Методические рекомендации разработаны ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве", МГУ им. М.В. Ломоносова.

Методические рекомендации содержат описание метода тестирования моющих средств с применением в качестве тест-объекта реактива люминесцентных бактерий "Эколюм" и определяют порядок проведения испытаний следующих видов моющих средств.

Методические рекомендации предназначены для скрининговой оценки вновь разрабатываемой и серийно выпускаемой продукции с учетом общетоксического и раздражающего действия.

Методика может быть применена в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсиколого-гигиеническими методами.

Методические рекомендации предназначены для учреждений Государственной санитарно-эпидемиологической службы РФ, учреждений научно-исследовательского и практического профиля, осуществляющих разработку новых видов моющих средств и контроль их качества.

Результаты исследования качества моющих средств учитывают при определении уровня их возможного прямого или косвенного влияния на здоровье человека.

1. Закон РФ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 19 апреля 1991 г.

2. "Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании", утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 5 июня 1994 г. N 625

3. Руководство Р 1.1.001-96 "Общие требования к организации разработки нормативных и методических документов системы государственного санитарно-эпидемиологического нормирования"

4. Руководство Р 1.1.003-96 "Общие требования к построению, изложению и оформлению нормативных и методических документов системы государственного санитарно-эпидемиологического нормирования"

5. ГОСТ Р 1.5-92 "Государственная система стандартизации Российской Федерации. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов"

6. МУ 2196 "Методические указания к постановке исследований по изучению раздражающих свойств и обоснованию предельно допустимых концентраций избирательно действующих раздражающих веществ в воздухе рабочей зоны"

7. МР 11-1/131-09 "Определение токсичности химических соединений, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста"

8. МУ 2102 "Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно допустимых уровней загрязнений кожи"

9. МУ 1109 "Временные методические указания по гигиенической оценке и санитарному контролю за применением, хранением и продажей населению предметов бытовой химии"

Экотоксикологический государственный контроль осуществляется с целью регулярного слежения за соблюдением нормативов качества окружающей среды и предупреждения попадания токсических веществ в водные объекты.

Химическое загрязнение воды - изменение химического состава воды, возникшее под прямым или косвенным воздействием производственной деятельности и вызывающее снижение ее качества, и возможную опасность для здоровья населения.

Токсичность - степень проявления ядовитого действия разнообразных химических соединений и их смесей. Токсичность - один из важных факторов, определяющих качество воды, достаточно информативный, существенно дополняющий наше представление о степени опасности или безопасности воды при ее использовании, являющийся необходимой составной частью комплексной системы контроля при стандартном анализе воды.

Критерий токсичности (индекс токсичности) - достоверное количественное значение тест-параметра, на основании которого делается вывод о токсичности воды. Среди тест-параметров наиболее часто используются выживаемость, плодовитость, подавление ферментативной и метаболической активности организмов.

Тест-реакция - это изменение какого-либо биохимического, морфологического, поведенческого или функционального показателя у тест-объекта под воздействием токсиканта или их смесей.

Биотестирование - проведение анализов по определению токсичности с помощью живых организмов. Результаты оперативно сигнализируют об опасном воздействии химического загрязнения на жизнедеятельность организмов, причем не по отдельным компонентам, а по их смесям, часто неизвестной природы и не выявляемых другими методами анализа токсических веществ.

Токсические эффекты, регистрируемые методами биотестирования, включают комплексный, синергический, антагонистический и дополнительные воздействия всех химических, физических и биологических компонентов, присутствующих в исследуемой воде, неблагоприятно влияющие на физиологические, биохимические и генетические функции тест-организмов.

Биолюминесценция - интенсивное свечение в видимой области спектра, отражающее специфическую ферментативную функцию и общую метаболическую активность организмов.

В качестве тест-объекта используются препараты "Эколюм" лиофилизированных люминесцентных бактерий или ферментные препараты бактериальной люциферазы. Методика основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции бактерий при воздействии химических веществ, присутствующих в анализируемой пробе по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.

Критерием токсического действия является изменение с помощью прибора "Биотокс-10" интенсивности биолюминесценции тест-объекта под воздействием химических соединений, содержащихся в экстрактах ПК продукции по сравнению с раствором, не содержащей токсических веществ, или эталонной пробой. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.

При изучении токсикологических свойств бытовой химической продукции и ее химических ингредиентов люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с их действием на высшие животные, культуры клеток человека и другими биотестами.

