Методические указания по лабораторной диагностике американского гнильца, европейского гнильца, парагнильца, септицемии и сальмонеллеза пчел разработаны лабораторией ветеринарной санитарии в пчеловодстве ВНИИВС (авторы: А.М. Смирнов, Е.Т. Попов, Г.И. Игнатьева, Г.А. Кухалашвили)

1.1. Американский гнилец (злокачественный гнилец, гнилец закрытого расплода) - инфекционная болезнь пчелиных и трутневых личинок в возрасте 7 - 9 дней. Болезнь проявляется во вторую, наиболее жаркую половину лета.

Зараженные личинки погибают, разлагаются, становятся вязкими, тягучими, приобретают запах растопленного столярного клея. Постепенно гнилостная масса высыхает в плотную корочку, которая с трудом извлекается из ячейки.

Крышечки ячеек над погибшими личинками темнеют, становятся продырявленными, просевшими (пестрый расплод).

1.2. Возбудитель болезни - Bac. larvae - грамположительные, спорообразующие, подвижные, прямые палочки с закругленными концами, располагающиеся одиночно или короткими цепочками.

1.3. Диагноз на американский гнилец ставят на основании эпизоотологических данных, характерных признаков поражения расплода и результатов лабораторного исследования.

1.4. Для исследования в лабораторию направляют образцы сотов размером 10 x 15 см с больными и погибшими личинками. Образцы пересылают в фанерном или деревянном ящике, отделяя их друг от друга и от стенок деревянными планками. Соты нельзя обертывать бумагой.

Заплесневевший материал для исследования непригоден.

1.5. Лабораторная диагностика американского гнильца включает микроскопию мазков из патологического материала и выделение культуры возбудителя с последующей ее идентификацией.

2.1. Мазки готовят из массы разложившихся личинок или сухих корочек. С этой целью из ячеек сотов пинцетом извлекают не менее 10 погибших личинок или корочек и помещают в пробирку с 5 мл стерильного физиологического раствора. Содержимое пробирки доводят до кипения над пламенем спиртовки, охлаждают и растирают до получения однородной суспензии.

2.2. Каплю приготовленной суспензии наносят на поверхность предметных стекол и распределяют тонким слоем. Мазки подсушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки, окрашивают по Граму и для обнаружения спор - 2%-ным спиртовым раствором карболового фуксина в течение 1,5 - 2 мин.

При наличии возбудителя в мазках обнаруживают овальные споры и одиночные грамположительные палочки.

3.1. Для выделения культуры Bac. larvae суспензию, приготовленную как указано в п. 2.1, высевают в МПБ и на МПА с добавлением 10% нормальной сыворотки крови лошади или среду Уайта (см. приложение 1).

Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 - 38 °C в течение 24 - 72 ч.

3.2. Через 24 ч культивирования в жидкой питательной среде Bac. larvae дает помутнение, через 48 - 72 ч среда просветляется, на дне пробирки образуется осадок.

На плотных питательных средах через 48 - 72 ч культивирования появляются шероховатые, локонообразные слегка выпуклые колонии, вначале прозрачные, затем серовато-белые. Позднее наблюдается сплошной рост в виде серовато-белых наложений на поверхности агара.

3.3. Выделенные культуры идентифицируют по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам.

Возбудитель американского гнильца пчел расщепляет глюкозу с образованием кислоты без газа, не сбраживает мальтозу, сахарозу, арабинозу, восстанавливает нитраты в нитриты, не образует каталазу, не обладает гемолитической активностью (см. приложение 2).

3.3.1. Ферментативные свойства выделенных культур изучают путем выращивания их в течение 2 - 5 сут на жидких средах Гисса с добавлением 10% нормальной сыворотки крови лошади.

3.3.2. Восстановление нитратов в нитриты. Выделенную культуру высевают в сывороточный МПБ с 1% нитрата калия. Через 48 - 72 ч инкубирования при 37 - 38 °C в пробирку вносят 0,5 мл 0,5%-ного водного раствора крахмала и такое же количество 0,5%-ного водного раствора йодистого калия. Содержимое пробирки тщательно перемешивают, добавляют одну каплю 5%-ного раствора серной кислоты и взбалтывают. В присутствии нитрита калия цвет среды становится темно-синим.

3.3.3. Для определения каталазной активности на предметное стекло наносят каплю 3%-ного раствора перекиси водорода и вносят в нее петлей суточную агаровую культуру возбудителя, при этом выделения газа не наблюдается.

3.3.4. Гемолитическую активность возбудителя определяют на глюкозо-кровяном агаре (см. приложение 1).

На агаре в чашках Петри через 24 - 48 ч обнаруживают серовато-белые наложения с локонообразными краями без зоны гемолиза.

4. Диагноз на американский гнилец считается установленным при выделении из патологического материала культуры со свойствами, характерными для Bac. larvae.

5. Срок исследования до 10 дн.

1. Среда Уайта. Скорлупу свежего куриного яйца протирают ватным тампоном, смоченным спиртом, обжигают на огне, стерильно вскрывают, отделяют белок, а желток выливают в колбу с 70 мл стерильной водопроводной воды. Содержимое колбы тщательно перемешивают путем встряхивания, разливают в пробирки по 10 мл и помещают в холодильник. По мере необходимости к 50 мл расплавленного и охлажденного до 45 - 50° МПА добавляют стерильно 10 мл эмульсии желтка, круговыми движениями тщательно смешивают агар с желтком и разливают в чашки Петри.

Застывшую среду выдерживают сутки в термостате для контроля стерильности.

2. Глюкозо-кровяной агар. МПА (pH 7,2 - 7,4) разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 30 мин.

По мере надобности агар расплавляют в кипящей водяной бане, охлаждают до 45 - 50 °C, добавляют 2% глюкозы и 15 - 20 мл свежевзятой стерильной дефибринированной крови лошади (барана, крупного рогатого скота) и смесь осторожно перемешивают, не допуская образования пены. Среду разливают в чашки и после застывания выдерживают в термостате 4 - 6 ч для подсушивания.