1.1. Натуральный цветочный мед является продуктом переработки собираемого пчелами цветочного нектара, представляющим собой сладкую ароматическую сиропообразную жидкость или закристаллизованную массу различной консистенции и размера кристаллов, бесцветную или с окраской желтых, коричневых и бурых тонов, извлеченную из сотов центрифугированием или прессованием и предназначенную для пищевого использования.

1.2. По происхождению различают цветочный, падевый и смешанный мед. Чаще встречается полифлорный цветочный мед, собранный с нескольких видов растений, и реже монофлорный, собранный с одного вида растений (липовый, гречишный, подсолнечниковый и т.д.). Мед падевый бывает растительного и животного происхождения.

2.1. Тара для транспортировки и хранения меда должна быть изготовлена из материалов, допущенных для этих целей органами здравоохранения (нержавеющая сталь, алюминиевые сплавы, стекло, эмалированная посуда и дерево, кроме дуба и хвойных).

2.2. Мед принимается на экспертизу при наличии у владельца ветеринарной справки (или ветеринарного свидетельства при продаже меда за пределами района) и ветеринарно-санитарного паспорта пасеки.

2.3. Запрещается продажа меда при обнаружении:

а) несоответствия тары согласно требованию п. 2.1;

б) органолептических пороков;

в) содержания воды более 21%;

г) брожения;

д) механических примесей;

е) прогревания при температуре выше 50 °С;

ж) токсичности;

з) радиоактивности;

и) возбудителей заразных болезней пчел;

к) фальсификации.

2.4. Для определения в меде остатков антибиотиков, возбудителей заразных болезней пчел, радиоактивности в ветеринарную лабораторию направляют пробы меда, отобранные в стеклянную посуду, которую затем плотно закрывают и опечатывают.

2.5. До получения результатов исследования или заключения ветеринарной лаборатории мед продавать не разрешается.

2.6. Продажа меда на рынках разрешается лицам, имеющим спецодежду (нарукавники, фартук, косынка или колпак), и при соблюдении ими санитарных правил торговли.

2.7. На посуде с медом должна быть этикетка, указывающая о проведении ветеринарно-санитарной экспертизы: белого цвета для качественного меда, синего для меда низкого качества и падевого.

2.8. Результаты ветеринарно-санитарной экспертизы меда на мясо-молочной и пищевой контрольной станции регистрируют в соответствующем журнале.

3.1. Отбор проб производят работники мясо-молочной и пищевой контрольной станции в присутствии владельца.

3.2. Пробы отбирают после проверки состояния тары и ее соответствия требованию п. 2.1.

3.3. Для исследования меда берут пробу массой 100 г из каждой контролируемой единицы упаковки, при определении содержания воды ареометром масса пробы удваивается.

3.4. Мед, не реализованный и не сданный для хранения на рынке, подлежит повторной экспертизе.

3.5. Отбор образцов меда для лабораторной экспертизы производят алюминиевым пробоотборником (если мед жидкий) или щупом для масла (если мед плотный) из разных слоев и помещают в чистую и сухую посуду из стекла или фарфора.

3.6. Закристаллизованный мед отбирают коническим щупом, погружая его в мед под наклоном. Затем поворачивают щуп вокруг оси на 360° и извлекают. Со столбика меда срезают слои шпателем или ножом.

3.7. Сотовый мед принимают на экспертизу, если он запечатан, не закристаллизован, а соты имеют однородный белый или желтый цвет. В качестве пробы с каждой пятой соторамки вырезают ножом часть сота площадью 25 кв. см. Если сотовый мед кусковой (соты вынуты из рамки и разрезаны), пробы берут в тех же размерах от каждой упаковки.

После удаления восковых крышечек (забруса) образец помещают на сетчатый фильтр с диаметром ячеек не более 1 мм, вложенный в стакан, и ставят в термостат при температуре 40 - 45 °С.

В процессе фильтрования кусочек сота несколько раз переворачивают для более полного стекания меда.

Каждую пробу исследуют отдельно.

Запечатывание сот пчелами свидетельствует о зрелости меда, не являясь гарантией качества и натуральности продукта. При экспертизе сотового меда обращают внимание на: а) органолептические пороки и брожение, б) присутствие в сотах расплода и перги, в) наличие сахарного меда.

Обнаружение перечисленных видов недоброкачественности и фальсификации меда является основанием для его браковки.

4.1. Определение цвета. Цвет меда определяют визуально при дневном освещении.

