1.1. Набор для диагностики коронавирусного энтерита крупного рогатого скота методом гемагглютинации применяется для обнаружения коронавирусного антигена и антикоронавирусных антител у крупного рогатого скота. Антиген определяют в пробах фекалий больных, тонкого и толстого отделов кишечника павших с признаками диареи телят. Обнаружение антител проводят в сыворотке крови и молозиве лактирующих коров.

1.2. Срок годности набора - 2 года со дня изготовления при соблюдении условий хранения в сухом и темном месте при температуре 8...12 °C в пределах срока годности. Допускается хранение при любой минусовой температуре.

1.3. Разведенные сыворотки и антиген сохраняют активность в течение 1 мес. при условии их хранения при -20 °C. Разведенные препараты должны храниться в пенициллиновых флаконах под резиновыми пробками.

2.1. Для проведения реакций необходимы следующие материалы и растворы:

2.1.1. Фосфатно-буферный солевой раствор (ФБСР) готовят по следующей прописи:

Для приготовления ФБСР с pH 7,2...7,4 смешивают 430 мл раствора А, 119 мл раствора Б и 500 мл раствора В.

2.1.2. Раствор Альсевера используют для консервирования крови и готовят по следующей прописи:

Раствор Альсевера разливают по флаконам и стерилизуют в водяной бане по 30...40 мин три дня подряд. К одной части крови добавляют 10 частей консерванта. Консервированная кровь пригодна для получения эритроцитов в течение 10...12 сут со дня ее получения.

2.2. 0,5%-ную суспензию эритроцитов мышей готовят следующим образом: кровь от мышей берут в раствор Альсевера путем тотального обескровливания животных. Затем необходимое количество крови центрифугируют в течение 10 мин при 2000 об/мин. Осадок эритроцитов отмывают трижды ФБСР. Из отмытых эритроцитов готовят 0,5%-ную суспензию.

2.3. Сыворотки крови, молозива и молока, а также контрольную и специфическую сыворотки из набора перед исследованием обрабатывают эритроцитами мышей, для чего к 0,25 мл сыворотки добавляют 0,25 мл 10%-ной суспензии эритроцитов, выдерживают 1 ч при комнатной температуре и центрифугируют 15 мин при 1500...2000 об/мин.

Таким образом, перед использованием в реакциях сыворотки оказываются разведенными 1:2.

3.1. Для выявления антител в сыворотках крови, молозиве и молоке используют реакцию торможения гемагглютинации (РТГА).

Постановка РТГА включает два этапа: а) определение рабочей дозы антигена и б) постановка основного опыта.

3.1.1. Вначале определяют рабочую дозу антигена (4 АЕ), для чего проводят титрование антигена в РГА. Для этого во все лунки панели вносят по 0,025 мл (1 капля) ФБСР и делают двукратное разведение специфического антигена. Затем во все лунки вносят по 1 капле 0,5%-ной суспензии эритроцитов.

3.1.2. Учет реакции проводят через 1 ч после оседания эритроцитов в контрольных лунках, которые содержат 1 каплю ФБСР и 1 каплю 0,5%-ной суспензии эритроцитов. Учет проводят по четырехкрестовой системе (рис. 23). За гемагглютинирующий титр антигена принимают наибольшее его разведение, которое вызывает агглютинацию эритроцитов не менее чем на ++.

++++ - эритроциты оседают в виде зонтика с неровными зубцами; +++ - зонтика не образуется, эритроциты находятся в виде хлопьев; ++ - эритроциты в виде хлопьев оседают на дно лунки; + - на дне лунки образуется диск, окруженный хлопьями эритроцитов; - - эритроциты оседают на дно лунки в виде диска или колечка с ровными краями.

Затем показатель титра антигена в РГА делят на 4. Так, если титр антигена 1:256, то рабочее разведение будет составлять 1:64 (4 АЕ).