Токсическое действие исследуемой пробы на биосенсор определяется по ингибированию интенсивности ее биолюминесценции за 30-минутный (в экспрессном варианте - 5 минут) период экспозиции. Количественные оценки тест-реакции выражаются в виде безразмерной величины - индекса токсичности "Т" и функциональными токсикологическими параметрами ЕС20 и ЕС50.

Индекс токсичности "Т", равный отношению

где Iо и I соответственно интенсивность биолюминесценции контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с бактериями.

Методика допускает три пороговых уровня индекса токсичности:

1) допустимая степень токсичности образца: индекс токсичности Т меньше 20;

2) образец токсичен: индекс Т равен или больше 20 и меньше 50;

3) образец сильно токсичен: индекс токсичности Т равен или более 50.

Токсикологические параметры пробы ЕС20 и ЕС50, определяемые также посредством измерения Iо и I, позволяют быстро и экономно выяснить вопрос при каких объемах исходного слабо токсического образца достигается установленный предел токсичности (ЕС20 и/или ЕС50) или при каких разведениях сильно токсический образец станет безопасным (величины менее ЕС20).

ЕС50 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением - концентрация), вызывающий тушение свечения биосенсора на 50% по сравнению с контролем. В этом случае образец сильно токсичен (индекс токсичности равен 50). ЕС20 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением - концентрация), который приводит к 20%-ному тушению свечения биосенсора по сравнению с контролем. В этом случае образец токсичен (индекс токсичности равен 20). Все значения величин менее ЕС20 свидетельствуют о том, что образец безвреден для человека.

Вычисление величин ЕС проводят с использованием гамма-функции. Гамма-функция (G) представляет собой зависимость отношения потери интенсивности свечения пробы к оставшейся интенсивности свечения пробы и описывается формулой:

где Iо и I соответственно интенсивность биолюминесценции в контроле и опыте. Функция G очень удобна для точного определения величин ЕС20 и ЕС50 путем экстраполяции графической зависимости в случаях, когда токсичность образца очень небольшая или, наоборот, когда образец высоко токсичен. График G-функции в логарифмических координатах как функция изменения объема пробы (или концентрации отдельного вещества) есть теоретически прямая линия молекулярности реакции токсического вещества с одной или несколькими мишенями, связывающими эти токсиканты в тест-объекте. Люминометр "Биотокс-10" позволяет представлять величины G для каждой пробы, а также автоматически вычисляет величины ЕС20 и ЕС50.

Количественным параметром токсичности моющих средств является степень разбавления образца по отношению к исходному продукту, приводящая к величине параметров ЕС20 (токсичности) и ЕС50 (острой токсичности). Количественным параметром оценки качества моющих средств по сравнению с эталоном этой продукции и оценки ингредиентов моющих средств служит индекс токсичности.

Измерительный прибор - люминометр типа "Биотокс-10" с набором кювет на 1,5 мл.

Лиофилизированная культура микроорганизмов "Эколюм" или ферментные препараты бактериальной люциферазы, ТУ 2639-236-00209792-01.

Весы аналитические с погрешностью взвешивания не более 1 мг, ГОСТ 24104-88.

pH-метр, ГОСТ 25.7416.071, или аналоги.

Сушильный электрический шкаф, ГОСТ 13474. Холодильник бытовой, обеспечивающий температуру от -18 до 4 °С.

Пробирки с притертыми пробками объемом 3 - 5 мл, ГОСТ 1770-74.

Дозаторы пипеточные на объемы 1,0 - 0,1 мл.

Цилиндры вместимостью 25, 50 мл, второго класса точности, ГОСТ 1770.

Воронки делительные на 100 мл, типа ВД-1-100.

Фильтры АФА-ВП-10, ТУ 95-743-80, или обеззоленные типа ФОБ, ТУ 6-09-1678.

Стаканчики для взвешивания диаметром 30, 40 мм, ГОСТ 7148.

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

Кислота соляная, ГОСТ 3118.

Натрия гидроокись, ГОСТ 4328.

Цинк сернокислый 7-водный, ГОСТ 4174.

Спирт этиловый, х.ч., ТУ 6-091710.

Кислота серная, ГОСТ 4204.