4.2. Определение аромата. Мед обладает специфическим приятным ароматом, который зависит от нектароноса, наличия примесей в меде, длительности и условий хранения, а также от его нагревания и фальсификации. Некоторые виды меда (табачный, с золотарника) имеют неприятный аромат, у кипрейного его почти нет. Аромат меда исчезает при брожении, длительном и интенсивном нагревании, при добавлении искусственно инвертированного сахара, тростникового сахара, патоки и т.д., а также при кормлении пчел сахарным сиропом.

Для определения аромата в стеклянную бюксу (стакан) помещают 30 - 40 г меда, закрывают крышкой и нагревают на водяной бане при температуре 40 - 45 °С в течение 10 минут.

4.3. Определение вкуса. Вкус определяют после предварительного нагревания меда до 30 °С.

4.4. Определение консистенции. Консистенцию (вязкость) определяют погружением шпателя в мед, имеющий температуру 20 °С, затем шпатель извлекают и оценивают характер стекания меда:

а) жидкий мед - на шпателе небольшое количество меда, который стекает мелкими частыми каплями. Жидкая консистенция характерна для белоакациевого, клеверного, кипрейного меда и при содержании воды более 21%;

б) вязкий мед - на шпателе значительное количество меда, стекающего крупными редкими вытянутыми каплями. Вязкая консистенция присуща большинству видов цветочного меда;

в) очень вязкий мед - на шпателе значительное количество меда, который при стекании образует длинные тяжи. Очень вязкая консистенция характерна для падевого меда и цветочного в процессе кристаллизации;

г) плотная консистенция - шпатель погружается в мед под давлением.

4.5. Органолептические показатели меда должны соответствовать требованиям, указанным в таблице 1.

5.1. Приготовление раствора меда. Лабораторные исследования меда проводят в водных растворах и лишь при определении содержания воды рефрактометрически используют натуральный мед.

Для количественных биохимических исследований готовят 0,25 - 10-процентные растворы меда в пересчете на сухое вещество. Определение содержания воды ареометром и постановка некоторых качественных реакций требуют более концентрированных растворов меда (1:2).

5.1.1. Приготовление раствора меда в пересчете на сухое вещество. Расчет ведется по формулам 1 и 2:

где:

х - количество раствора меда заданной концентрации в пересчете на сухое вещество, мл;

ш - навеска меда, г;

В - количество сухих веществ в меде, %;

С - заданная концентрация раствора меда, %.

5.1.2. Для приготовления раствора меда берут 1 весовую часть меда и растворяют в 2 частях воды.

5.2. Определение содержания воды в меде.

5.2.1. Определение содержания воды и сухого остатка по удельному весу раствора меда.

Готовят раствор меда 1:2. Для этого отвешивают 100 г хорошо перемешанного меда и растворяют в 200 мл дистиллированной воды при температуре 30 - 40 °С. Приготовленный раствор охлаждают до 15 °С и определяют его удельную массу. Количество воды и сухого остатка определяют по таблице 2.

Пример. Если удельная масса раствора меда 1:2 при 15 °С определена в 1,116, то по таблице это соответствует 27,13% сухого остатка, а так как мед был разведен 3 раза, то сухой остаток его будет равен 27,13 х 3 = 81,39%, а содержание воды 100 - 81,39 = 18,61%.

5.2.2. Определение содержания воды в меде по индексу рефракции проводят с помощью рефрактометра марки РДУ или РЛ, предварительно юстированного по дистиллированной воде. Каплю жидкого меда наносят на нижнюю призму рефрактометра и измеряют показатель преломления. Содержание воды в исследуемом меде определяют по таблице 3.

Поправки к температурам. При температуре выше 20 °С прибавляют 0,00023 на 1 °С, а при температуре ниже 20 °С вычитают 0,00023 на 1 °С.

Примечание. Закристаллизованный мед перед исследованием нагревают в закрытом сосуде на водяной бане при 60 °С до расплавления и после охлаждения его исследуют согласно п. п. 5.2.1 и 5.2.2.

5.3. Определение оптической активности. Углеводы меда оптически активны, так как обладают способностью вращать плоскость поляризованного света. Цветочный мед левовращающий (вращает плоскость поляризованного света влево), а падевый мед и некоторые фальсификаты (сахарный мед, тростниковый сахар и патока) правовращающие.

Для определения оптической активности используют поляриметр портативный (типа П-161) или сахариметр универсальный СУ-3. Перед началом измерений прибор юстируют. Затем в камеру вкладывают поляриметрическую кювету (трубку), заполненную профильтрованным 10-процентным раствором исследуемого меда, который изменяет однородность половин поля зрения. Вращая кремальеру, уравнивают однородность половин поля зрения и производят нониусом отсчет шкалы. Отсчет показателей шкалы измеряют 5 раз. Среднеарифметическое пяти измерений будет являться результатом измерения в целом.

