожно выпаривают досуха.

9.5. Жидко-жидкостная экстракция

К остатку добавляют 400 мм3 воды и 2,0 см3 толуола (5.4) и перемешивают с умеренной интенсивностью в течение 1 мин на смесителе Вортекс (6.9) с частотой вращения примерно .

Центрифугируют в течение 5 мин на центрифуге (6.10) с радиальным ускорением 1000 g.

Пипеткой отбирают как можно больше органической фазы и отбрасывают ее.

Добавляют 1,5 см3 толуола и перемешивают с умеренной интенсивностью в течение 1 мин на смесителе Вортекс (6.9) с частотой вращения примерно .

Центрифугируют в течение 5 мин на центрифуге (6.10) с радиальным ускорением 1000 g.

Пипеткой отбирают как можно больше органической фазы и отбрасывают ее.

Микропипеткой (6.11) переносят 300 мм3 водной фазы в подходящий сосуд.

9.6. Хроматографический анализ

9.6.1. Условия хроматографирования

Примечание. Инжектируемый объем и объемная скорость потока зависят от размеров колонки.

9.6.2. Хроматографирование

После стабилизации системы жидкостного хроматографа (6.12) инжектируют растворы, полученные из образца-бланка и образца-бланка с внесенным хлорамфениколом, четыре стандартных раствора хлорамфеникола (5.9), раствор, приготовленный из испытуемого образца по 9.5, и снова стандартные растворы хлорамфеникола (5.9).

На хроматограммах образцов проверяют наличие сигнала на участке, соответствующем времени удерживания хлорамфеникола.

9.6.3. Измерение

Измеряют высоты или площади хроматографических пиков хлорамфеникола для испытуемого раствора и стандартных растворов хлорамфеникола.

Измеренные для стандартных растворов высоты или площади пиков должны линейно зависеть от содержания хлорамфеникола в этих растворах.

Примечание. С помощью диодно-матричного детектора может быть подтверждено обнаружение хлорамфеникола при его содержании в образце более 10 мкг/кг.

Содержание хлорамфеникола w, мкг/кг, в испытуемом образце рассчитывают по формуле

где h - высота или площадь пика в единицах длины или площади, измеренные для испытуемого раствора;

- высота или площадь пика, измеренные для одного из стандартных растворов (5.9);

- содержание хлорамфеникола в стандартном растворе, мкг/см3;

m - масса испытуемой пробы (9.2), г;

- объем водной фазы, полученной после гомогенизации по 9.3, см3 ;

- объем фильтрата , перенесенного по 9.4 в экстракционный патрон, см3;

- объем воды , добавленной по 9.5 к сухому остатку, мм3.

Результат вычислений округляют до 0,1 мкг/кг.

Результат испытаний нельзя корректировать на открываемость. Открываемость должна быть указана в протоколе испытаний (12).

11.1. Межлабораторные испытания

Точность метода была установлена с помощью межлабораторных испытаний, проведенных в соответствии с ИСО 5725-1 и ИСО 5725-2.

Результаты этой межлабораторной проверки опубликованы в [1]. Результаты этой проверки не могут быть распространены на области концентраций и на матрицы, отличные от указанных в настоящем стандарте.

Результаты другой межлабораторной проверки, приведенной в соответствии с ИСО 5725-1 и ИСО 5725-2, показывают, что открываемость для мяса, мяса птицы и мясных продуктов воспроизводима и равна примерно 55%.

11.2. Повторяемость

Абсолютное значение разности результатов двух независимых единичных испытаний, выполненных за короткий промежуток времени одним методом для одного измельченного образца в одной лаборатории одним оператором на одном и том же оборудовании, может превышать 2,1 мкг/кг не более чем в 5% случаев при содержании хлорамфеникола в образце 10 мкг/кг.

11.3. Воспроизводимость

Абсолютное значение разности результатов двух независимых единичных испытаний, выполненных одним методом для идентичного измельченного образца в разных лабораториях разными операторами с использованием разного оборудования, может превышать 4,9 мкг/кг не более чем в 5% случаев при содержании хлорамфеникола 10 мкг/кг.

В протоколе испытания необходимо указать:

- информацию, необходимую для полной идентификации образца;

- использованный метод отбора образцов (если известен);

- использованный метод испытаний с указанием ссылки на настоящий стандарт;

- условия проведения испытаний, не отраженные в настоящем стандарте или считающиеся неоднозначными, а также все имевшие место случаи, которые могут повлиять на результаты испытаний;

- полученный результат испытаний или два результата испытаний, если проводилась проверка повторяемости;

- открываемость.