1.1. В связи с возможным снижением биологической активности (титра) сухой вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита птиц из штамма ВНИИБТ <1> при хранении или транспортировке, перед ее применением аэрозольным методом необходимо определять биологическую активность препарата с целью обеспечения точности дозировки при иммунизации.

--------------------------------

<1> Именуемой ниже - вакцина.

1.2. На коробке с вакциной указаны количество клоачных доз в ампуле и биологическая активность (титр) вакцины данной серии. Титр вакцины должен быть не ниже 10⁵ ЭИД₅₀/мл (эмбриональных инфекционных доз). В каждой ампуле содержится 2 мл вируса и 2 мл наполнителя.

1.3. Работу по определению биологической активности вакцины выполняют вирусологические отделы республиканских, краевых, областных ветеринарных лабораторий, а также зональные специализированные ветеринарные лаборатории (по болезням птиц).

1.4. Биологическую активность вакцины определяют методом титрования на куриных эмбрионах с последующей статистической обработкой полученных данных.

2.1. Для проведения работы по титрованию вирусвакцины ИЛТ необходимо иметь: бокс с предбоксником, оборудование для вирусологических исследований; стерильные бактериологические пробирки, закрытые ватно-марлевыми или резиновыми пробками; стерильные флаконы на 100 мл; стерильные пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл; пипетки Мора на 25 и 50 мл; фарфоровую кружку или стеклянную банку с дезинфицирующим раствором (для отработанных пипеток и других материалов); спиртовку или газовую горелку; ножницы изогнутые глазные остроконечные; пинцеты глазные; шприцы "Рекорд" на 1 мл с инъекционными иглами N 16; подставку с гнездами (ячейками) для куриных эмбрионов; картонные или металлические лотки; пробойники; лейкопластырь или парафин; этиловый спирт; 3%-ный спиртовой раствор йода; раствор дезинфицирующего вещества (1 ... 2%-ный раствор едкого натра или 5%-ный раствор монохлорамина); охлажденный стерильный физиологический раствор, приведенный фосфатным буфером к pH 7,2 ... 7,4; антибиотики (пенициллин, стрептомицин).

2.2. Для определения биологической активности вакцины используют 9-дневные куриные эмбрионы с белой скорлупой из хозяйств, благополучных по инфекционному ларинготрахеиту птиц, где не проводится вакцинация против этой болезни.

2.3. Куриные эмбрионы заражают соответствующими разведениями вирусвакцины (т.е. вирусом ИЛТ) в аллантоисную полость (см. п. 3.1 и 3.2).

2.4. Инструменты, используемые при заражении эмбрионов (пинцет, шприц на 1 мл, иглы, пробойники), стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. В процессе работы пинцеты и пробойники обрабатывают 96°-ным спиртом и фламбируют.

2.5. Непосредственно перед заражением эмбрионы овоскопируют, отбирают эмбрионы с хорошей подвижностью и развитой хорионаллантоисной оболочкой (ХАО) и отмечают границу пуги (естественная воздушная полость).

3.1. Разведение вирусвакцины для титрования. Исходное разведение лиофилизированного вируса ИЛТ (вирусвакцины) готовят начиная с разведения 10^-1 (без учета наполнителя). Берут 9 ампул вакцины (по 2 мл вируса в ампуле), из которых составляют 3 пробы (по 3 ампулы в каждой пробе), и параллельно их титруют.

Содержимое трех ампул (6 мл вируса) растворяют в 60 мл стерильного физиологического раствора (разведение 1:10), содержащего 400 ЕД/мл пенициллина и 400 мкг/мл стрептомицина, затем вируссодержащую суспензию центрифугируют 10 мин при 1 тыс. об/мин. Из надосадочной жидкости готовят возрастающие 10-кратные разведения до 10^-7.

В ряд соответственно обозначенных стерильных пробирок (по количеству разведений вируса) разливают стерильный физиологический раствор по 9 мл.

Из исходного разведения вируса (1:10) отмеряют 1 мл и переносят в следующую пробирку с 9 мл физиологического раствора, при этом пипетка не должна касаться жидкости. Таким образом получают разведение 1:100 (10^-2). Использованную пипетку погружают в дезинфицирующий раствор. Другой чистой пипеткой перемешивают вируссодержащую суспензию разведения 10^-2 и 1 мл ее переносят в следующую пробирку, получают разведение 10^-3, и так до 7-й пробирки (т.е. до разведения 10^-7).

3.2. Заражение эмбрионов. Каждым разведением вируса, начиная с 10^-7 до 10^-1, одним стерильным шприцем заражают в аллантоисную полость по 4 эмбриона 9-дневного возраста в дозе 0,2 мл (всего 28 эмбрионов). Для этого яйцо помещают вертикально тупым концом вверх. Поверхность скорлупы в области естественной пуги протирают 96°-ным спиртом и фламбируют. Легким ударом пробойника над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы. Через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу в аллантоисную полость на глубину 2 ... 3 мм ниже границы воздушного мешка. Отверстие в скорлупе после инъекции заклеивают расплавленным парафином или лейкопластырем. Кроме того, 6 эмбрионов оставляют незараженными для контроля.

Зараженные и контрольные эмбрионы укладывают в лоток вертикально пугой и помещают в термостат, где инкубируют 144 ч при температуре (37 +/- 0,5) °C и относительной влажности 60 ... 70%. В термостат ставят кювет (объемом 0,5 л) с водой.

