Методика допущена для целей государственного экологического контроля.

Настоящий документ устанавливает методику определения острой и хронической токсичности питьевых, грунтовых, поверхностных, сточных вод, а также водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов в лабораторных условиях с использованием в качестве тест-объекта низших ракообразных дафний.

Методика основана на определении смертности и изменений в плодовитости дафний (Daphnia magna Straus, Cladocera, Crustacea) при воздействии токсических веществ, присутствующих в исследуемой водной среде, по сравнению с контрольной культурой в пробах, не содержащих токсических веществ (контроль).

Острое токсическое действие исследуемой воды или водной вытяжки из почв, осадков сточных вод и отходов на дафний определяется по их смертности (летальности) за определенный период экспозиции. Критерием острой токсичности служит гибель 50% и более дафний за 96 часов в исследуемой воде при условии, что в контрольном эксперименте гибель не превышает 10%.

В экспериментах по определению острого токсического действия устанавливают:

среднюю летальную концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод или водной вытяжки из почв, осадков сточных вод и отходов, содержащих смеси веществ), вызывающую гибель 50% и более тест-организмов;

безвредную (не вызывающую эффекта острой токсичности) концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод или водной вытяжки из почв, осадков сточных вод и отходов, содержащих смеси веществ), вызывающую гибель не более 10% тест-организмов.

Хроническое токсическое действие исследуемой воды или водной вытяжки из почв, осадков сточных вод и отходов на дафний определяется по смертности и изменению их плодовитости за период до 24 суток в исследуемой воде по сравнению с контрольным экспериментом. Критерием хронической токсичности служит гибель 20% и более и (или) достоверное отклонение в плодовитости из числа выживших тест-организмов по сравнению с контрольным экспериментом.

Настоящая методика обеспечивает получение результатов анализа с погрешностями (P = 0,95), не превышающими значений, приведенных в табл. 1.

Для проведения исследований по данной методике необходимы следующие средства измерений, материалы и реактивы:

климатостат (бокс для культивирования дафний) или эквивалентное приспособление, позволяющее поддерживать освещение лампами дневного света от 500 - 1000 лк и температуру окружающего воздуха +20 +/- 2 °C;

климатостат (бокс для культивирования водорослей) или эквивалентное приспособление, позволяющее поддерживать освещение лампами дневного света 3000 - 4000 лк и температуру окружающего воздуха от +22 до +25 °C;

мешалка лабораторная (ТУ 25-05-2160-76Е), или аппарат для встряхивания (ТУ 64-1-1081-73), или мешалка магнитная (ТУ 25-11-834-73);

весы лабораторные общего назначения, 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г (ГОСТ 24104-88);

весы лабораторные общего назначения, 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 1000 г (ГОСТ 24104-88);

меры массы (ГОСТ 7328-82);

pH-метр (ГОСТ 25.7416.01-71);

люксметр любого типа, например цифровой ТЮ 1403 (ТУ 4485-0152-05764771-96);

термометр лабораторный шкальный с диапазоном измерения от 0 до 50 °C с ценой деления шкалы 0,5 °C (ГОСТ 215-73);

термометр гидрологический с диапазоном измерения от -3 до +65 °C с ценой деления шкалы 0,5 °C, тип ТМ-14 (ГОСТ 2045);

микроскоп биологический рабочий или исследовательский типов МБР, МБИ, обеспечивающий увеличение в 100 - 200 раз (ТУ 3-3-1210-75);

насос вакуумный любого типа, например водоструйный стеклянный (ГОСТ 10696-75) с приемником объемом 1000 куб. см;

аппарат Зейца или другой фильтровальный аппарат, например отсасыватель хирургический ОХ-10 (ТУ 64-1-2941-81);

центрифуга лабораторная медицинская (ТУ 5-375-4261-76) или типа ЦЛК-1 с комплектом пробирок (ТУ 5-4260);

сушильный электрический шкаф общелабораторного назначения (ТУ 64-1-909-80);

автоклав (ГОСТ 9586-75);

аквариумный микрокомпрессор АЭН-4 (ГОСТ 14087-80);

лупа измерительная (ГОСТ 8309-75);

линейка измерительная (ГОСТ 427-75);

оксиметр любого типа, с погрешностью измерения не более 0,5 мг/куб. дм кислорода;

плитка электрическая (ГОСТ 14919-83);

спиртовка лабораторная стеклянная (ГОСТ 25336-82Е);

сита почвенные (ГОСТ 3584-73);

шпатели металлические (ГОСТ 19126-79);

холодильник бытовой, обеспечивающий замораживание (-20 +/- 1 °C) и хранение проб (от +2 до +4 °C);

баня водяная (ТУ 64-1-2850-76);

баня песочная (ТУ 46-775-74);

пробоотборник объемом 500 - 700 куб. см (ГОСТ 6859-72);

батометр-бутылка на штанге тип ГР-16М (ТУ 25-04-1749);

дночерпатель любого типа;

буры почвенные (ТУ 2.833.106-89);

ножи почвенные (ГОСТ 23707-79);

лопаты (ГОСТ 19596-74);

совок (ГОСТ 14180-80);

щупы винтообразные с продольным вырезом, поршневые (ГОСТ 2517-85);

долота, колуны; ведра, изготовленные из нержавеющей стали или с тефлоновым покрытием;

ступки и пестики фарфоровые (ГОСТ 9147-80Е);

ткани шелковые (для муки и крахмала - мельничный газ) N 25 - 43, число отверстий, приходящихся на 1 см, соответствует номеру (ГОСТ 4403-67);

сачки диаметром 1 - 2 см из мельничного газа (изготавливаются кустарно);

фильтры бумажные обеззоленные "белая лента" (ТУ 6-09-1678-77, ГОСТ 12026-76);

фильтры мембранные с диаметром пор 0,45; 3,5 мкм "Владипор" марки МФАС-ОС-2 (ТУ 6-55-221-1029-89), МФАС-П-4 (ТУ 6-55-221-903-88) или аналогичные зарубежного производства, имеющие международный сертификат качества ISO 9000 или EN 29000;

вата хлопковая медицинская гигроскопическая (ГОСТ 5556-81);

бинт марлевый медицинский (ГОСТ 1172-93);

груши резиновые разные - пипеточные луковицы (ТУ 38-106003);

пипетки автоматические дозаторы (любого типа) объемом 0,1 - 0,2 куб. см +/- 1,0%;

камера для счета форменных элементов крови по Горяеву 0,1 мм глубины (ТУ 42-816);

склянки и банки стеклянные с винтовым горлом, с прокладкой и крышкой или с притертой пробкой для отбора и хранения проб и реактивов вместимостью 500, 1000, 2000, 5000 куб. см (ТУ 6-19-6-70);

флаконы и банки цилиндрические полиэтиленовые с навинчивающимися крышками для отбора и хранения проб и реактивов вместимостью 100, 250, 500, 1000, 2000 куб. см (ТУ 6-19-45);

пипетки стеклянные объемом 2 куб. см с отрезанным и оплавленным концом для пересадки рачков (ГОСТ 29227-91);

микропипетки 0,1 куб. см, 0,2 куб. см с ценой деления 0,01 куб. см (ГОСТ 29227-91);

воронки лабораторные (ГОСТ 25336-82Е);

стаканчики для взвешивания (бюксы) диаметром 30, 40 мм (ГОСТ 25336-82Е);

эксикаторы с крышкой (ГОСТ 25336-82Е);

бутыли, кристаллизаторы произвольного объема для замачивания и мытья посуды;

чашки кристаллизационные толстостенные объемом 2,5, 10 куб. дм (ГОСТ 25.11.1357);

стекла покровные для микропрепаратов (ГОСТ 6672-59);

цилиндры вместимостью 25, 50, 100, 1000 куб. см второго класса точности (ГОСТ 1770-74);

мензурки вместимостью 0,25; 0,5; 1,0 куб. дм (ГОСТ 1770-74);

стаканы стеклянные лабораторные вместимостью 150, 200, 250, 1000 куб. см (ГОСТ 25336-82Е);

колбы стеклянные лабораторные вместимостью 0,25, 1 и 2 куб. дм (ГОСТ 25336-82Е); колбы мерные 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2 (ГОСТ 1770-74);

пипетки вместимостью 1, 2, 5, 10 куб. см с ценой деления 0,1 куб. см (ГОСТ 29227-91);

спирт этиловый (ГОСТ 18300-87);

вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72);

вода питьевая (ГОСТ 2874-82);

аммоний ванадиевокислый мета х.ч. (ГОСТ 9336-75);

железо (III) сульфат х.ч. (ГОСТ 9485-74);

железо (III) хлорид х.ч. (ГОСТ 4147-74), 6-водное ос.ч. 5-2 (ТУ 6-09-1007-77);

калий двухромовокислый стандарт-титр (ТУ 6-09-2540-87) или х.ч. (ГОСТ 4220-75);

калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный х.ч. (ГОСТ 2493-75);

калий фосфорнокислый однозамещенный 3-водный х.ч. (ГОСТ 4198-75);

калий углекислый х.ч. (ГОСТ 4221-76);

калий азотнокислый х.ч. (ГОСТ 4217-77);

кальций азотнокислый 4-водный х.ч. (ГОСТ 4142-77);

магний сернокислый 7-водный х.ч. (ГОСТ 4523-77) или стандарт-титр (ТУ 6-09-2540-87);

марганец хлористый х.ч. (ГОСТ 612-75);

молибдена окись х.ч. (ТУ 6-09-4471-77);

натрия гидроокись х.ч. (ГОСТ 4328-77);

цинк сульфат 7-водный ос.ч. 9-2 (ТУ 6-09-4219-76);

кислота азотная х.ч. (ГОСТ 4461-77);

кислота борная х.ч. (ГОСТ 9656-75);

кислота серная х.ч. (ГОСТ 4204-77);

кислота соляная х.ч. (ГОСТ 3118-77);

дрожжи хлебопекарские (ГОСТ 171-81);

культура зеленых водорослей (Chlorella, Scenedesmus или Selenastrum);

культура тест-организмов Daphnia magna Str. с характеристиками по "Определителю пресноводных беспозвоночных Европейской части СССР" (планктон и бентос). - Л. Гидрометеоиздат, 1977 (Л.А. Кутикова, Я.И. Старобогатов).

Примечание. Допускается использование средств измерений, вспомогательных устройств и материалов другого типа, имеющих аналогичные метрологические характеристики.