5.4. Определение механических примесей. На металлическую сетку с диаметром ячеек не более 1 мм, положенную на стакан, помещают около 50 г меда. Стакан ставят в сушильный шкаф, нагретый до 60 °С на водяной бане, и затем фильтруют через сетку.

Мед должен профильтроваться без видимого остатка.

5.5. Определение общей кислотности. Общая кислотность меда зависит от содержания в нем различных кислот, солей, белков и двуокиси углерода. Данный показатель выражается нормальными градусами (миллиэквивалентами) - это количество миллилитров 0,1 н. раствора едкого натра, пошедшее на титрование 100 г меда при индикаторе фенолфталеине.

В химический стакан отмеряют 100 мл 10-процентного раствора меда, прибавляют 5 капель 1-процентного спиртового раствора фенолфталеина и титруют 0,1 н. раствором едкого натра до слабо-розового окрашивания. Окончательный вираж цвета должен продолжаться 10 секунд. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать +/- 0,05 нормального градуса.

5.6. Определение минеральных веществ (золы). Содержание минеральных веществ снижается в меде при добавлении в него сахарозы, глюкозы, искусственно инвертированного сахара.

В прокаленный до постоянной массы тигель берут навеску меда 5 - 10 г (с точностью до 0,1 мг), которую обугливают до почернения на газовой горелке или электроплитке (избегать потери вещества в результате вспучивания). Затем пробу прокаливают в течение 1 часа при температуре 600 °С (красный цвет). Тигель охлаждают в эксикаторе над безводной серной кислотой 30 минут и взвешивают. Общее количество минеральных веществ вычисляют по формуле:

5.7. Определение диастазной активности. Диастазная (амилазная) активность очень низка у некоторых видов натурального меда (белоакациевый, кипрейный, клеверный, липовый, подсолнечниковый). При нагревании меда выше 50 °С и длительном хранении (более года) диастаза частично или полностью инактивируется. Фальсификация меда также ведет к ослаблению активности фермента.

Определение активности диастазы основано на способности этого фермента расщеплять крахмал на амилодекстрины. Количественно данный показатель выражается диастазными числами (ед. Готе), которые обозначают количество миллилитров 1-процентного раствора крахмала, расщепляемого диастазой (амилазой), содержащейся в 1 г меда (в пересчете на сухое вещество), в течение 1 часа при температуре 40 +/- 1 °С до веществ, не окрашиваемых йодом в синий цвет.

В 11 пробирок разливают 10-процентный раствор меда и другие компоненты согласно таблице 4.

Пробирки закрывают пробками, тщательно перемешивают, помещают в водяную баню на 1 час при температуре 40 +/- 1 °С. Затем их вынимают из водяной бани и охлаждают под струей воды до комнатной температуры, после чего в каждую добавляют по одной капле раствора йода (0,5 г йода, 1 г йодистого калия в 100 мл дистиллированной воды).

В тех пробирках, где крахмал остался неразложенным, появляется синяя окраска, при отсутствии - темноватая, с частично разложенным - фиолетовая окраска.

Последняя слабоокрашенная пробирка перед рядом обесцвеченных (с желтоватым оттенком) соответствует диастазной активности испытуемого меда (см. табл. 4).

Если растворимого крахмала нет, его можно приготовить следующим способом: 250 г картофельного крахмала промывают в 1 л дистиллированной воды, после отстоя воду сливают. В осадок заливают 1,5 л 4-процентного раствора HCl и выдерживают 1 - 2 часа, затем смесь фильтруют. Крахмал, собранный с фильтра, многократно промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции по лакмусу и высушивают при температуре 90 °С.

В связи с тем, что диастазное число для натурального меда колеблется в разных зонах страны, его устанавливает на месте ветеринарный отдел областного (краевого) управления сельского хозяйства, МСХ автономной республики или Главное управление (управление) ветеринарии министерства сельского хозяйства союзной республики, не имеющей областного деления, но во всех зонах оно должно быть не ниже 5 (см. Приложение 1).

5.8. Определение инвертированного сахара. Суммарное содержание в меде глюкозы и фруктозы принято обозначать инвертированным сахаром. Количество инвертированного сахара в меде менее 70% свидетельствует о его фальсификации. Однако нормальное количество инвертированного сахара не гарантирует натуральность продукта.