3.3. Эмбрионы овоскопируют 2 раза в день. Эмбрионы, павшие в течение 24 ч после заражения, во внимание не принимают, их собирают и уничтожают, так как в этот период они могут погибнуть не только от действия вируса. Гибель эмбрионов в последующие дни относят за счет действия вакцинного вируса инфекционного ларинготрахеита (при условии, что посевы из каждого эмбриона на питательные среды МПБ, МПА, МППБ и среду Сабуро останутся стерильными). Через 6 дней все эмбрионы вскрывают. При этом учитывают изменения, характерные для вируса ИЛТ (мелкие серо-белые узелки некроза, рассеянные по всей хорионаллантоисной оболочке или слившиеся в бляшки). В контрольных (незараженных) куриных эмбрионах изменений на ХАО не должно быть.

Титр вируса высчитывают по методу Рида и Менча по каждой пробе отдельно. Примерный расчет по этому методу приводится в таблицах 48 и 49.

Знаком "+" обозначены эмбрионы, погибшие после 24 ч инкубации или выжившие, но имеющие характерные для вируса ИЛТ изменения при вскрытии их через 6 сут после заражения; знаком "0" - эмбрионы, не имеющие изменений, свойственных вирусу ИЛТ.

Из таблицы 48 видно, что при разных разведениях вируса поражается различное количество эмбрионов. На основании этих данных высчитывают кумулятивную инфекционность вакцины, исходя из того, что если у эмбриона имеются поражения ХАО вирусом в разведении 10^-6, то они будут и при более высоких концентрациях вируса. Далее проводят статистический расчет (табл. 49).

Стрелкой показано, в каком направлении следует суммировать абсолютные данные результата титрования (в графах 2 и 3) для подсчета кумулятивных данных (в графах 4 и 5).

Процент кумулятивной инфекционности для каждого разведения рассчитывают по формуле

где a - данные графы 5 (т.е. количество эмбрионов с поражением ХАО);

b - данные графы 4 (т.е. количество эмбрионов без поражений ХАО).

В данном примере процент инфекционности при разведении вируса 10^-1 равен

инфекционности при разведении вируса 10^-5 равен

Одна ЭИД₅₀ равна тому количеству вируса, которое вызывает поражение ХАО у 50% эмбрионов.

Из таблицы 49 видно, что ни при одном разведении вируса инфекционность не составляет 50%, следовательно, ЭИД₅₀ находится между разведениями 10^-5 и 10^-6.

Разведение вируса, при котором процент инфекционности приближается к 50, но выше этой цифры, называется высшей критической дозой, а если он ниже 50 - низшей критической дозой.

В данном примере высшей критической дозой является разведение вируса 10^-5 (80% инфекционности), а низшей критической дозой - 10^-6 (20% инфекционности).

Для расчета коэффициента пропорциональности (X) предложена формула

где X - коэффициент пропорциональности;

C - процент инфекционности высшей критической дозы;

D - процент инфекционности низшей критической дозы.

Подставляем цифровые значения в формулу:

Установлено, что ЭИД₅₀ равна логарифму высшей критической дозы + коэффициент пропорциональности. В данном случае логарифм высшей критической дозы равен 5(10^-5), коэффициент пропорциональности - 0,5. Следовательно, при окончательном подсчете ЭИД₅₀ = 5 + 0,5 = 5,5 (т.е. 10^5,5 ЭИД₅₀/0,2 мл). Для определения биологической активности вирусвакцины в 1 мл к полученному числовому выражению логарифма прибавляют постоянную величину 0,7, т.е. в данном случае ЭИД₅₀ = 5,5 lg + 0,7 lg = 6,2 lg. Значит, титр вируса в 1 мл будет равен 6,2 lg.

3.4. Для перевода титра вируса в абсолютные числа находят антилогарифм числа 6,2, пользуясь приложением к настоящим методическим указаниям (т.е. искомое число антилогарифма в данном примере 6,20, где 6 - характеристика, 20 - мантисса, которая определяется на месте пересечения десятых и сотых цифровых значений в таблице, а характеристика указывает на количество знаков в цифровом выражении). В приведенном примере в 1 мл вакцины содержится 1 585 000 ЭИД₅₀ (это и есть абсолютное число).

3.5. Для более точного расчета необходимо провести не менее трех параллельных титрований, так как за биологическую активность вакцины принимается среднеарифметическая величина трех параллельных титрований.

Для аэрозольной вакцинации применяют вакцину с титром не ниже 10⁵ ЭИД₅₀/мл.

3.6. Результаты титрования записывают в соответствующей книге (журнале) учета. При этом указывают наименование вакцины и учреждения, ее изготовившего, номер серии и дату изготовления, дату поступления на исследование и наименование хозяйства, откуда поступила вакцина, и результат исследования (1).

Примечание. Для определения абсолютного числа соответствующего логарифма необходимо мантиссу (цифру, стоящую после запятой) проантилогарифмировать. С этой целью находят по горизонтали цифру, соответствующую десятым долям, а по вертикали - сотым долям мантиссы, и на пересечении этих цифр находят числовое значение антилогарифма. В дальнейшем, исходя из характеристики (целое число), в полученном числовом выражении отделяют количество цифр на одно больше, чем указано в характеристике.

Пример. Логарифм числа равняется 6,20. Антилогарифмируют мантиссу 20. Находят по горизонтали цифру 2, а по вертикали - 0. На пересечении этих цифр определяют число - 1585. Согласно характеристике, устанавливают абсолютное число, которое равняется 1 585 000.