4.1. При работе с химическими веществами, загрязненными почвами, осадками сточных вод, отходами и сточными водами необходимо соблюдать требования техники безопасности по ГОСТ 12.4.021-75, по ГОСТ 12.1.007-76 "ССВТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

4.2. При пробоподготовке загрязненных почв, осадков сточных вод и отходов необходимо пользоваться средствами индивидуальной защиты: специальной одеждой по ГОСТ 12.4.103-83, респираторами по ГОСТ 12.4.034-85, головными уборами по ГОСТ 12.4.128-83, полихлорвиниловыми перчатками по ГОСТ 12.4.013-85.

4.3. К воздуху производственных помещений предъявляются санитарно-гигиенические требования по ГОСТ 12.1.005-88.

4.4. Безопасность при работе с электроустановками обеспечивается по ГОСТ 12.1.019-79 и в соответствии с требованиями инструкций к оборудованию.

4.5. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

4.6. Рабочие столы и поверхности должны содержаться в чистоте. В конце дня проводится влажная уборка рабочих поверхностей.

4.7. Необходимо организовать обучение работающих безопасности труда по ГОСТ 12.0.004-90.

К биотестированию допускаются специалисты, освоившие методические приемы водной токсикологии, с квалификацией "техник", "лаборант", уложившиеся в нормативы контроля при освоении методики.

Биотестирование проводится в нормальных лабораторных условиях. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов, а также следов обработки помещений инсектицидами, пестицидами и пр.

Температура окружающего воздуха в лаборатории биотестирования от +18 до +24 °C, в люминостате для биотестирования 20 +/- 2 °C.

Атмосферное давление 84 - 106 кПа (630 - 800 мм рт. ст.).

Освещение помещения естественное или искусственное, не ограничено особыми требованиями. Освещение в люминостате, или эквивалентном приспособлении, лампами дневного света. Освещенность для дафний 500 - 1000 лк, для водорослей 3000 - 4000 лк.

Для проведения биотестирования необходимо предварительно подготовить посуду, пробоотборники, места хранения отобранных проб, а также рабочие места для обработки доставленных в лабораторию проб и исследования их на токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключать попадание токсичных, органических и каких-либо других веществ из окружающих предметов или среды в исследуемую воду или в водные вытяжки из почв, осадков сточных вод и отходов.

Для отбора проб воды обычно используется посуда из пластика, а при наличии в воде нефтепродуктов, моющих средств и пестицидов - банки из темного стекла.

Для отбора проб почв, осадков сточных вод и отходов используются банки из темного стекла или посуда из нержавеющей стали. Нельзя использовать посуду с хромовым покрытием.

Посуда из пластика и стекла для отбора проб и биотестирования должна быть химически чистой. Она промывается 10%-ным раствором азотной кислоты. Стенки посуды осторожно смачиваются этим раствором, после чего на 2 - 3 часа посуда оставляется, затем она тщательно промывается водопроводной водой, нейтрализуется раствором пищевой соды и промывается 3 - 4 раза дистиллированной водой. При сильном загрязнении посуды, а также новую посуду промывают водой, заполняют 10%-ным раствором азотной кислоты и выдерживают не менее суток, затем тщательно промывают водопроводной и не менее 3 - 4 раз дистиллированной водой. Посуду для отбора проб почв, осадков сточных вод и отходов, изготовленную из нержавеющей стали, тщательно моют, очищают пищевой содой, промывают водопроводной водой и ополаскивают 3 - 4 раза дистиллированной водой. Для мытья посуды не разрешается пользоваться хромовой смесью, синтетическими поверхностно-активными веществами и органическими растворителями. Посуду для отбора проб сушат на воздухе, а используемую для биотестирования, за исключением мерной, - в сушильном шкафу при 160 °C в течение 1 часа.

Химически чистая посуда для биотестирования должна храниться с закрытыми стеклянными притертыми пробками или завинчивающимися крышками в защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах и т.п.

Вся грязная посуда, использованная при отборе проб, в процессе пробоподготовки и проведения биотестирования должна подвергаться стерилизации кипячением в течение одного часа. Посуду для отбора и подготовки проб отходов, осадков сточных вод желательно подвергать автоклавированию при 121 °C и давлении 1,05 кг/кв. см в течение 15 минут. Стекло, полипропилен и тефлон можно подвергать автоклавированию.

Культивационная вода используется: для культивирования дафний, в качестве контрольной при биотестировании, для разбавления исследуемых вод.

Для подготовки культивационной воды питьевую воду отстаивают и аэрируют в течение 3 - 7 суток (до полного дехлорирования) в бутылях из бесцветного стекла в присутствии высшей водной растительности (2 - 3 г по воздушно-сухой массе любой аквариумной растительности на 1 куб. дм питьевой воды).

При отсутствии питьевой воды удовлетворительного качества допускается использование поверхностной пресной или грунтовой воды, отобранной вне зоны влияния источников загрязнения и профильтрованной через мембранный фильтр с размером пор 3,5 мкм. Мембранные фильтры перед употреблением тщательно промывают и кипятят в дистиллированной воде не менее 10 мин.

Культивационная вода должна удовлетворять следующим требованиям:

- отсутствие органических загрязняющих веществ, хлора, токсических веществ, антагонистических для дафний организмов (сине-зеленых водорослей) и пищевых конкурентов (простейших, многоклеточных);

- pH - 7,0 - 8,2;

- отсутствие углекислого газа, метана и др. газов (при наличии газов для их удаления культивационную воду кипятят 30 мин, затем охлаждают и аэрируют);

- концентрация растворенного кислорода - не менее 6 мг/куб. дм (если концентрация растворенного кислорода в контрольной и разбавляющей воде ниже 6 мг/куб. дм, последняя аэрируется при помощи аквариумного компрессора до начала биотестирования);

- температура +20 +/- 2 °C.

При исследовании вод с повышенным солесодержанием (содержание сухого остатка выше 1 г/куб. дм) необходимо провести предварительную постепенную адаптацию культуры тест-объектов, добавляя небольшими порциями хлористый <...> в культивационную воду (содержание солей по сухому остатку не должно превышать 6 г/куб. дм). При невозможности успешно адаптировать имеющуюся культуру, а также при содержании сухого остатка в исследуемой воде более 6 г/куб. дм необходимо использовать тест-объекты, применяемые в биотестировании морских вод (Artemis salina, Acartia clause, морские водоросли и простейшие).

При использовании в силу необходимости культивационной воды, не отвечающей требованиям установленного качества, все отклонения отмечаются в протоколе испытаний.

Исходный материал для культивирования (водоросли, дафнии) можно получить в лабораториях, занимающихся биотестированием, имеющих культуру требуемой видовой принадлежности, чувствительность которой к модельному токсиканту укладывается в установленный диапазон по п. 10.1, а измеряемые с помощью этой культуры тест-параметры соответствуют установленным характеристикам погрешности (см. п. 2.1).

Дафнии транспортируют в стеклянной емкости с крышкой (в термосе, если температура окружающей среды выходит за пределы 20 +/- 2 °C). Емкость заполняется местной культивационной водой на 2/3 объема и в нее сачком переносятся дафнии. Плотность посадки приблизительно 25 особей на 1 куб. дм воды; для кормления добавляется 3 куб. см водорослевой суспензии на 1 куб. дм воды. Лабораторную воду с дафниями по стенке сосуда переливают в емкость для культивирования, объем которой должен в 2 - 3 раза превышать количество воды с рачками. Культиватор с дафниями помещают в люминостат (климатостат, бокс) и в течение 1 - 2 дней небольшими порциями приливают приготовленную культивационную воду (см. п. 7.2) для адаптации дафний к новой воде.

В лаборатории содержат два вида культуры дафний: маточную (массовую), используемую как источник для возобновления в периоды потери культуры синхронизированной, и синхронизированную, используемую непосредственно для биотестирования.

Культуру дафний выращивают в климатостате или эквивалентном приспособлении, обеспечивающем поддержание искусственного освещения лампами дневного света с интенсивностью света от 500 до 1000 лк, 16-часовой световой и 8-часовой ночной (без освещения) период, температуру 20 +/- 2 °C.

В качестве культиваторов используют чашки кристаллизационные толстостенные или батарейные стаканы объемом 2 - 5 куб. дм, которые наполняют на 3/4 объема культивационной водой, сажают туда самок дафний среднего размера с выводковыми камерами, заполненными эмбрионами, и неплотно прикрывают культиваторы (от попадания пыли и для уменьшения испарения) пластинами из стекла или оргстекла толщиной не менее 6 мм. Для пересадки в культиваторы можно отобрать взрослых самок с помощью фильтрования культуры через крупное сито (размер ячеек 1800 - 2200 мкм). Маточная культура дафний поддерживается в одном или двух сосудах. Ежедневно утром с поверхности воды в сосудах, в которых культивируются рачки, стерильной марлевой салфеткой снимается дрожжевая и бактериальная пленка. После этого вода вместе с рачками осторожно переливается в чистый культиватор так, чтобы накопившийся осадок остался на дне. В чистый культиватор добавляется свежая порция культивационной воды. Таким образом, ежедневно проводится очистка поверхности воды и дна сосуда, в котором культивируются рачки. Кормление дафний осуществляют ежедневно в соответствии с требованиями пункта 7.4.3. Содержание растворенного кислорода в культиваторах должно быть не менее 6 мг/куб. дм, что достигается правильным приготовлением культивационной воды (см. п. 7.2) и регулярной пересадкой дафний в свежую культивационную воду. Аэрирование воды в культиваторах с дафниями не допускается.

Один или два раза в неделю осуществляется пересадка культуры в свежую культивационную воду (частота пересадки определяется содержанием растворенного кислорода в культиваторах). Плотность маточной культуры 20 - 25 особей на 1 куб. дм культивационной воды.

Не допускается использование молоди маточной культуры для биотестирования.

Биотестирование воды и водных вытяжек проводят только на синхронизированной культуре дафний. Синхронизированной является одновозрастная культура, полученная от одной самки путем ациклического партеногенеза в третьем поколении. Такая культура генетически однородна. Рачки, ее составляющие, обладают близкими уровнями устойчивости к токсическим веществам, одновременно созревают и в одно время дают генетически однородное потомство. Для получения синхронизированной культуры отбирают одну самку средних размеров с выводковой камерой, заполненной эмбрионами, и помещают в химический стакан объемом 250 куб. см, заполненный культивационной водой на 200 куб. см. Появившаяся молодь переносится в кристаллизатор (25 особей на 1 куб. дм воды) и культивируется указанным способом. Полученная третья генерация является синхронизированной культурой и может быть использована для биотестирования в возрасте 6 - 24 часов.