Биосенсор "Эколюм" представляет собой лиофилизированные люминесцентные бактерии или бесклеточные препараты, содержащие бактериальную люциферазу. Производится в соответствии с требованиями ТУ 2639-236-00209792-01 Биосенсор, содержащийся при температуре от -4 до -18 °С, имеет гарантированный срок хранения не менее 1 года.

Специализированный люминометр "Биотокс-10" является измерительным прибором, предназначенным для проведения токсиколого-гигиенического мониторинга объектов окружающей среды, с использованием микробных биолюминесцентных сенсоров серии "Эколюм". Сочетание биохимического датчика с современной электронной аппаратурой позволяет обнаруживать с высокой достоверностью чрезвычайно малые количества токсических соединений и их смесей. В приборе используется простая и надежная технология отбора и предъявления проб, которая безопасна при проведении экологической экспертизы в лабораторных условиях.

Портативный прибор "Биотокс-10" может осуществлять следующие функции в автоматическом режиме: определение интенсивности биолюминесценции тест-объекта, индекса токсичности пробы, усредненной величины индекса токсичности, вычисление стандартного отклонения показателя токсичности, определения величин ЕС20 и ЕС50 - пороговых значений допустимой степени и острой степени токсичности образца, исследование динамики процесса взаимодействия токсикантов с тест-объектом, компьютерная обработка данных, наличие сигнала для оператора при превышении пробой допустимого уровня токсичности.

При работе с химическими веществами необходимо соблюдать требования техники безопасности по ГОСТ 12.4.021.

Рабочие столы и поверхности должны содержаться в чистоте. В конце дня проводится влажная уборка рабочих поверхностей.

Безопасность при работе с электроустановками обеспечивается по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с требованиями инструкций к оборудованию.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

Используемые в качестве биотестов лиофилизированные бактерии не патогенны, однако после каждого анализа необходимо стерилизовать всю использованную посуду, остатки растворов в сушильном шкафу при 105 °С в течение 1 часа.

Хранить тест-культуру "Эколюм" в холодильнике при температуре от -18 °С до +4 °С, следует беречь культуру лиофилизированных бактерий от нагревания и резкой смены температуры.

Определение токсичности по настоящей методике выполняется оператором с квалификацией лаборант, имеющий опыт работы в области токсикологии.

Биотестирование проводится в нормальных лабораторных условиях в соответствии с ГОСТ 15150. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов.

Температура окружающего воздуха в лаборатории от +18 до 25 °С. Относительная влажность воздуха 80 +/- 5%. Атмосферное давление 84 - 106 кПа (630 - 800 мм рт. ст.). При использовании электроприборов частота переменного тока 50 +/- 1 Гц. Напряжение сети 220 +/- 10 В.

Освещение помещения естественное или искусственное, не ограничивается особыми требованиями.

Предварительная подготовка к отбору проб и выполнению биотестирования должна обеспечивать подготовку посуды, мест хранения отобранных проб, а также подготовку рабочего места для обработки проб и исследования их на токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключить попадание токсичных, органических и каких-либо других веществ в исследуемый образец.

Обычно используется посуда из стекла. Посуда для отбора проб и биотестирования должна быть химически чистой. Она промывается смесью бихромата калия и серной кислоты (хромовой смесью). Стенки посуды осторожно смачиваются хромовой смесью, после чего на 2 - 3 час. посуда оставляется, затем она тщательно промывается водопроводной водой, нейтрализуется раствором пищевой соды и промывается 3 - 4 раза дистиллированной водой. Для мытья посуды не разрешается пользоваться синтетическими поверхностно-активными веществами и органическими растворителями. Посуду для отбора проб сушат на воздухе, а используемую для биотестирования, за исключением мерной, - в сушильном шкафу при 105 °С в течение 1 часа.

Химически чистая посуда для биотестирования должна храниться с закрытыми стеклянными притертыми пробками или завинчивающими крышками в защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах и т.п.

Извлечение водорастворимых форм химических соединений из моющих средств. Экстракты из образцов готовят путем настаивания в дистиллированной воде. В сосуд помещают 1 мл жидкого образца (или 1 г порошкового образца) и заливают 10 мл дистиллированной воды (комнатная температура, pH 7,0 - 7,4) и выдерживают 10 мин. Рекомендуется периодическое встряхивание раствора. Затем отбирают 0,1 мл раствора в сосуд и добавляют 10 мл дистиллированной воды. Выдерживают 10 мин. Таким образом, получают "первичное" (1000-кратное) разбавление исходного образца.