5.8.1. Приготовление раствора меда. Из исследуемого меда готовят 10-процентный водный раствор. Затем из данного раствора приготавливают 0,25-процентный раствор. Для этого в мерную колбу на 200 мл отмеривают 5 мл 10-процентного раствора меда, доводят до метки водой и перемешивают.

Восстановление метиленовой сини редуцирующими веществами меда происходит с некоторым опозданием, поэтому титрование следует вести со скоростью не более одной капли через 2 секунды. Возобновление окраски после остывания смеси в расчет не принимается. Титрование проводят 2 - 3 раза и выводят среднее значение. Расхождение между параллельными исследованиями не должно превышать 1%.

Примечание. Если содержимое колбы обесцвечивается без титрования, это указывает на содержание в исследуемом меде инвертированного сахара более 81,2%. Содержание инвертированного сахара в меде определяют по таблице 5.

5.9. Определение предельного содержания инвертированного сахара. В колбу отмеряют 10 мл 1-процентного раствора красной кровяной соли, 2,5 мл 10-процентного раствора едкого натра и 5,8 мл 0,25-процентного раствора исследуемого меда. Содержимое колбы нагревают до кипения, кипятят 1 минуту и прибавляют одну каплю 1-процентного раствора метиленовой сини. Если жидкость не обесцвечивается, то в исследуемом меде инвертированного сахара меньше 70%; такой мед фальсифицирован.

5.10. Определение примеси искусственно инвертированного сахара. Для определения в меде примеси искусственно инвертированного сахара пользуются реакцией, основанной на том, что при превращении тростникового (свекловичного) сахара в инвертированный посредством кислот часть левулезы (плодового сахара) разрушается, при этом образуется оксиметилфурфурол, растворимый в воде, который в присутствии концентрированной соляной кислоты и резорцина дает вишнево-красное окрашивание.

В фарфоровую ступку берут 4 - 6 г меда, добавляют 5 - 10 мл эфира и тщательно растирают пестиком, эфирную вытяжку сливают в фарфоровую чашку (часовое стекло) и добавляют 5 - 6 кристалликов резорцина (его можно вносить в ступку в процессе приготовления вытяжки). Эфир выпаривают при комнатной температуре. Затем на сухой остаток наносят 1 - 2 капли концентрированной соляной кислоты (удельная масса 1,125).

Учет реакции:

а) зеленовато-грязный или желтый цвет - отрицательная;

б) оранжевая или слабо-розовая окраска - слабо положительная (наблюдается при прогревании меда);

в) красный, вишнево-красный, оранжевый, быстро переходящий в красный цвет, - положительная (мед содержит примесь искусственно инвертированного сахара).

5.11. Определение сахарозы (тростникового сахара). В колбу на 200 мл отмеряют 5 мл 10-процентного раствора меда и 45 мл воды. Вставив в колбу термометр, помещают ее в водяную баню, которую предварительно нагревают до 80 °С. Доводят температуру содержимого колбы до 68 - 70 °С (на что обычно уходит 2 - 3 минуты), быстро прибавляют 5 мл соляной кислоты в разведении 1:5, перемешивают взбалтыванием, выдерживают при этой температуре 5 минут и сразу же охлаждают до 16 - 18 °С. Перед удалением термометра из колбы его предварительно ополаскивают дистиллированной водой. Инверт нейтрализуют 10-процентным раствором едкого натра при индикаторе метилоранже (1 - 2 капли) до оранжево-желтой окраски.

Объем инверта доводят до 200 мл и трехкратным переворачиванием колбы перемешивают полученный 0,25-процентный раствор меда. Определение инвертированного сахара в данном растворе проводят по методике, изложенной в п. 5.8.2.

Содержание сахарозы в меде вычисляется по формуле:

где:

С - содержание сахарозы в меде, %;

х - содержание инвертированного сахара после инверсии, %;

у - содержание инвертированного сахара до инверсии, %.

5.12. Определение примеси сахарозы (тростникового сахара). При фальсификации меда сахарозой ухудшается органолептика, понижается диастазная активность, содержание минеральных веществ и инвертированного сахара, а количество тростникового сахара повышается. Фальсификат обладает правым вращением. Следовательно, для обнаружения данного вида фальсификации необходимо определить органолептические показатели, диастазную активность, содержание золы, тростникового и инвертированного сахара, оптическую активность.

5.13. Определение сахарного меда. Сахарный (подкормочный, экспрессный) "мед" получается в результате кормления пчел сахарным сиропом. Такой мед является фальсификатом.