Чтобы отобрать для опытов одновозрастную культуру, дафний фильтруют с помощью комплекта сит. Взрослые дафнии задерживаются на крупном сите (размер ячеек 1000 - 2200 мкм), а молодые, в возрасте от 6 до 24 часов, на самом мелком (размер ячеек 450 - 560 мкм).

Для непрерывного осуществления массовых анализов на токсичность различных сред при большом количестве проб необходимо культивирование 4 - 5 генетически однородных синхронизированных культур, отличающихся друг от друга по возрасту. Таким образом обеспечивается постоянный приток тестовых организмов. Синхронизированную культуру выдерживают в условиях по п. 7.3.2; кормление по п. 7.4.3. Ежедневно осуществляется очистка поверхности воды и дна культиваторов по п. 7.3.2.

Пересадка плодоносящих самок в свежую культивационную воду осуществляется один раз в неделю. Родившуюся молодь ежедневно отсаживают и используют для биотестирования.

Дафниям необходимо обеспечить комбинированное дрожже-водорослевое питание. В качестве корма используются зеленые водоросли родов Chlorella, Scenedesmus, Selenastrum.

Водоросли для кормления дафний выращивают в стеклянных кюветах или плоскодонных колбах объемом 250 куб. см при 12 - 16-часовом освещении лампами дневного света (освещенность 3000 - 1000 лк), температуре от +22 до +25 °C, на одной из питательных сред (см. табл. 2). Питательные растворы готовят на дистиллированной воде, полученной из стеклянного перегонного аппарата (допускается приготовление питательной среды для водорослей на бидистиллированной воде).

--------------------------------

Чтобы избежать образования осадка в питательной среде, каждый ее компонент предварительно готовится отдельно в 100 куб. см дистиллированной воды. Полученные растворы солей кипятят каждый по 10 - 15 мин., охлаждают, после чего их можно использовать для приготовления среды в течение месяца при условии хранения при температуре от +2 до +4 °C. Каждый сосуд с питательными веществами должен быть подписан с указанием состава, концентрации, времени приготовления и плотно закрыт притертой пробкой во избежание высыхания и концентрирования.

Для приготовления среды для культивирования водорослей добавляют по 1 куб. см каждого концентрированного раствора (кроме солей железа) в колбу на 1 куб. дм, заполненную до половины дистиллированной водой, поочередно, в последовательности как указано в табл. 2, доводят до метки 1 куб. дм дистиллированной водой, тщательно перемешивают, кипятят раствор 30 мин., охлаждают, после этого добавляют 1 куб. см концентрированного раствора соли железа и, если это необходимо, отдельно приготовленные растворы микроэлементов.

Растворы солей железа и микроэлементов можно добавлять во все среды независимо от того, указано это в прописи их состава или нет.

Для предупреждения выпадения в осадок железа и других микроэлементов дополнительно во все среды можно добавлять хелатирующее вещество, образующее с ионами металлов устойчивые комплексные соединения в форме, доступной для питания водорослей. С этой целью используется стерильный раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевой соли (трилон Б) в концентрации 0,037 г/куб. дм. Раствор готовится в 100 куб. см дистиллированной воды совместно с солью железа. Соли железа и трилона Б отдельно растворяют в 30 куб. см дистиллированной воды, смешивают, доводят дистиллированной водой до 100 куб. см, кипятят, охлаждают и добавляют в охлажденную среду для культивирования водорослей 1 куб. см на 1 куб. дм среды.

Все шесть склянок кипятят 10 - 15 мин., охлаждают и, соблюдая условия стерильности, (над пламенем горелки или спиртовки), переносят в колбу на 1 куб. дм по 1 куб. см из каждой склянки (кроме раствора железа и трилона Б) в 0,5 куб. дм дистиллированной волы, смешивают, доводят до метки 1 куб. дм дистиллированной водой. Полученную смесь кипятят, охлаждают и добавляют после охлаждения 1 куб. см смеси солей железа и трилона Б и по 1 куб. см каждого раствора микроэлементов (А и Б) на 1 куб. дм среды. Готовые среды не хранят.

Приготовленную питательную среду разливают в колбы по 100 куб. см и, соблюдая условия стерильности, добавляют 1 - 5 куб. см концентрированной суспензии водорослей (см. п. 7.4.1). Закрывают колбы стерильными колпачками из алюминиевой фольги или ватными пробками и ставят в люминостат. В люминостате соблюдают 12 - 16-часовой световой и 8 - 12-часовой ночной период.

Во время выращивания водорослей в люминостате необходимо 2 - 3 раза в день встряхивать питательный раствор с водорослями, чтобы обеспечить удаление образующегося углекислого газа, при накоплении которого среда в исследуемых растворах подщелачивается. С этой же целью при интенсивном культивировании водорослей на концентрированной среде Тамия необходимо обеспечить постоянное перемешивание водорослевой культуры на лабораторной мешалке или аэрирование.

Плотность клеток микроводорослей подсчитывается в камере для счета форменных элементов крови по Горяеву. Камеру накрывают покровным стеклом и притирают его до образования радужных колец интерференции, что является признаком достаточно плотно притертого стекла. Пипеткой отбирают произвольное количество тщательно перемешанной культуры водорослей и наносят ее капли под нижний и на верхний край покровного стекла, заполняя камеру так, чтобы не попадали в нее пузырьки воздуха. Избыток водорослевой культуры вытесняется по канавкам камеры. Просматриваются все квадраты по диагонали или камера целиком (если численность водорослей незначительная). Подсчет производят под микроскопом МБИ или МБР при увеличении в 100 или 200 раз.

В каждой пробе подсчитываются клетки водорослей как минимум в трех камерах с последующим вычислением среднего арифметического. Пересчет численности клеток водорослей проводится по формуле:

где:

N - численность водорослей, кл./куб. см;

n - численность водорослей, найденных в секторе (квадрате) сетки камеры, кл;

S - площадь сектора сетки, мм;

h - глубина счетной камеры, мм;

1000 - коэффициент пересчета кубических миллиметров в кубические сантиметры.

Для приготовления дрожжевой суспензии 1 г свежих или 0,5 г сухих хлебопекарных дрожжей заливают 100 куб. см дистиллированной воды. После набухания суспензию тщательно перемешивают. Допускается хранить дрожжевую суспензию в холодильнике 1 - 2 суток.

Оптимальное количество корма и соблюдение режима кормления - одно из основных условий получения удовлетворительных результатов биотестирования, так как изобильное кормление может привести к снижению чувствительности тест-организмов, засорению фильтрующего аппарата дафний и сокращению содержания растворенного кислорода в культивируемой среде. Недостаточное питание приводит к неадекватному реагированию дафний на воздействие токсических веществ.

Кормят маточную и синхронизированную культуру дафний ежедневно, один раз в сутки, добавляя 7 - 10 куб. см концентрированной водорослевой суспензии на 1 куб. дм культивационной воды и 1 - 2 раза в неделю добавляя дополнительно 3 куб. см дрожжевой суспензии на 1 куб. дм культивационной воды.

Дафний в остром опыте кормят также ежедневно, один раз в сутки, добавляя 1,0 куб. см концентрированной или разбавленной в два раза дистиллированной водой водорослевой суспензии на 100 куб. см культивационной воды.

В хроническом опыте добавляют дополнительно 1 - 2 раза в неделю 0,1 - 0,2 куб. см дрожжевой суспензии на 100 куб. см воды. Достаточность питания тест-организмов подтверждается удовлетворительными результатами контроля.

Перед кормлением температуру водорослевой и дрожжевой суспензии доводят до комнатной. Добавки пищи осуществляют при помощи автоматического дозатора или микропипетки после тщательного перемешивания дрожжевой и водорослевой суспензий.

7.5.1.1. Отбор, транспортировка и хранение проб воды

Объем пробы воды для определения острого токсического действия составляет 2 куб. дм, хронического токсического действия - 5 куб. дм. Отбираемый объем должен быть в два раза больше требуемого для хранения дубликата пробы до конца биотестирования.

Методы отбора, транспортировки, хранения, подготовки к выполнению биотестирования должны обеспечить неизменность состава проб в интервале времени между отбором проб и их анализом.

Общие процедуры отбора проб определены в ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб".

Отбор проб, транспортировка и хранение грунтовых вод осуществляется в соответствии с СТ СЭВ 4710-84 "Воды подземные. Общие требования к отбору проб".

Отбор проб в поверхностных проточных и непроточных водоемах осуществляется в соответствии с ГОСТ 17.1.5.05-85 "Охрана природы. Гидросфера. Общие требования к отбору проб поверхностных и морских вод, льда и атмосферных осадков".

Для пробоотбора используют устройства в соответствии с требованиями ГОСТ 17.1.5.04-81 "Охрана природы. Гидросфера. Приборы и устройства для отбора, первичной обработки и хранения проб природных вод. Общие технические условия".

Пробы отбирают вручную специальными приспособлениями или с применением автоматических пробоотборников, при этом емкости для проб должны быть изготовлены из нетоксичного материала, легко выниматься из пробоотборника для очистки и мытья.

Для отбора глубинных проб воды из озер, водохранилищ, прудов и рек следует использовать батометры системы Молчанова, Рутнера или Скадовского-Зернова.

Для отбора проб с глубины 0,5 м и более используется бутыль с привязанной пробкой, которую помещают в футляр, или пробоотборник с грузом. Футляр снабжен петлей, к которой привязывают веревку с размеченными отрезками, указывающими глубину погружения. На требуемой глубине с помощью привязанной к пробке веревки выдергивают пробку из горла бутыли. После заполнения бутыли водой (на поверхности воды не появляются пузырьки воздуха) ее поднимают на поверхность.

Отбор проб питьевых вод осуществляется в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 "Вода питьевая. Отбор проб".

Отбор питьевых вод перед поступлением в распределительную сеть производят из кранов на водоводах, расположенных на входе в установку обеззараживания.

Пробы питьевой воды в источнике водоснабжения и сточной воды с глубины менее 0,5 м отбираются пробоотборником любого типа объемом 500 - 700 куб. см.