3.1.3. Перед постановкой основного опыта определяют правильность выбора 4 АЕ (рис. 24). Для этого в 5 лунок раскапывают по 1 капле ФБСР, а затем титруют рабочую дозу антигена. Таким образом, в первой лунке будет 2 АЕ, во второй 1 АЕ, в третьей - 0,5 АЕ. После этого в каждую лунку добавляют по 1 капле 0,5%-ной суспензии эритроцитов, панели встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 60 мин.

При правильном выборе рабочей дозы (4 АЕ) в первой и второй лунках должна быть агглютинация, а в третьей лунке агглютинации быть не должно. Если в третьей лунке оказывается полная или частичная агглютинация, то это означает, что выбранная доза антигена содержит не 4 АЕ, а больше. В этом случае доза должна быть уменьшена. Особенно важно, чтобы во второй лунке, где должна быть 1 АЕ антигена, была полная агглютинация. Если в ней агглютинация не полная, то выбранная рабочая доза содержит меньше АЕ в 0,025 мл и должна быть увеличена.

Уменьшение или увеличение рабочей дозы антигена проводят добавлением соответственно ФБСР или антигена и повторно проверяют.

3.1.4. Для постановки основного опыта в ряд лунок панели разливают по 1 капле ФБСР. В первую лунку вносят 1 каплю испытуемой сыворотки и делают двукратное разведение петлями. После этого во все лунки панели вносят по 1 капле рабочего разведения антигена (4 АЕ). После часового контакта сыворотки с антигеном во все лунки добавляют по 1 капле 0,5%-ной суспензии эритроцитов.

3.2. Учет реакции. Реакцию учитывают через 60 мин. За титр сыворотки принимают наибольшее ее разведение, которое тормозит агглютинацию эритроцитов коронавирусным антигеном не менее, чем на ++.

Контролем реакции служит результат взаимодействия специфической и контрольной сывороток с коронавирусным антигеном, для чего сыворотки титруют как полевые.

Сыворотку считают положительной, если ее титр 1:32 и выше.

Пробы, при исследовании которых получен сомнительный результат, исследуют повторно. При получении двух сомнительных результатов пробу считают отрицательной.

4.1. Для постановки этой реакции в первый ряд лунок панели вносят по 1 капле отрицательной (контрольной) сыворотки; во второй - по капле специфической антигемагглютинирующей сыворотки, разведенных 1:20 ФБСР. Затем в первые лунки обоих рядов вносят по 1 капле испытуемого антигена из фекалий или кишечника, перемешивают петлями объемом 0,025 мл, делают двукратные разведения и ставят на инкубацию на 1 ч. По истечении срока инкубации во все лунки обоих рядов панели вносят по 1 капле (0,025 мл) 0,5%-ной суспензии эритроцитов, перемешивают и оставляют на 1 ч.

1-й ряд - титр испытуемого антигена в ряду с отрицательной (контрольной) сывороткой; 2-й ряд - титр испытуемого антигена в ряду со специфической антигемагглютинирующей сывороткой.

4.2. Учет реакции. Реакция считается положительной, если титр гемагглютинации в исследуемом материале составил 1:32 и выше, и специфическая сыворотка тормозит гемагглютинацию в исследуемом материале не менее чем на 4 разведения (в 16 раз), т.е. если титр гемагглютининов в первом ряду с отрицательной сывороткой составил 1:128, то во втором ряду со специфической антигемагглютинирующей сывороткой он должен быть не выше 1:8 (рис. 25).

При выявлении неактивности диагностикумов или получении неспецифических реакций применение наборов данной серии прекращают и, в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии Госагропрома СССР от 19 сентября 1987 г. N 432-3 "О порядке предъявления рекламаций на ветеринарные препараты отечественного производства и закупаемые по импорту", сообщают об этом ВГНКИ ветпрепаратов Госагропрома СССР (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5) и предприятию-изготовителю. Одновременно во ВГНКИ ветпрепаратов направляют с нарочным не менее 2 наборов серии, оказавшейся слабо активной или неспецифичной.