Далее проводят дополнительное разведение экстракта дистиллированной водой, получая по 4 пробы при следующих отношениях экстракт:вода 1:1 (первичное разведение); 1:2; 1:4 и 1:8. Эта операция необходима для вычисления параметров ЕС.

Например, отбирают в пробирку с пробкой 5 мл образца первичного разведения (разведение 1:1), добавляют 5 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Получают пробу с разбавлением 1:2. Затем в другую пробирку отбирают 5 мл этого экстракта и добавляют 5 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Получают пробу с разбавлением 1:4. Потом в другую пробирку отбирают 5 мл этого экстракта и добавляют 5 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Получают пробу с разбавлением 1:8.

При исследовании отдельных ингредиентов моющих средств необходимо сделать 4 последовательных разведения дистиллированной водой, получая по 4 пробы при следующих отношениях экстракт:вода 1:1; 1:2; 1:4 и 1:8. Эта операция необходима для вычисления параметров ЕС.

Для улучшения достоверности данных и уменьшения экспериментальных ошибок, связанных, например, с взвешиванием, измерением объемов или разбавлением рекомендуется увеличить число серий независимых разбавлений до трех, а при плохой сходимости данных серий увеличить их число.

Не допускается консервирование проб, предназначенных для исследования на токсичность.

Подготовка прибора "Биотокс-10".

Подготовку прибора "Биотокс-10" проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

Регидротация биосенсора "Эколюм".

Вскрыть флакон с лиофилизированным препаратом "Эколюм". Добавить 10 мл дистиллированной воды, pH 7,0 - 7,4, комнатной температуры для получения суспензии бактериального препарата. Желательно использовать стерилизованную дистиллированную воду. Рекомендуется несколько раз встряхнуть флакон с суспензией препарата.

Рекомендуется перемешивание рабочей суспензии препарата перед отбором определенных объемов для проведения анализа.

Выдержать суспензию в течение 30 минут.

Определение рабочей концентрации биосенсора "Эколюм".

Измерить фоновое значение прибора "Биотокс-10" (по инструкции к прибору, при счете 10 сек. без кюветы) и записать это значение.

Добавить 0,1 мл суспензии бактерий из флакона в кювету люминометра. Затем туда же добавить 0,9 мл дистиллированной воды (pH 7,0 - 7,4, комнатная температура).

Вставить кювету с биосенсором в люминометр и измерить величину интенсивности биолюминесценции. Записать эту величину.

Свечение рабочей суспензии бактерий должно находиться в интервале, превышающем фоновое значение прибора в 25 - 250 раз. Если величина больше интервала, то следует разбавить суспензию бактерий дистиллированной водой и повторить измерение.

Если у биосенсора истек гарантийный срок хранения и/или он стал плохо растворяться в холодной дистиллированной воде, рекомендуется более энергично его встряхивать и отфильтровать суспензию бактерий через бумажный фильтр.

В стандартном анализе приготовляют контрольный образец путем смешения в кювете от люминометра 0,1 мл рабочей суспензии бактерий и 0,9 мл дистиллированной воды (pH 7,0 - 7,4). При приготовлении опытных образцов к 0,1 мл рабочей суспензии бактерий добавляют 0,9 мл пробы моющих средств различного разведения.

Измерение токсикологических параметров проводят с помощью прибора "Биотокс-10" в стандартном варианте через 30 минут экспозиции. В экспрессном варианте допустимо проведение анализа через 5 минут.

При исследовании моющих средств после вывода прибора в режим измерения ЕС определяется интенсивность свечения контрольной кюветы и 4-х проб, полученных путем разбавления исследуемой пробы дистиллированной водой в следующих отношениях 1:1, 1:2, 1:4 и 1:8. Для всех 4-х проб автоматически определяется G-функция, значения которой заносятся в оперативную память микроконтроллера прибора. По данным этих измерений микроконтроллер при нажатии специальной кнопки клавиатуры управления производит автоматически вычисление коэффициентов ЕС20 и ЕС50 и представляет данные на дисплее.

При исследовании коэффициентов ЕС ингредиентов моющих средств рекомендуется убедиться при измерении токсичности приготовленного раствора, что величина G для данной пробы не превышает значения 25. В случае, если величина больше, может увеличиться погрешность измерения величин ЕС. В таком случае необходимо развести пробу дистиллированной водой.