Водопроводную воду отбирают из-под крана, многократно ополоснув его отбираемой водой, после 10-минутного слива при полностью открытом кране. Кран антисептической обработке не подвергается.

Отбор сточных вод осуществляется в соответствии с требованиями НВН 33-5.3.01-85 "Инструкция по отбору проб для анализа сточных вод".

Отбор природных и сточных вод следует производить в местах наибольшего перемешивания. Сточные воды отбираются на средней глубине потока, где твердые частицы равномерно распределены.

Очищенные сточные, а также питьевые воды на стадии водоподготовки следует отбирать до системы хлорирования.

При исследовании сточных вод на токсичность не допускается отбор разовой пробы. Количество необходимых порций выбирают на основе опыта проведения анализа. Предпочтительно отбирать среднесуточную пробу каждый час в течение 24 часов, после тщательного перемешивания всего объема отобранной пробы для исследования берется необходимое количество воды.

Допустимое минимальное количество отбираемых единичных проб для последующего смешения - три, с интервалом между отборами не менее часа.

При взятии проб измеряют температуру воды. Для этого используют термометры с ценой деления 0,5 °C. Для определения температуры на месте взятия пробы 1 куб. дм воды наливают в банку, нижнюю часть термометра погружают в воду и через 5 мин. отсчитывают показания его вместе со склянкой на уровне глаз. Точность определения +/-0,5 °C. Допускается консервирование проб, предназначенных для исследования на токсичность.

Отобранные пробы наливают, предварительно дважды ополаскивая отбираемой водой, во флаконы, заполняя их до краев и закрыв без пузырьков воздуха пришлифованными стеклянными пробками или полиэтиленовыми крышками. Под полиэтиленовые крышки подкладывают стерильные прокладки тефлоновые или из алюминиевой фольги. Пробы упаковывают в деревянные ящики для переноски проб и прокладывают бумагой или ветошью. Для сохранности в жаркую погоду пробы транспортируют в контейнерах-холодильниках при температуре от +4 до +10 °C. В холодный период года контейнеры должны быть снабжены прокладками, обеспечивающими предохранение проб от промерзания. При транспортировке не следует держать пробы на свету.

При отборе пробы составляют протокол по утвержденной форме (см. Приложение 1), в нем указывают цель пробоотбора, число, время, место отбора пробы, температуру воды, результаты других произведенных измерений, номер пробы, ставят подпись и расшифровывают подпись отбиравшего пробы. На бутыль наклеивают этикетку с указанием номера протокола, места, даты и времени ее отбора.

При отборе проб необходимо соблюдать технику безопасности. На крупных водотоках следует соблюдать навигационные правила и правила эксплуатации используемого водоема. Постоянные точки контроля следует выбирать в местах, которые были бы доступны в любое время года и где отсутствуют какие-либо природные опасности. На очистных сооружениях отбор проб осуществляется в специально предназначенных местах, маркированных и освещенных в темное время суток. Отбор проб воды производится бригадой, состоящей минимум из двух человек. Перед работой бригада должна быть проинструктирована о мерах предосторожности при выполнении программы работ в зависимости от места отбора, климатических условий и т.д. Пробы, поступающие в лабораторию для исследования, должны быть зарегистрированы в журнале учета с обязательным указанием числа емкостей и номера протокола проб для каждой пробы.

Тестирование проб воды проводят не позднее 6 часов после их отбора. При невозможности проведения анализа в указанный срок пробы воды охлаждают (+2 - +4 °C). Хранить следует не более 24 часов после отбора. О продолжительности хранения проб воды делают пометку в протоколе биотестирования. В исключительных случаях, при отсутствии летучих химических веществ, допускается замораживание проб (-20 °C) и их хранение до двух суток, однако следует помнить, что после размораживания токсичность воды может измениться. В случае предполагаемого замораживания пробы при ее отборе не следует заполнять емкости полностью, чтобы избежать их разрыва. Если пробы требуется отстаивать или фильтровать, фильтрация и отстаивание должны предшествовать замораживанию.

7.5.1.2. Подготовка проб воды к биотестированию

Перед биотестированием предварительно охлажденные или замороженные пробы доводят до температуры 20 +/- 2 °C.

При наличии в сточных водах крупнодисперсных включений необходима фильтрация пробы через наиболее пористые обеззоленные фильтры "белая лента" (недопустимо использовать "синюю ленту", так как она задерживает коллоидные вещества, что занижает результаты биотестирования).

Природные воды фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор 3,5 мкм (фильтр перед применением должен быть промыт и простерилизован кипячением в дистиллированной воде не менее 10 мин.) или через обеззоленные фильтры "белая лента".

Активный хлор, используемый для обеззараживания питьевых и сточных вод, является токсическим веществом, поэтому перед биотестированием питьевых вод, а также при необходимости анализа сточных вод после системы хлорирования хлор следует удалить из исследуемой воды отстаиванием пробы с открытой крышкой при температуре от +2 до +4 °C не менее 24 часов.

Проба воды, подлежащая биотестированию, должна иметь pH 7,0 - 8,2, если pH пробы выходит за указанные пределы, перед серийным разбавлением воду нейтрализуют. Подкисление осуществляют 10%-ным раствором HCl, подщелачивание - 10%-ным раствором NaOH. После нейтрализации пробы аэрируют 10 - 20 мин. для стабилизации pH. Доведение pH до указанных значений необходимо, чтобы исключить смертность или снижение плодовитости дафний, вызванные водородным показателем, а не токсичностью. Регулирование pH не должно вызывать химической реакции с веществами, присутствующими в пробе (выпадение осадка, комплексообразование) и не должно более чем на 5% изменять концентрацию исследуемых вод.

При исследовании грунтовых или других вод с содержанием железа двухвалентного более 1 мг/куб. дм (валовая форма) необходимо предварительное отстаивание проб не менее 24 часов при температуре от +2 до +4 °C. Осветленная вода сифонируется и анализируется на токсичность.

Биотестируемая проба воды должна иметь концентрацию растворенного кислорода не ниже 6 мг/куб. дм, в противном случае пробу аэрируют при помощи аквариумного компрессора перед процедурой биотестирования.

7.5.1.3. Приготовление разбавлений исследуемых вод для биотестирования

Для приготовления разбавлений исследуемых вод используется культивационная вода. Предварительно, перед приготовлением необходимых разбавлений вод для исследования, подготавливают соответствующей емкости посуду, в которой будут готовить растворы. Объем используемой посуды должен на 1/3 превышать необходимый объем приготавливаемого разбавления исследуемых вод.

Перед приготовлением разбавлений нужно подготовить по возможности два одинаковых сосуда: один для разбавления, а другой для хранения раствора (может случиться, что в ближайшие часы процедуру биотестирования в определенном разбавлении необходимо будет повторить). Как во время приготовления разбавления, так и при их хранении бутыли или другая посуда обязательно должны быть закрыты предварительно подобранными пробками и снабжены надписями о приготовленной концентрации исследуемых вод. Приготовление растворов, разбавлений, проведение биотестирования выполняются при комнатной температуре. Температура культивационной и исследуемой воды должна быть также доведена до комнатной температуры перед приготовлением разбавления.

Для приготовления разбавлений берут определенные, отмеренные мерной посудой, объемы исследуемых проб воды. Для объемов меньше 10 куб. см используются мерные пипетки. Для объемов более 10 куб. см - мерные цилиндры. Поверхностные, пресные, грунтовые и сточные воды с неизвестной степенью токсичности анализируются в 100, 30, 9, 3 и 1%-ной концентрациях. Сточные и очищенные сточные воды (отобранные до системы хлорирования), если не известны их токсические свойства, тестируются в первичном испытании в большем наборе разведений при 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,5, 0,78%-ной концентрации. Если предварительно известно, что сточные воды обладают гипертоксичностью, а также если это можно предположить по данным гидрохимического исследования, исследуемые концентрации уменьшаются и составляют 10, 3, 0,3, 0,1%. Возможен произвольный выбор разведений. Чем выше предполагаемая токсичность, тем большей должна быть кратность разбавлений исходной пробы.

После получения предварительных результатов биотестирования при необходимости готовятся и анализируются дополнительные разбавления.

Если при первичном токсикологическом испытании разбавление сточных вод делается в стандартных (предложенных выше концентрациях) или наугад, то при повторном исследовании разбавления готовят, исходя из полученных результатов проведенных исследований.

В процессе приготовления разбавлений пробы тщательно перемешивают.

При выполнении практического биотестирования используют в основном два (наиболее важных) показателя, характеризующих содержание исследуемой воды в разбавленном (культивационной водой) растворе: во сколько раз исследуемая вода разбавлена и каково ее процентное содержание в разбавлении. Данные показатели заносят в рабочий журнал (см. Приложение 2).

7.5.2.1. Отбор, транспортировка и хранение проб почвы

Методы отбора, транспортировки, хранения, подготовки к выполнению биотестирования должны обеспечить неизменность состава проб почвы в интервале времени между отбором и их анализом.

Отбор проб грунта, транспортировка и хранение осуществляются в соответствии с ГОСТ 12071-84 "Грунты. Отбор, упаковка, транспортирование и хранение образцов", ГОСТ 27753.1-88 "Грунты тепличные. Методы отбора проб".

Отбор проб почвы, их транспортировка и хранение осуществляется в соответствии с ГОСТ 17.4.3.01-83 "Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 17.4.4.02-84 "Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа", ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб".

При отборе проб почвы должна быть определена протяженность и топография зон загрязнения. Участки для отбора проб почвы должны хорошо отражать структуру района исследования: почвенный покров, материнскую породу, рельеф, геологические и гидрологические характеристики.

Необходимым условием отбора проб почвы является предохранение их от вторичного загрязнения (в том числе атмосферных осадков) на всех этапах отбора и подготовки проб к биотестированию.

Для сравнимости результатов необходимо, чтобы приемы выбора пунктов и способ отбора проб почвы были идентичны при каждом исследовании почвы на токсичность.

Для характеристики загрязнения почвы на определенной площади отбираются объединенные пробы почвы. Объединенную пробу составляют путем смешивания единичных проб почвы, отобранных в разных точках данной пробной площадки размером не менее 10 х 10 м (100 кв. м) которая располагается в типичном для данной территории месте. На каждые 20 га площади закладывается не менее одной пробной площадки. При обследовании площади менее 0,5 га размер площадки уменьшается и составляет 5 х 5 м.