Свежеоткачанный сахарный мед имеет жидкую консистенцию, светлую окраску, слабовыраженный аромат, свойственная натуральному меду терпкость отсутствует.

Химические показатели для сахарного меда следующие: общая кислотность не более одного нормального градуса, зольность ниже 0,1%, содержание тростникового сахара выше 5%, фальсификат обладает правым вращением.

5.14. Определение прогревания меда. Мед нагревают для декристаллизации, прекращения брожения и при фальсификациях. При этом ухудшаются органолептические показатели (мед темнеет, ослабевает аромат, появляется привкус карамели), снижается ферментативная активность и бактерицидность, содержание оксиметилфурфурола увеличивается. Исходя из вышеизложенного, для определения порчи меда нагреванием следует определять органолептические показатели, ферментативную активность, содержание оксиметилфурфурола согласно п. 5.10 и посторонних примесей.

5.15. Определение брожения меда. Данный вид порчи является следствием хранения меда с содержанием воды выше 21%. Мед обладает выраженной гигроскопичностью, поэтому хранение его в негерметичной таре при условии высокой влажности окружающего воздуха ведет к повышению содержания в нем воды, осмофильные дрожжи активизируются, мед начинает бродить.

В начале брожения отмечают усиление аромата, затем появляется кисловатый запах (усиливающийся при нагревании меда). Мед вспучивается, на поверхности появляется пена, а в массе меда пузырьки газа. При микроскопировании такого меда обнаруживаются возбудители брожения - дрожжи.

5.16. Определение примеси свекловичной (сахарной) патоки. Добавление свекловичной патоки в мед ухудшает органолептику, снижает содержание инвертированного сахара и диастазную активность. Смесь имеет правое вращение.

Качественная реакция.

К 5 мл водного раствора меда, приготовленного в соотношении 1:2, прибавляют 5 - 10 капель 5-процентного азотнокислого серебра. Помутнение смеси и появление белого осадка свидетельствуют о присутствии в меде свекловичной патоки.

5.17. Определение примеси крахмальной патоки. Изменения в меде при добавлении в него крахмальной патоки аналогичны с изменениями, приведенными в п. 5.16.

Качественная реакция.

К 5 мл профильтрованного водного раствора меда, приготовленного в соотношении 1:2, прибавляют по каплям 10-процентный раствор хлористого бария. Появление помутнения или выпадение белого осадка после прибавления первых капель реактива свидетельствует о присутствии в меде крахмальной патоки.

5.18. Определение примеси крахмала и муки. Изменения в меде при добавлении крахмала и муки аналогичны с изменениями, указанными в п. 5.16.

Качественная реакция.

5 мл водного раствора меда в соотношении 1:2 нагревают в пробирке до кипения, охлаждают до комнатной температуры и прибавляют 3 - 5 капель раствора йода.

Появление синей окраски свидетельствует о присутствии в меде крахмала или муки.

5.19. Определение примеси желатина. Желатин добавляют в мед для повышения вязкости. При этом ухудшается вкус и аромат, снижается ферментативная активность и содержание инвертированного сахара, количество белка повышается.

Качественная реакция.

К 5 мл водного раствора меда в соотношении 1:2 добавляют 5 - 10 капель 5-процентного раствора танина. Образование белых хлопьев свидетельствует о присутствии в меде желатина. Появление слабого помутнения оценивается как отрицательная реакция на желатин.

5.20. Определение падевого меда.

5.20.1. Известковая реакция. В пробирке одну объемную часть водного раствора меда в соотношении 1:1 смешивают с двумя объемными частями известковой воды и нагревают до кипения. При наличии падевого меда образуются хлопья бурого цвета, выпадающие в осадок.

Для приготовления известковой воды берут 1 часть негашеной извести и 1 часть воды, раствор выдерживают 12 часов (в течение этого времени 2 - 3 раза перемешивают). Верхний прозрачный слой жидкости сливают и используют для реакции.

5.20.2. Реакция с уксуснокислым свинцом. В пробирку наливают 2 мл водного раствора меда в соотношении 1:1, затем добавляют 2 мл воды и 5 капель 25-процентного раствора уксуснокислого свинца, тщательно перемешивают и ставят в водяную баню при температуре 80 - 100 °С на 3 минуты. Образование рыхлых хлопьев, выпадающих в осадок, свидетельствует о положительной реакции на падь.

Помутнение жидкости любой степени без хлопьев и осадка считается отрицательной реакцией.

5.21. Физико-химические показатели меда должны соответствовать требованиям, указанным в таблице 6.