Как при исследовании моющих средств, так и их ингредиентов, после определения путем измерения величины ЕС20 - насколько надо разбавить раствор, чтобы он стал нетоксичным, необходимо учесть вклад этапа предварительного разбавления.

Следует обратить внимание, что при интенсивности биолюминесценции опыта больше или равным контроля вычисление G-функции не производится. В этом диапазоне образец не токсичен. Следует уменьшить степень первичного разбавления.

Для большей достоверности проведения измерений рекомендуется делать несколько параллельных разбавлений исходного образца.

В случае наличия эталонного образца моющего средства исследования качества продукции проводятся по сравнению опытного и эталонного образцов. Водная экстракция из эталонного образца проводится, как указано выше, и этот раствор используется как контроль. Условия экстракции должны быть строго одинаковыми в контроле и опыте.

Измеряется свечение эталонной пробы и прибор запоминает эту величину. Затем измеряются повторности опытной пробы, и прибор автоматически фиксирует значения индекса токсичности каждой пробы и усредненную величину индекса токсичности. В этом анализе параметры ЕС не измеряются.

Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности "Т". Абсолютная величина интенсивности биолюминесценции контроля не имеет принципиального значения в диапазоне допустимых значений прибора "Биотокс-10".

Приготовляют три повторности водного экстракта ингредиента. Обработку результатов измерений токсичности выполняют путем расчета среднеарифметического значения величины индекса токсичности "Т" по формуле:

где Т1 - Т3 - повторности опытной пробы.

Величины Т1, Т2 и Т3 получают при измерении в последовательности контроль, и затем серии опытных образцов.

Прибор "Биотокс-10" автоматически определяет усредненный показатель индекса токсичности и погрешность измерения. Если погрешность измерения большая, необходимо увеличить число повторностей.

В случае определения токсичности пробы при малых разведениях можно определить насколько это связано со значениями pH исследуемого раствора. Для этого измеряют pH пробы и, если величина pH находится за пределами 6,5 - 8,0, приводят pH до значений 7,0 - 7,4 и повторяют измерение токсичности.

В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае независимо от величины отрицательного значения "Т" делается вывод об отсутствии токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение.

Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности "Т" и параметров ЕС20 и ЕС50.

В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае независимо от величины отрицательного значения "Т" делается вывод об отсутствии токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение.

По величине индекса токсичности анализируемой пробы классифицируются на три группы (таблица 1).

Количественные оценки токсичности образцов моющих средств (параметр ЕС20) и их ингредиентов (индекс токсичности) представлены в таблице 2.

ПК продукция признается токсичной, если согласно параметру ЕС20 необходимо большее разбавление, нежели указано в таблице 2. При достижении параметра ЕС50 продукция признается сильно токсичной.

При определении токсичности ингредиента продукции нужно сопоставить концентрацию, вызывающую ЕС20, с концентрацией этого ингредиента в изделии. Если она больше, то необходимы дополнительные анализы с применением других методов для заключения о возможности использования ингредиента.

При обнаружении отличия моющих средств и ингредиентов от эталонных образцов на величину большую Т = 20 следует провести дополнительные исследования качества продукции другими методами.

Результат токсикологического анализа представляется в виде протокола (Приложение 1).

Удовлетворительные результаты, полученные при проверке диапазона реагирования люминесцентных бактерий на модельный токсикант, не обеспечивают гарантии адекватного реагирования организмов на другие токсиканты и тем более их смеси, однако регулярно проводимая проверка позволяет выявить ошибки при приготовлении исследуемых смесей и растворов, нарушения, допускаемые в условиях проведения опытов.

Процедура определения диапазона реагирования тест-системы "Эколюм" на модельный токсикант проводится путем действия раствора, содержащего 4,4 мг/л цинка сернокислого при времени инкубации 30 минут с биосенсором. Должно происходить не менее чем 50%-ное ингибирование интенсивности биолюминесценции по сравнению с контролем. В случае если эта величина меньше, то следует проверить точность приготовления исследуемых растворов, условий проведения опытов. Если все правильно, то биосенсор не используется.

Результат токсикологического анализа в документах - индекс токсичности, предусматривающих его использование, представляется в виде:

Все указанные статистические параметры вычисляются измерительным прибором "Биотокс-10" автоматически по команде оператора.