Объединенную пробу составляют из 5 - 10 или 15 - 20 единичных проб (в зависимости от однородности исследуемого участка), равномерно размещенных на пробной площадке. Объем единичных проб почвы должен быть одинаков, поэтому для пробоотбора лучше использовать почвенный щуп. Щуп - это узкий металлический желоб, заостренный с одного конца и имеющий рукоятку для удобства пользования. Примерные размеры щупа: длина 1,25 - 1,5 м; диаметр 15 - 20 мм. Желоб в щупе составляет 3/4 его общей длины.

Взятие смешанного образца проводится следующим образом: лопатой делается прикопка на глубину до 30 - 40 см, отмечается мощность и цвет верхнего горизонта или слоя и изменения в цвете и состоянии от поверхности вглубь, после чего со стенки берется образец на полную глубину горизонта (слоя) массой 1 - 2 кг, предварительно очистив поверхность почвы от растений. Отбирается также образец поверхностной пробы до глубины 5 - 10 см той же массы.

Единичные пробы ссыпают на крафт-бумагу или клеенку, тщательно перемешивают, квартуют (сокращают) в 3 - 4 раза (почву разравнивают на бумаге в виде квадрата, делят на четыре части, две противоположные части отбрасывают, две оставшиеся части перемешивают). Оставшуюся после квартования почву делят на 6 - 9 квадратов, из центра которых отбирают примерно одинаковое количество почвы, обеспечивая захват всей толщины слоя, в банки из стекла с герметичной крышкой, таким образом получают объединенную пробу, масса которой приблизительно 2 кг (1 кг на анализ и 1 кг для хранения дубликата). При отборе проб почвы составляют протокол по утвержденной форме (см. Приложение 1), в котором указывают цель пробоотбора, число, время, место отбора пробы, номер пробы, ставят подпись и расшифровывают подпись отбиравшего. На банку, контейнер наклеивают этикетку с указанием номера пробы, места, даты и времени ее отбора.

Транспортируют пробы при температуре окружающего воздуха от +4 до +28 °C.

Пробы, поступающие в лабораторию, должны быть зарегистрированы в журнале учета с обязательным указанием числа емкостей и номера протокола отбора проб для каждой пробы.

Пробы почв должны быть подвергнуты анализу не позднее 12 ч от момента отбора. При невозможности обеспечения данного условия, объединенные пробы в естественно влажном состоянии хранят в холодильнике (в банках с притертой или плотно завинченной крышкой) не более одной недели при температуре от +2 до +4 °C. Пробы почв не консервируют.

Для проведения контрольных измерений токсичности фоновых образцов почвы проводят отбор почвы на фоновых (незагрязненных) участках обследуемых областей.

При отборе проб почвы для приготовления фоновых образцов используют типичные для данного региона почвы, характерные по агрохимическим свойствам.

7.5.2.2. Приготовление водной вытяжки из почв

В лаборатории отобранные на токсикологический анализ почвы сначала разрыхляют вручную металлическим шпателем и освобождают от материала, заведомо относящегося к инородным (случайным) механическим включениям (возможные промышленные, строительные бытовые отходы и т.п.), а также галечника, обломков камней, корневищ, веток. Решение об изъятии таких включений из подготавливаемой пробы принимают на основе изучения полевого описания конкретного места ее отбора; эти сведения должны являться обязательной частью сопроводительной документации к пробам, направленным на токсикологический анализ.

Перед биотестированием пробы просеивают сквозь сито с размером ячей 1 мм и доводят до воздушно-сухого состояния. Для чего пробу подсушивают в вытяжном шкафу или в хорошо проветриваемом помещении, размещая ее (в зависимости от массы к естественной влажности) в стеклянных кристаллизаторах подходящей вместимости, на стекле или на чистых листах плотной бумаги.

Размещенные таким образом пробы почвы выдерживают открытыми не менее 2-х часов при комнатной температуре и влажности воздуха (ГОСТ 5180-84 "Грунты. Методы лабораторного определения физических характеристик"). Подготовленную пробу распределяют на ровной поверхности слоем толщиной не более 1 см и отбирают ложкой или шпателем из 5-ти точек методом конверта. Не допускается предназначенные для исследования на токсичность пробы почв подвергать тепловой обработке, поэтому гигроскопическая влажность почвы определяется в отдельном образце.

Проба с массой приблизительно 400 г делится на две равные части: для биотестирования и для определения гигроскопической влажности после высушивания до постоянной массы, что необходимо для пересчета воздушно-сухой пробы на массу абсолютно-сухой по формуле:

Для удаления углекислого газа из культивационной или дистиллированной воды ее предварительно обрабатывают по п. 7.2.

Для приготовления водной вытяжки из почвы отвешивают 100 - 200 г пробы почвы в воздушно-сухом состоянии, пересчитав ее массу на массу абсолютно-сухой. Масса пробы на стадии перед приготовлением водной вытяжки должна быть достаточной для получения необходимого объема экстракта при проведении биотестирования во всех предполагаемых разведениях с учетом контрольных испытаний. Навеску почвы помещают в колбу емкостью 1000 куб. см и приливают 4-кратное количество культивационной воды.

Далее на аппарате для встряхивания жидкости полученную смесь в течение 2-х часов встряхивают, после чего отстаивают в течение 30 мин. Надосадочная жидкость сифонируется, а затем профильтровывается через бумажные обеззоленные фильтры "белая лента" или через мембранные фильтры с диаметром пор 3,5 мкм (фильтры предварительно промывают и кипятят в дистиллированной воде не менее 10 мин.). Бумажный фильтр помещают в воронку Бюхнера диаметром 15 - 20 см.

Перед тем как вылить вытяжку на фильтр, содержимое склянки или колбы встряхивают, чтобы взмутить присутствующие взвешенные частицы почвы. На фильтр стараются перенести всю взвесь. При выливании струю суспензии направляют на боковую двойную стенку бумажного фильтра, но не на дно фильтра, так как при выливании на дно бумага может легко порваться. Фильтрация осуществляется с помощью вакуумного водяного или электрического насоса. Для фильтрации применяется слабый вакуум (не более 20 мм рт. ст.). Первые порции фильтрата часто бывают мутными и их нужно несколько раз перефильтровать до прозрачного раствора.

При повышенной мутности водной вытяжки из почв (гумусированные, дерново-подзолистые, торфяные и пр. почвы) допускается отстаивание в холодильнике до 5 суток. Затем жидкость над осадком сифонируется. Вытяжка из почв должна иметь величину pH в диапазоне 7,0 - 8,2. При необходимости вытяжку перед серийным разбавлением предварительно нейтрализуют. После нейтрализации пробы аэрируют 10 - 20 мин. для стабилизации pH. Непосредственно перед началом биотестирования пробы доводят до температуры 20 +/- 2 °C. Биотестируемая проба водной вытяжки из почв должна иметь концентрацию растворенного кислорода не ниже 6 мг/куб. дм, в противном случае пробу аэрируют.

Приготовление разведений водной вытяжки для биотестирования проводят по п. 7.5.1.3.

7.5.3.1. Отбор, транспортировка и хранение проб

Методы отбора, транспортировки, хранения, подготовки к выполнению биотестирования должны обеспечить неизменность состава проб осадков, отходов в интервале времени между отбором и их анализом.

Отбор проб осадков сточных вод на песковых, шламовых, иловых площадках производится следующим образом.

Если осадок на площадке представлен однородной массой, площадку следует разделить на 4 равные части. Отобрать 4 пробы из центра каждого квадрата лопатой послойно с глубины 0 - 5 см, 5 - 10 см и до конечной глубины площадки (до песка или бетонного покрытия) не менее 1000 г каждой пробы.

Если осадок на площадке находится в твердом и жидком состоянии, отбор осуществляется из разных участков, разделяя их на квадраты и отбирая из центра каждого квадрата твердые осадки, как описано ранее, а жидкие - пробоотборником с разной глубины заполненной жидкими осадками площадки из 3 горизонтов: с поверхности, середины и со дна заполнения. Жидкие и твердые осадки отбираются в разные емкости.

Жидких осадков отбирают 2 куб. дм (1 куб. дм для анализа и 1 куб. дм для хранения дубликата).

Пробы твердых осадков тщательно перемешивают и 3 - 4 раза квартуют как указано для почв. Вес объединенной пробы должен быть 2 кг (1 кг для анализа и 1 кг для хранения дубликата).

Пробы осадков сточных вод не подлежат консервированию.

Пробы осадков сточных вод, поступившие в лабораторию на исследование, должны быть документально оформлены и маркированы. Необходимыми сопроводительными документами являются бланк описания осадка и протокол пробоотбора (см. Приложение 1).

Пробы, поступающие в лабораторию для исследования на токсичность, должны быть зарегистрированы в журнале учета с обязательным указанием числа емкостей и номера протокола отбора проб для каждой пробы.

Хранить пробу можно в холодильнике не более одной недели в стеклянной банке с притертой или плотно завинченной крышкой.

Пробоотбор отходов может быть связан с отбором следующих групп отходов, классифицируемых: а) по типу образования: отходы производства (промышленные/производственные отходы - ПО), отходы потребления (твердые бытовые отходы - ТБО), смешанные отходы (смесь ПО и ТБО); б) по агрегатному состоянию: твердые (пылеобразные, порошкообразные, зернистые, шлаки, гранулированные, кусковые), пасто-, смоло- и студнеобразные (текучие, пластичные, вязкие), полужидкие (шламообразные), эмульсии, суспензии, пульпы жидкие; в) по степени однородности: гомогенные и гетерогенные.

Время взятия и периодичность пробоотбора отходов имеет существенное значение для производств, использующих сырье переменного состава или перешедших на иной вид сырья, изменяющих технологический режим процесса или его технологическую (конструкционную) схему, а также для органических ПО и ТБО. При осуществлении производственного экологического контроля за отходами частота отбора проб определяется планом-графиком, согласованным с территориальными органами государственного контроля.

Отбор проб ПО производят не реже 1 раза в год при условии неизменности технологического процесса и используемого сырья, а также в любое другое время для осуществления контрольных проверок возможных технологических сбоев. При переходе на иные сырьевые ресурсы или при изменении технологии вновь образующиеся отходы нуждаются в установлении нового класса токсичности (опасности) по результатам нового пробоотбора.