Исследования меда на остаточные количества антибиотиков и обнаружение в нем возбудителей гнильцовых болезней проводят ветеринарные лаборатории, когда в ветеринарно-санитарном паспорте пасеки указано о неблагополучии ее по заразным болезням, обработке пчел антибиотиками и в случаях отравления пчел. Исследования также проводят при проверке кормовых запасов пчелиных семей, идущих в зимовку.

6.1. Исследование меда на наличие антибиотиков.

В основе определения антибиотиков (стрептомицина, хлортетрациклина, неомицина и эритромицина) лежит принцип диффузии в агар. Отличие в их определении состоит в использовании различных тесткультур, сред и буфера.

6.1.1. Для определения стрептомицина необходимы:

споры культуры Bac. Subtilis штамм 6633;

среда: раствор панкреатического гидролизата мяса (перевар Хоттингера), содержащий 33 мг% аминного азота, двузамещенный фосфат натрия 2 - 3 г, агар-агара 20 г (pH среды 7,8 - 8,0);

среда: раствор панкреатического гидролизата мяса (перевар Хоттингера), содержащий 100 мг% аминного азота, агар-агара 20 г (pH среды 6,1 - 6,2);

буферный раствор: цитратно-солянокислый с pH 5,0 - 5,2. Для приготовления буфера навеску лимоннокислого трехзамещенного натрия в количестве 8,6 г растворяют в 400 - 500 мл дистиллированной воды. В этот же раствор добавляют соляную кислоту (удельный вес 1,18 - 1,19) в количестве 5,6 мл. Затем доливают дистиллированной воды до 1000 мл. Все перемешивают и проверяют pH.

6.1.3. Для определения неомицина необходимы:

споры культуры Bac. mycoides штамм 537;

среда: раствор панкреатического гидролизата мяса, содержащий 33 мг% аминного азота (pH среды 7,8 - 8,0);

фосфатный буфер (pH 7,8 - 8,0). Приготовление буферного раствора см. в п. 6.1.1.

6.1.4. Для определения эритромицина необходимы:

споры культуры Bac. mycoides штамм НВ;

среда: раствор панкреатического гидролизата мяса, содержащий 33 мг% аминного азота (pH 7,8 - 8,0);

фосфатный буфер (pH 7,8 - 8,0). Приготовление буферного раствора см. в п. 6.1.1.

6.1.5. Техника определения. Стерильные чашки Петри диаметром 90 - 100 мм с ровным плоским дном устанавливают на столе, отрегулированном по уровню.

В расплавленную, затем охлажденную до 45 - 48 °С среду вносят взвесь спор той культуры в зависимости от того, на какой антибиотик исследуют мед, из расчета 20 - 30 млн. микробных тел на 1 мл среды. Среду со взвесью спор разливают по 10 мл в каждую чашку. После застывания засеянного агара на его поверхности на расстоянии около 28 мм от центра чашки вырезают 6 луночек тонкослойной стерильной трубкой с внешним диаметром 10 мм (для этой цели можно использовать трубку для пробочников N 4).

Затем от исследуемой пробы в 3 пробирки берут по 1 г меда. В зависимости от того, какой антибиотик определяют, испытуемую пробу разводят соответствующим буфером в соотношении 1:5 и прогревают в водяной бане при 60 °С в течение 10 минут для устранения антибактериальных свойств меда. После остывания содержимого пробирок в 2 луночки вносят по 0,1 мл от каждой навески (для исследования одной пробы используют одну чашку). Чашки переносят в термостат, где их выдерживают 18 - 20 часов при 37 °С. По истечении указанного времени чашки просматривают. Наличие зоны угнетения вокруг луночек указывает на присутствие в меде антибиотика. Такой мед не допускается в продажу.

Мед с наличием антибиотиков может быть использован в кондитерской промышленности, где применяют температурные режимы от 60 - 100 °С в течение 1,5 часа.

6.1.6. Приготовление панкреатического гидролизата из мяса крупного рогатого скота см. в книге "Ветеринарная лабораторная практика", т. 1.

6.1.7. Определение аминного азота в панкреатическом гидролизате. Необходимые реактивы:

0,2 н. раствор едкого натра;

0,2 н. раствор соляной кислоты;

0,5-процентный водный раствор бромтимолблау;

формольная смесь, которую готовят следующим образом: к 50 мл 30 - 40-процентного формалина добавляют 25 мл 96-процентного этилового спирта и 5 мл спиртового раствора тимолфталеина (0,1-процентный раствор на 96-процентном спирте). Смесь нейтрализуют 1 н. раствором едкого натра до бледно-голубого окрашивания.