Отбор проб ТБО, а также отходов, образующихся при их сжигании (инсинерации, пиролизе) и компостировании, необходимо проводить на предприятии не реже 4 раз в год (1 раз в квартал).

Отбор проб ПО может осуществляться периодически и непрерывно. Выбираемый способ пробоотбора зависит от количества образующегося отхода в единицу времени (за один производственный цикл, сутки, год), аппаратурного оформления технологического процесса, методов сбора и накопления отхода, предполагаемой токсичности (на основании сопоставления с изученными отходами аналогичных производств).

При периодическом пробоотборе объединенная проба образуется из нескольких точечных проб, отобранных в одно и то же время из одного и того же источника образования или накопления отходов (из бункера, хвостохранилища, ковша, шламонакопителя, отвала, свалки, карьера и др.). Единичные пробы отбираются в местах хранения или захоронения отходов по равномерной сети опробования.

Отбор проб производят из горных выработок (расчисток, закопушек, канав, шурфов) или скважин, пройденных с помощью буровых станков, установок или приспособлений различных конструкций. Кроме того, в местах хранения отходов, являющихся источником образования пыли, проводят измерения загрязнения воздушной среды.

В зависимости от целей исследования различают периодический пространственный, периодический глубинный и периодический смешанный пробоотбор. При периодическом пробоотборе, как правило, имеют дело с большим исходным объемом отхода (более 1 т).

Для осуществления пространственного пробоотбора намечают пробную площадку в виде квадрата со сторонами не менее 10 м. Затем отбирают с поверхности по схеме конверта 5 единичных проб (ГОСТ 17.4.4.02-84). На каждые 20 га накопителя (хранилища, свалки) закладывают не менее одной пробной площадки. Если территория накопителя составляет менее 0,5 га, размер пробной площадки должен быть не менее 5 х 5 м. Из единичных проб, отобранных с одной пробной площадки, приготавливают одну объединенную промежуточную пробу. Смесь объединенных промежуточных проб образует объединенную пробу, направляемую на исследование.

Осуществляя глубинный пробоотбор, руководствуются ориентировочной глубиной хранилища и количеством одноразово загружаемых в него отходов.

Смешанный пробоотбор заключается в отборе проб из кучи. При отборе проб из кучи рекомендуется отбирать одну единичную пробу с ее вершины (если это возможно осуществить), не менее четырех единичных проб из равноудаленных друг от друга точек основания кучи и произвольное количество точечных проб с ее боковой поверхности. Общее число проб, отбираемых из кучи высотой до 2 м, должно быть не менее 9. При увеличении высоты кучи на 1 м минимально необходимое число проб увеличивается на 4.

При непрерывном пробоотборе объединенная проба отхода образуется из нескольких (не менее 2-х) единичных проб, отобранных в одном и том же месте через одинаковые промежутки времени (час, сутки, месяц).

Количество отбираемых отходов может выражаться в единицах массы (грамм, килограмм) или в единицах объема (литры). Единицы массы используются для характеристики количества твердых сыпучих отходов. Единицы объемы наиболее применимы для выражения количеств жидких и полужидких отходов. Количество пастообразных отходов может быть охарактеризовано как единицами массы, так и единицами объема.

Количество и необходимый объем оттираемой пробы отхода зависит от его агрегатного состояния, влажности, степени однородности и его зернистости (для сыпучих отходов).

Объединенная проба отхода может быть приготовлена из N-го количества единичных проб или из N-го количества объединенных промежуточных проб (в случае закладки нескольких пробных площадок на территории протяженных хранилищ). Недопустимо образование объединенной пробы одновременно из единичных и объединенных промежуточных проб.

Объединенная проба отхода может быть приготовлена по принципу средневзвешенности или среднепропорциональности.

По принципу средневзвешенности объединенная проба отхода образуется путем смешения одинакового массового количества вещества. Обычно так поступают, имея дело с сыпучими твердыми и пастообразными отходами с влажностью от 30 до 70%.

По принципу среднепропорциональности объединенная проба приготавливается из одинаковых объемов отходов. Наиболее часто таким образом готовят пробу полужидких отходов и паст с высокой влажностью (> 70%).

Единичные пробы отходов перед объединением тщательно гомогенизируют. Обращаясь с твердыми сыпучими и пастообразными отходами, используют металлические шпатели. Полужидкие отходы гомогенизируют встряхиванием.

Для механизированной проходки скважин применяют буровые станки и установки различных способов бурения (вращательного, ударно-канатного, пневмоударного, шнекового) и самых различных конструкций, обеспечивающих представительный отбор проб. Шурфы также могут проходиться механизированным способом.

Для ручной проходки скважин применяют буры и щупы различных конструкций.

Отбор единичных проб проводят по равномерной сетке, размер которой выбирают в соответствии с нормативными документами, действующими на предприятии, на котором образуется отход, или определяется необходимым числом единичных проб. Число единичных проб рассчитывается, исходя из степени изменчивости нормируемых компонентов в данных отходах и заданной погрешности их определения.

Иногда, для подтверждения представительности выбранных точек пробоотбора, производят выборочное обследование точек пробоотбора.

Отбор сыпучих отходов из тары (вагон, кузов автомобиля, контейнер и др.) производят с помощью щупа. Отбор единичных проб производится погружением щупа в опробуемую массу до середины или на всю высоту тары.

Масса единичных проб устанавливается в зависимости от состава опробуемого отхода и размера максимальных частиц (кусков). Расхождение по массе отдельных единичных проб не должно превышать 20%.

Отобранные единичные пробы соединяют в объединенную пробу или сразу после пробоотбора, или после отдельной их подготовки до определенного этапа квартования, а затем объединяют в нужных пропорциях.

Сокращение пробы в зависимости от исходной массы объединенной пробы и размера частиц (кусков) проводят строго по выбранной схеме сокращения.

Для сокращения объединенной пробы применяют метод квартования с предварительным сбрасыванием на конус. Объединенная проба отхода (при отсутствии специальных требований) должна составлять не менее 5 кг (2,5 кг для анализа и 2,5 кг для хранения дубликата).

Пробы отходов не подлежат консервированию. Пробы отходов хранят в холодильнике (в банках с притертой или плотно закрытой крышкой) не более одной недели.

Пробы отходов, поступившие в лабораторию на исследование, должны быть документально оформлены и маркированы. Необходимыми сопроводительными документами являются бланк описания отхода и протокол пробоотбора (см. Приложение 1). Маркировка отходов осуществляется в произвольной форме, но с обязательным занесением обозначений в лабораторный журнал.

При проведении отбора проб отходов должны соблюдаться меры, исключающие загрязнение окружающей среды от применения бурового оборудования. Контроль за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88. При подготовке проб должны соблюдаться меры, исключающие запыление окружающей среды, и правила захоронения (складирования) материала пробы, полученного в результате сокращения объединенной пробы.

7.5.3.2. Приготовление водной вытяжки из осадков сточных вод, отходов

Водная вытяжка из осадков сточных вод и отходов готовится из соотношения твердая фаза:жидкость равного 1:10. В качестве жидкости используется культивационная вода (допускается использование дистиллированной воды).

Твердые отходы и осадки сточных вод. Проба тщательно перемешивается перекатыванием на гладкой, гибкой и плотной подстилке, затем - совком. Для пробоподготовки пробы отходов требуется 2,5 кг, пробы осадков сточных вод - 1 кг. Общий объем отобранной пробы (5 кг отходов или 2 кг осадков) делится на представительные половины, одна из частей возвращается в сосуд для хранения, оставшаяся часть разрыхляется и тщательно просматривается. В случае обнаружения частиц более 10 мм их осторожно измельчают с помощью металлического шпателя до размера менее 10 мм. Недопустимо механически размалывать смесь. Затем проба высушивается до воздушно-сухого состояния, как указано в п. 7.5.2.2. При плохом высыхании отхода экспозицию высушивания допускается увеличивать до 24 часов.

После этого проба сокращается 3 - 4 раза методом квадратирования. Тщательно перемешанную пробу разравнивают на гладкой ровной поверхности на крафт-бумаге, клеенке или полиэтиленовой пленке и с помощью линейки или специальной решетки делят на равные квадраты. Затем из квадратов в шахматном порядке отбирают порции, обеспечивая захват всей толщины слоя и объединяя порции в пробу с минимальной абсолютно-сухой массой 200 г представительной пробы, которая делится на две части и предназначается для биотестирования и определения влажности.

Влажность осадков и отходов определяется по п. 7.5.2.2. Измеренная характеристика влажности используется для расчета массы воздушно-сухой пробы, предназначенной для приготовления водной вытяжки. Обычно требуется 120 - 200 г воздушно-сухой массы пробы. После выщелачивания 100 г абсолютно-сухой массы пробы будет получено приблизительно 900 куб. см водной вытяжки, учитывая это, следует рассчитать общее необходимое минимальное количество отбираемой порции с учетом процедуры сокращения пробы. Масса пробы на стадии перед приготовлением водной вытяжки должна быть достаточной для получения необходимого объема экстракта для проведения биотестирования во всех предполагаемых разведениях. Проба осадков, отходов в воздушно-сухом состоянии взвешивается так, чтобы абсолютно-сухая масса была 100 +/- 1 г. Записывается масса и содержание влаги и помещается в сосуд для выщелачивания.

Шламы. Шламы с большим содержанием твердой фазы, не разделяющиеся самостоятельно, обрабатываются так же, как твердые отходы. Отдельно определяется содержание влаги. Масса шлама, эквивалентная 100 +/- 1 г абсолютно-сухой массы используется для приготовления водной вытяжки.

Шламы с большим содержанием жидкости (влажность более 70%) обрабатываются следующим образом. Жидкость фильтруется через вакуумный фильтр (0,45 мкм) и собирается 300 г влажно-твердого материала. Если такого количества пробы недостаточно для получения 200 г абсолютно-сухого вещества, собирается столько, сколько необходимо. Пробы высушиваются до воздушно-сухого состояния по п. 7.5.2.2. При плохом высушивании экспозицию допускается увеличить до 24 ч.

Проба делится на две части, в одной определяется содержание влаги, а другая часть, составляющая 100 +/- 1 г абсолютно-сухой массы, переносится в сосуд для выщелачивания. В рабочем журнале регистрируется масса остатка и содержание влаги в нем. Твердые шламы выщелачиваются культивационной водой в пропорции 1:10.

Жидкие отходы. Отходы и осадки сточных вод, жидкие и содержащие менее 1% взвешенного материала не подвергаются выщелачиванию, а испытываются прямо на экотоксичность методами биотестирования после фильтрации через фильтр "белая лента".

Выполнение процедуры подготовки экстракта выщелачивания. В сосуд для выщелачивания, где находится взвешенная воздушно-сухая масса отхода или осадка сточных вод с абсолютно сухой массой 100 +/- 1 г, добавляется вода, используемая для культивирования (или дистиллированная вода). Вода добавляется в сосуд для выщелачивания в соотношении сухая масса:жидкость - 1:10. Обычно это 1000 куб. см воды на 100 г абсолютно-сухой массы. Если используется меньшее количество пробы, уменьшается количество жидкости. Нельзя использовать для выщелачивания менее чем 20 г твердого вещества и 200 куб. см воды.

Объемы воды более 10 куб. см измеряются мерным цилиндром, объемы меньше 10 куб. см - мерной пипеткой.

Смесь должна перемешиваться слабо на мешалке в течение 7 - 8 часов таким образом, чтобы твердое вещество находилось во взвешенном состоянии. Недопустимо измельчение частиц отходов или осадков при перемешивании. Используется большая лопасть механической мешалки или магнитная мешалка, а скорость перемешивания должна быть наименьшей, при которой материал поддерживается во взвешенном состоянии (не более 70 об./мин.).

После окончания перемешивания раствор с осадком оставляют на ночь (12 - 18 ч) для отстаивания. Затем жидкость над осадком сифонируется.

Если после отстаивания жидкость становится прозрачной, фильтрование не требуется: если же имеется какой-либо видимый взвешенный материал, то жидкость должна быть профильтрована. В случае применения фильтрования это отмечается в рабочем журнале. Фильтрация осуществляется через фильтр "белая лента" на воронке Бюхнера. Для фильтрации применяется слабый вакуум (не более 20 мм рт. ст.) с помощью водяного или электрического насоса такой же мощности. Вакуум должен быть выключен немедленно после прохождения всей жидкости через фильтр, во избежание дегазации фильтрата. В исключительных случаях, при повышенной мутности водной вытяжки из отхода после фильтрации допускается ее отстаивание в холодильнике до 5 суток. Затем жидкость над осадком сифонируется.

Полученный экстракт выщелачивания исследуют на токсичность. Процедуру биотестирования необходимо начать не позднее чем через 6 ч после приготовления вытяжки из осадка, отхода. Если это невозможно, допускается хранение экстракта в холодильнике не более 48 ч при температуре 4 °C.

Водная вытяжка из осадков сточных вод или отходов должна иметь pH = 7,0 - 8,2. При необходимости пробы нейтрализуют. После нейтрализации пробы аэрируют 10 - 20 мин. для стабилизации pH. Перед биотестированием температуру пробы доводят до 20 +/- 2 °C. Биотестируемая проба водной вытяжки из осадков и отходов должна иметь концентрацию растворенного кислорода не ниже 6 мг/куб. дм, в противном случае пробу аэрируют. Данные регистрируют в журнале. Приготовление разведений водной вытяжки для биотестирования проводят по п. 7.5.1.3.

Если осадки сточных вод или отходы были разделены на жидкую и твердую фракции, результаты исследования жидкой фракции и экстракта выщелачивания из твердой фракции должны быть указаны в отчете отдельно. Если одна из этих частей была признана экотоксичной, экотоксичным признается весь отход.

Для решения вопроса о возможности отнесения установленного класса опасности осадка или отхода к менее опасному водную вытяжку осадка или отхода исследуют на устойчивость к биохимической деградации. Тест на устойчивость к биохимической деградации проводится в аэробных условиях в контакте вытяжки из осадка или отхода с активным илом в течение 28 дней.

Активный ил отбирается на сооружениях биологической очистки с аэротенками в объеме 100 - 300 куб. см. В лаборатории он отстаивается не менее двух часов (или центрифугируется), после чего надиловая жидкость сливается при помощи сифона.

В сосуд, в котором проводится тест на биохимическую разлагаемость, добавляется сгущенный активный ил в расчете 1,0 г/куб. дм по сухому весу.

Сосуд с приготовленной смесью ила и исследуемой водной вытяжкой инкубируется в темноте или при слабом дневном свете при температуре 22 +/- 3 °C. Смесь аэрируется с помощью аквариумного аэратора так, чтобы перемешивание было удовлетворительным, но не избыточным (взвешенные частицы не адсорбируются на дне и стенках сосуда, жидкость не выплескивается).

Через 28 суток инкубации смесь водной вытяжки с илом отстаивается в течение 2-х часов, сливается сифоном и в надиловой воде определяется ХПК в натуральной и фильтрованной пробе.

Отход признается подверженным биохимическому разложению, если по истечении 28 дней ХПК в натуральной пробе снижается не менее чем на 60%, ХПК в фильтрованной пробе снижается не менее чем на 70% (Европейское соглашение.., 1998).

Вся грязная посуда после проведения теста должна подвергаться стерилизации кипячением в течение 1 часа или автоклавированию.

8.1.1. Для определения острого токсического действия проводится биотестирование исходной исследуемой воды или водной вытяжки из почв, осадков сточных вод, отходов и нескольких их разбавлений, приготовленных по п. 7.5.1.3.

Определение токсичности каждой пробы без разбавления и каждого разбавления проводится в трех параллельных сериях. В качестве контроля используются три параллельные серии с культивационной водой.

Биотестирование проводится с соблюдением требований к температуре, продолжительности фотопериода и качеству культивационной воды по пунктам 7.2, 7.3.2.

Биотестирование проводится в химических стаканах объемом 150 - 200 куб. см, которые заполняются 100 куб. см исследуемой воды, в них помещают по десять дафний в возрасте 6 - 24 ч. Чувствительность дафний к токсикантам зависит от возраста рачков, поэтому в протоколе отмечают возраст используемой молоди. Возраст определяется по размеру рачков и обеспечивается фильтрацией рачков через набор сит по п. 7.3.3. Дафний отлавливают из культиваторов, в которых выращивается синхронизированная культура. В отдельный химический стакан отсаживают одновозрастных рачков после фильтрации их через набор сит, а затем отлавливают по одному пипеткой (с отпиленным и оплавленным концом) объемом 2 куб. см с резиновой грушей, помещают рачков по одному на сачок, через который вода сливается в отдельный химический стакан, после чего дафний сачком вносят в стаканы с исследуемой водой.

Посадку рачков начинают с контрольной серии. В исследуемые растворы дафний помещают, начиная с больших разбавлений (меньших концентраций загрязняющих веществ) к меньшим разбавлениям. После каждой посадки в исследуемые растворы сачок тщательно промывается в сосуде объемом 2 куб. дм с культивационной водой. Для работы с серией контроля должен быть отдельный сачок.

Для каждой серии исследуемой воды используется 3 химические стакана. Общее количество стаканов, используемых в опытах, равно утроенной сумме всех разбавлений плюс 3 для исходной воды и 3 для контроля.

В экспериментах по определению острой токсичности дафний кормят перед началом эксперимента, в последующие сутки ежедневно по пункту 7.4.4.

В экспериментах по определению острой токсичности растворы не меняют.

Учет смертности дафний в опыте и контроле проводят через каждый час до конца первого дня опыта, а затем 2 раза в сутки ежедневно до истечения 96 часов.

Неподвижные особи считаются погибшими, если не начинают двигаться в течение 15 секунд после легкого покачивания стакана.

Результаты наблюдений заносят в рабочий журнал (см. Приложение 2).

Если гибель дафний в контроле превышает 10%, результаты опыта не учитывают и он должен быть повторен.

8.1.2. После того как результаты эксперимента учтены, все дафнии из стаканов выбрасывают и в каждом стакане проводят измерения pH, температуры, содержания растворенного кислорода с помощью оксиметра. Содержание растворенного кислорода в конце эксперимента должно быть не ниже 2 мг/куб. дм, pH в диапазоне 7,0 - 8,2. Все отклонения от установленных норм, а также данные по каждой серии разбавлений, исходной воды и контролю также заносят в рабочий журнал и протокол результатов эксперимента.

Для определения хронического токсического действия острый эксперимент продолжают с использованием контроля и серии разбавлений, в которых острое токсическое действие не проявилось или готовится новая серия разбавлений с учетом результатов острых опытов. За исходную воду принимают разбавление исследуемых вод, водных вытяжек из почв, осадков, отходов, не вызвавшее острого токсического действия. Продолжительность хронического эксперимента 24 дня.

Определение токсичности каждой пробы и каждого разбавления проводят в 3-х параллельных сериях, что сопровождается одной для всех разбавлений серией контроля в 3-х стаканах.

Процедуру приготовления растворов и посадки рачков в эксперимент по определению хронического токсического действия проводят по п. 8.1.1.

Биотестирование по определению хронического токсического действия проводят с соблюдением требований к температуре, продолжительности фотопериода и качеству культивационной воды по пунктам 7.2, 7.3.2. Вынужденное нарушение требуемых условий следует отмечать в протоколе.

В экспериментах по определению хронического токсического действия кормят дафний перед началом эксперимента и в последующие дни один раз в сутки по пункту 7.4.4.

Смена растворов на новые осуществляется через каждые пять суток из свежеотобранных проб или из проб, хранящихся в холодильнике при температуре от +2,5 до +4 °C.

Для смены растворов готовят 3 параллельных ряда испытуемых разбавлений (и контроль), аналогичных исходным, куда из старых растворов выжившие дафнии переносятся при помощи сачка, на который они помещаются пипеткой объемом 2 куб. см в свежеприготовленные растворы. Старые растворы профильтровывают через сито из мельничного газа и на нем производят подсчеты родившейся молоди, а в растворах проводят измерения физико-химических параметров по пункту 8.1.2. Содержание растворенного кислорода в конце хронического эксперимента должно быть не ниже 2 мг/куб. дм, pH в диапазоне 7,0 - 8,2. Все отклонения от установленных норм заносятся в рабочий журнал и протокол результатов эксперимента.

Учет смертности и родившейся молоди в опыте и контроле проводят один раз в сутки ежедневно до конца хронического опыта. Кроме подсчета погибших дафний учитывают количество молоди и абортивных яиц (половозрелые самки выбрасывают неразвившиеся зародыши при действии многих токсикантов). Погибших дафний, абортивные яйца, молодь подсчитывают и удаляют пипеткой, пропуская исследуемый раствор через сито над тем стаканом, в котором производится подсчет.