Постановка реакции. Гидролизат мяса в колбе разводят дистиллированной водой до содержания 80 - 90 мг% аминного азота (например, 5 мл гидролизата доводят до 50 мл). В две колбы наливают по 5 мл разведенной исследуемой жидкости и в каждую добавляют по 20 мл дистиллированной воды. В одну колбу добавляют 2 капли раствора бромтимолблау, а затем кислотой или щелочью (в зависимости от pH основного гидролизата) доводят окраску до цвета травы. К содержимому второй колбы без индикатора прибавляют столько же кислоты или щелочи, сколько потребовалось для нейтрализации в колбе с индикатором, перемешивают и добавляют 0,5 мл формольной смеси.

Содержимое колбы без индикатора взбалтывают и титруют 0,2 н. раствором едкого натра до голубого окрашивания. Расчет аминного азота в гидролизате проводят по формуле:

где:

Х - количество аминного азота в исследуемом гидролизате, мг%;

А - объем 0,2 н. раствора едкого натра, израсходованного на титрование;

К - поправка титра 0,2 н. раствора едкого натра (например 0,19);

1,4 - коэффициент пересчета щелочи на аминный азот: 1 мл 0,1 н. раствора едкого натра соответствует 1,4 мг% аминного азота;

10 - разведение основного гидролизата (5 мл гидролизата до 50 мл дистиллированной воды);

5 - количество основного гидролизата, взятого для титрования, мл.

Пример расчета. На титрование 5 мл исследуемого гидролизата израсходовано 1,5 мл 0,2 н. раствора едкого натра (поправка титра 0,19). Отсюда содержание аминного азота будет:

Определение аминного азота в основном гидролизате повторяют 2 - 3 раза. Если же будет колебание показателей, то определяют средний показатель.

Из основного гидролизата Хоттингера готовят растворы с необходимым количеством аминного азота. Например, требуется приготовить раствор с содержанием 33 мг% аминного азота, а основной гидролизат содержит 798 мг% аминного азота. Сколько миллилитров основного гидролизата нужно взять для приготовления 1 л раствора с требуемым содержанием аминного азота?

Следовательно, для приготовления 1 л среды с содержанием 33 мг% аминного азота необходимо взять 41,35 мл панкреатического гидролизата мяса и добавить 958,65 мл дистиллированной воды. После добавления в нее компонентов pH среды доводят до 7,8 - 8,0 раствором щелочи 20-процентной концентрации. При определении хлортетрациклина pH среды 6,1 - 6,2 доводят 20-процентным раствором соляной кислоты.

6.1.8. Приготовление тесткультур. Ампулу с высушенным штаммом вскрывают и в нее стерильно добавляют 0,5 мл дистиллированной воды. После полного растворения содержимое переносят пастеровской пипеткой в чашки Петри с 2-процентным мясо-пептонным агаром (pH 7,8 - 8,0) и 18 - 20 часов выращивают в термостате при температуре 37 °С. Затем отбирают колонии с характерными признаками для необходимой культуры, высевают на скошенный в пробирках 2-процентный мясо-пептонный агар и инкубируют 18 - 20 часов. Выращенную культуру смывают с поверхности агара и высевают в матрицы со средой, состоящей из 2,5% агара, приготовленного на бульоне Хоттингера, содержащего 33 мг% аминного азота. Споры выращивают 10 - 12 суток при температуре 37 °С. После обнаружения в мазках в поле зрения микроскопа 90 - 95% спор проводят смыв дистиллированной водой. Взвесь спор прогревают при температуре 65 - 70 °С в течение 30 минут и центрифугируют. Отмывание спор с последующим прогреванием проводят не менее трех раз. Из основной взвеси готовят рабочую взвесь по стандарту мутности 10.

Примечание. Ампулы с высушенным штаммом тесткультур по заявкам поставляет Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов (Москва, Д-22, Звенигородское шоссе, 5).

6.2. Методы обнаружения возбудителей гнильцовых болезней в меде.