Прекращают эксперимент в стаканах с погибшей самкой. Родившуюся молодь подсчитывают (при помощи лупы или стереоскопического микроскопа) и выбрасывают.

Результаты экспериментов заносят в рабочий журнал (см. Приложение 2).

9.1.1. При определении острой токсичности питьевых, сточных, поверхностных, грунтовых вод, а также водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов и их разбавлений устанавливают:

Чтобы получить на графике линейную зависимость, используется пробит-анализ. Результат экспериментов по установлению острого токсического действия из рабочего журнала (см. Приложение 2) заносят в табл. 3. Значения пробитов устанавливают по табл. 4. В табл. 5 вносят значения пробитов для экспериментально установленного процента гибели дафний (см. табл. 3, 4) и значения десятичных логарифмов для исследованных концентраций сточных вод, водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов.

По значениям пробитов (см. табл. 4) и десятичных логарифмов от экспериментально полученных данных (табл. 3) строится график (рис. 1 - не приводится). По оси абсцисс откладываются значения логарифмов процентных концентраций исследуемых вод, по оси ординат - пробиты от значений процента гибели дафний. Экспериментально полученные значения вносятся в систему координат, и через точки проводится прямая.

По значениям пробитов и логарифмов чисел, взятых из таблицы 5, строится график (рис. 1).

Для нахождения точных значений величин логарифмов концентраций, соответствующих 50%-ному ингибированию тест-параметра, график строят в программе Excel (пакет Microsoft Office), указывая в опции "тип диаграммы" параметр "точечная". Уравнение прямой, описывающее взаимосвязь между этими величинами, получают следующим образом: в параметре "диаграмма" указывается команда "добавить линию тренда". В опции "линия тренда", "тип" указывается "линейная", в опции "линия тренда", "параметры" помечается галочкой окошко "уравнение на диаграмме".

Из полученного уравнения линии тренда получают значения величин x = lg C, соответствующие величинам y (значениям пробитов).

Все полученные значения, расчеты и график по результатам острого эксперимента вносят в рабочий журнал.

Хроническая токсичность устанавливается по двум параметрам: гибели 20% и более исследуемых тест-организмов и (или) по достоверному отклонению в плодовитости исследуемых тест-организмов по сравнению с контролем. Результаты хронического опыта заносят в таблицу, форма которой представлена в табл. 7.

Для оценки результатов используют следующие значения.

--------------------------------

<*> Рассчитывается на одну выжившую самку.

9.2.1. При определении токсичности отдельных веществ:

- устанавливают концентрацию вещества, вызывающую хроническую токсичность за 24 суток экспозиции, если смертность дафний составит 20% и более и (или) в их плодовитости будет установлено достоверное отклонение от контроля;

- безвредную концентрацию вещества, не вызывающую хроническую токсичность за 24 суток экспозиции, если смертность дафний составит менее 20% и (или) в их плодовитости не будет установлено достоверное отклонение от контроля.

9.2.2. При определении хронической токсичности вод, водных вытяжек, а также их разбавлений:

- устанавливают кратность разбавления вод, водных вытяжек, вызывающую хроническую токсичность за 24 суток экспозиции, если смертность дафний составит 20% и более и (или) в их плодовитости установлено достоверное отклонение от контроля;

- безвредную кратность разбавления вод, водных вытяжек, не вызывающую хроническую токсичность за 24 суток экспозиции, если смертность дафний составит менее 20% и (или) в их плодовитости не установлено достоверное отклонение от контроля.

9.2.3. Для определения хронической токсичности воды, водной вытяжки рассчитывают:

- процент погибших дафний в тестируемой воде для каждой серии разведений по сравнению с контролем;

- среднее количество родившейся молоди на одну самку делением общего числа молоди, родившейся за 24 дня на 30 (или выживших из 30) самок для каждой серии разведений;

- достоверное отклонение в количестве родившейся молоди на одну самку из числа выживших по отношению к контролю.

Для статистической обработки результатов необходимо провести расчеты для каждой серии разбавлений и контроля и сопоставить полученные результаты. Проводят следующие расчеты:

9.2.4. Для характеристики степени хронического токсического действия используют величину БКР (безвредная кратность разбавления, или кратность разбавления воды, водной вытяжки, при которой хроническое токсическое действие не проявляется).

9.2.5. По результатам определения острой и хронической токсичности вод ведутся записи в рабочем журнале (см. Приложение 2) и оформляется протокол биотестирования (см. приложение 3 - не приводится).

Процедура определения диапазона реагирования тест-организмов на модельный токсикант. Определяют ту концентрацию модельного токсиканта, при которой за 24 часа гибнет 50% подопытных организмов. Для этого на основании стандарт-титра методом последовательных разбавлений готовят серии растворов двухромовокислого калия в культивационной воде с концентрациями 0,5; 0,9; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 мг/куб. дм.

Испытания на дафниях проводят в соответствии с прописью методики.

Если концентрация двухромовокислого калия, вызвавшая острую токсичность, находится в интервале 0,9 - 2,0 мг/куб. дм, то чувствительность культуры дафний соответствует необходимым требованиям, и она может быть использована в биотестировании.

Если концентрация модельного токсиканта, вызвавшая острую токсичность, не находится в данном интервале, то следует проверить точность приготовления исследуемых растворов, условия проведения опытов. Если ошибки при проведении опытов исключены, необходимо сменить культуру тест-организмов, т.е. взять новую культуру в учреждениях, где она имеется.

В тех случаях, когда чувствительность дафний не укладывается в установленный диапазон по причине ухудшения качества водопроводной воды, используемой для приготовления культивационной воды, например, в период весенних паводков, то культура дафний не меняется. Проводятся мероприятия по улучшению качества культивационной воды, дополнительное отстаивание или фильтрование, аэрирование и т.д. В протоколах биотестирования в этот период указывается установленная концентрация модельного токсиканта, при которой гибнет 50% дафний за 24 ч экспозиции. После улучшения качества используемой культивационной воды чувствительность дафний к модельному токсиканту восстанавливается до установленной нормы через 1 - 2 недели.

Значения D для конкретного типа воды приведены в табл. 1 (п. 2.1). При превышении норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

Результат токсикологического анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

В качестве тест-объекта используется Daphnia magna Straus. Относятся к низшим ракообразным, отряду ветвистоусых. Дафнии обитают в планктоне стоячих и слабопроточных пресноводных водоемов, широко распространены на территории России.

Морфология. Тело дафний овальной формы, сжато с боков, заключено в прозрачный панцирь. Тело нечетко сегментировано на головной, грудной и брюшной отделы (рис. 2 - не приводится). Голова покрыта щитом, передний край которого вытянут, образуя рострум, под рострумом расположены две пары конечностей: антеннулы и антенны, последние сильно развиты, служат для скачкообразного перемещения в толще воды. Пять пар грудных конечностей сильно расчленены, снабжены щетинками, служат для фильтрации воды, питания, дыхания. Брюшной (абдоминальный) отдел туловища заканчивается постабдоменом, дорсальный край которого имеет выемку, характерную для дафний данного вида. Расположение внутренних органов представлено на рис. 2. В головном отделе, не покрытом раковиной, расположена пара глаз: большой - сложный, маленький - простой. Под панцирем дафний легко различимы сердце, кишечник, выводковая камера, которая находится в спинной части туловища. В выводковой камере протекает эмбриональное развитие дафний.

Рост, развитие и размножение. Наиболее интенсивно дафния растет первые дни после рождения, при каждой линьке сбрасывая старый панцирь. Оптимальное питание обеспечивает удвоение размеров рачков в промежутке между линьками. После наступления половой зрелости рост дафний замедляется, снижается и частота линек. Всего в течение жизни дафния может линять до 24 раз. Выметанная молодь имеет в длину 0,7 - 0,9 мм, половозрелые самки - 2,2 - 2,4 мм, самцы - 2,0 - 2,1 мм. Максимальные размеры самок - 6,0 мм при сыром весе 7 - 10 мг. В природе в летнее время, а в лаборатории при оптимальных условиях культивирования круглый год дафнии размножаются без оплодотворения - партеногенетически (рождаются только самки). При резком изменении условий существования или культивирования (похолодание, голод, перенаселенность и т.п.) в культуре появляются самцы. Самцы отличаются от самок меньшими размерами, видоизмененной формой тела, антеннул, постабдомена. Резкое изменение условий существования вызывает переход к половому размножению, дафнии откладывают "зимние яйца", размещающиеся в эффипиуме, образованном из части створок панциря. При очередной линьке эффипиум отделяется (в природе - осенью), падает на дно водоема, где яйца проходят стадию зимнего покоя. Весной из них появляются самки, снова переходящие к партеногенетическому размножению.

Период созревания рачков (при оптимальной температуре (+20 +/- 2 °C) и хорошем питании - 5 - 8 суток, длительность эмбрионального развития - 3 - 4 суток, а при повышении температуры до 25 °C - 46 часов. Затем происходит вымет молоди (партеногенетических самок) каждые 1 - 4 суток. Количество молоди у молодых самок - 10 - 15, у зрелых - 30 - 40 особей. В природе дафнии живут в среднем 20 - 25 суток, а в лаборатории при оптимальном режиме - 3 - 4 месяца и более. При температуре свыше 25 °C продолжительность жизни дафний может сокращаться до 25 суток. Голодание увеличивает продолжительность жизни, но задерживает рост и наступление линек.

Питание и отношение к содержанию кислорода. По характеру питания относятся к фильтраторам, а в природе дафнии питаются взвешенными в воде бактериями, одноклеточными водорослями, детритом, растворенными органическими веществами. Пища поступает с потоком воды, направленным грудными конечностями, через выросты - в брюшной желоб вдоль основания конечностей и ко рту рачка. Оптимальное для жизнедеятельности дафнии содержание растворенного в воде кислорода - 6 - 7 мг/куб. дм. Однако дафния достаточно устойчива к изменению кислородного режима и снижению растворенного в воде кислорода до 2 мг/куб. дм и ниже, что связано с ее способностью синтезировать гемоглобин. Повышенное содержание гемоглобина в крови дафний (при ухудшении кислородного режима) сопровождается окрашиванием рачков в красный цвет.