Для проведения исследования необходимы следующие аппаратура и материалы:

люминесцентный микроскоп МЛ-2 с набором прилагаемых к нему фильтров или обычный биологический микроскоп (МБИ-1, МБИ-3, МБИ-4), оборудованный специальным люминесцентным устройством;

осветитель для возбуждения люминесценции препарата (источником света служит ртутная лампа СВД-250);

светофильтры СС-4, СС-8;

опак-иллюминатор ОИ-17 или ОИ-18;

предметные и покровные обезжиренные стекла;

флуоресцирующие антиларвейные и антиальвейные сыворотки и контрольная кроличья люминесцирующая сыворотка;

спирт этиловый и метиловый;

забуференный физиологический раствор (фосфатный буфер);

забуференный глицериновый раствор (глицериновый буфер);

нефлуоресцирующее иммерсионное масло;

иммерсионные жидкости (для работы с иммерсионными объективами пользуются специальными нефлуоресцирующими жидкостями, которые прилагаются к люминесцентному микроскопу, а при отсутствии их можно использовать диметилфталат).

Глицериновый буфер готовят смешиванием 9 частей нейтрального глицерина и 1 части фосфатного буфера с pH 8,0.

Фиксацию препаратов проводят этиловым или метиловым спиртом.

Для промывания препаратов применяют фосфатный буфер с pH 7,4.

Фосфатный буфер готовят путем смешивания 30 мл 1/15 М раствора однозамещенного фосфорнокислого натрия или калия и 120 мл 1/15 М раствора двузамещенного фосфорнокислого натрия и 8,78 г хлористого натрия в 1 л дистиллированной воды.

Жидкий мед предварительно тщательно перемешивают и берут пробу, пробы из засахаренного меда отбирают щупом с разной глубины.

От сотового меда берут пробу весом 30 г и, удаляя забрус, погружают в 15 - 20 мл стерильного физиологического раствора для полного растворения меда в ячейках сотов.

Навеску меда 15 - 20 г помещают в стерильную колбочку и добавляют 25 - 30 мл стерильного физраствора (температура 35 - 40 °С). Растворенный мед центрифугируют в течение 15 минут при 2000 об./мин. Надосадочную жидкость осторожно сливают, к центрифугату снова добавляют 25 - 30 мл стерильного физраствора, взбалтывают и еще раз центрифугируют. Из полученного центрифугата параллельно делают 2 мазка, один из которых окрашивают по Граму, другой на споры - 2-процентным раствором карболового фуксина. Для обнаружения Bac. larvae центрифугат высевают на мясо-пептонный сывороточный агар (среда Томешеца) и для Bac. alvei, Strep. apis на МПА и МПБ. Выросшую культуру возбудителя идентифицируют согласно общепринятым бактериологическим методам.

В тех случаях, когда из-за низкого инфицирования меда выделить возбудителей бактериологическим методом не удается, применяют метод флуоресцирующих антител с использованием антиларвейной и антиальвейной сывороток.

Для этого берут 15 - 20 г меда и растворяют в 25 - 30 мл физиологического раствора и центрифугируют. Из центрифугатов делают мазки, фиксируют этиловым спиртом в течение 15 минут, высушивают на воздухе, затем увлажняют фосфатным буфером с pH 7,4 и снова высушивают. Препараты окрашивают прямым способом. Для этого на мазок наносят каплю соответствующей флуоресцирующей сыворотки, помещают в чашку Петри с влажным тампоном ваты и выдерживают при температуре 37 °С в течение 35 - 45 минут. Окрашенные мазки промывают тем же буферным раствором, дважды сменяя раствор через 20 минут, и ополаскивают дистиллированной водой. На высушенные мазки наносят каплю буферного глицерина, покрывают тонким покровным стеклом, на которое наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло, и просматривают под люминесцентным микроскопом МЛ-2 по общепринятой методике.

Примечание. Сыворотки по заявкам поставляет Украинский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии.

Степень свечения микробных клеток оценивают по четырехбалльной системе:

++++ сияющее золотисто-зеленоватое свечение палочек и спор Bac. larvae с ярко выраженными контурами микробных клеток;

+++ яркое зеленоватое свечение палочек и спор с четко выраженными контурами;

++ умеренное зеленовато-желтоватое свечение клеток и спор с отчетливыми контурами;

+ слабое сероватое свечение микробных клеток и спор с неясными контурами;

- клетки незаметные или в виде серых теней.

Оценивают степень свечения большинства клеток. В контроле с чистой культурой Bac. larvae, окрашенной флуоресцирующей антиларвейной сывороткой, свечение должно быть ++++; при окраске препаратов, приготовленных из центрифугатов меда антиальвейной флуоресцирующей сывороткой, свечение должно быть ++ и +.

Мед, инфицированный возбудителями гнильцовых болезней пчел, после автоклавирования при температуре 120 °С в течение 20 минут может быть использован для кормления пчел или его направляют в кондитерскую промышленность.