1.1. Набор для серологической диагностики алеутской болезни норок в реакции иммуноэлектроосмофореза (РИЭОФ) содержит:

- антиген, приготовленный из штамма "П-1" (тканевой) или штамма "ПК" (культуральный) вируса алеутской болезни норок;

- контрольную позитивную сыворотку.

1.2. Антиген выпускают в герметически закрытых стерильных стеклянных флаконах по 5; 10; 12,5; 25 см³, содержит в 1 см³ 100 тест-доз для РИЭОФ, представляет собой коричневую или синевато-бирюзовую прозрачную жидкость.

1.3. Контрольную позитивную сыворотку выпускают в стерильных ампулах или флаконах по 1 см³ (100 тест-доз) представляет собой прозрачную слегка опалесцирующую бесцветную жидкость.

1.4. Антиген и контрольная позитивная сыворотка пригодны к применению в течение 12 мес. со дня изготовления при условии хранения в темном месте при температуре 3...7 °C. Замораживание диагностикума не допускается. Антиген и сыворотка, утратившие прозрачность, к применению не пригодны.

1.5. По истечении указанного срока хранения неизрасходованный диагностикум проверяют на местах путем определения титра антигена и контрольной позитивной сыворотки аналогично методике, изложенной в п. 2.7. При титре не ниже 1:4 антиген разрешается использовать в течение трех месяцев, после чего его необходимо снова проверить. При титре ниже 1:4 использование антигена не допускается.

1.6. Позитивную контрольную сыворотку после истечения срока годности проверяют на местах и при титре не менее 1:16 разрешается использовать ее для РИЭОФ в течение трех месяцев, затем ее снова проверяют. При титре менее 1:16 сыворотку бракуют. В необходимых случаях допускается получение позитивной контрольной сыворотки в хозяйствах от спонтанно больных норок, давших положительную РИЭОФ с антигеном алеутской болезни норок.

1.7. Исследование крови норок на алеутскую болезнь посредством РИЭОФ проводят ветспециалисты звероводческих хозяйств (после специальной подготовки), ветврачи ветеринарных лабораторий и научно-исследовательских учреждений. Исследования проводят в порядке, предусмотренном действующей инструкцией по борьбе с алеутской болезнью норок.

1.8. Для постановки РИЭОФ используют прибор для электрофореза "ЛЭФ-3", "ЭФ-2" или аналогичных марок, вакуумный насос с электродвигателем, осветитель "ОИ-19" или настольную лампу с металлическим или пластмассовым абажуром, столик с уровнем для разлива расплавленного агара, прибор для определения pH растворов (иономер "ЭФ-74" или аналогичный), пробойник диаметром 2,5 мм для изготовления лунок в агаровом геле, резиновую трубку, стеклянные пластинки 8x15 см, направляющую пластинку из оргстекла для пробойника, пипетки градуированные на 10...25 см³, капилляры стеклянные для взятия крови у норок, мерные колбы на 100...1000 см³, кюветы эмалированные, агар для электрофореза, бумагу фильтровальную, мединал (барбитал натрия), веронал (барбитал), дистиллированную воду.

2.1. Для РИЭОФ применяют мединал-вероналовый или другие буферные растворы с pH 8,6...8,9, пригодные для электрофореза белков. Мединал-вероналовый буфер готовят путем растворения 10,32 г мединала в 800 см³ дистиллированной воды и последующего добавления 1,84 г веронала.

Раствор помешивают и держат на водяной бане при 40 °C до полного растворения веронала, затем раствор доводят дистиллированной водой до объема 1 л и измеряют pH. В том случае, если реакция приготовленного мединал-веронального раствора получилась ниже 8,6 - следует добавить мединал, а если выше - веронал. После добавления мединала или веронала каждый раз определяют pH раствора, доводя его до нужной концентрации. Буферный раствор при массовых исследованиях используют в течение трех-четырех дней. При ухудшении линий преципитации в контроле следует заменить раствор и проверить активность диагностикума в соответствии с п. 1.5.

2.2. На чистую обезжиренную стеклянную пластинку размером 8x15 см наливают 30 см³ 1%-ного горячего раствора агара, разведенного пополам дистиллированной водой. После застывания в агаровом геле делают лунки при помощи пробойника, соединительной трубкой с вакуумным насосом. Всего на агаровой пластинке делают 206 лунок с таким расчетом, чтобы получилось десять полных горизонтальных рядов по 20 лунок в каждом и одиннадцатый нижний неполный (для контроля) с шестью лунками, размещенными парами слева, справа и в середине ряда. Диаметр лунок должен быть 2,5 мм, глубина - 2,5 мм, фактический объем - около 0,01 см³, расстояние между центрами соседних лунок каждого горизонтального ряда - 6 мм. Края агаровой пластинки на расстоянии не менее 1 см не должны иметь лунок.

Для более точного расположения лунок используют заранее размеченную миллиметровую бумагу, которую кладут под стеклянную пластинку, или накладывают направляющую пластинку из оргстекла с просверленными для пробойника отверстиями.

При единичных исследованиях можно использовать предметные стекла или стеклянные пластинки меньшего размера.

После разлива агара пластинки должны быть использованы в течение двух часов при хранении во влажной камере (камера для электрофореза, эксикатор и т.д.).

2.3. Кровь для исследования у норок берут в стеклянные капилляры, которые с одного конца закрывают пластилином и центрифугируют при 1500...3000 об/мин в течение 5 мин. Затем отламывают часть капилляра с сывороткой и, не допуская ее разбрызгивания, осторожно выдувают при помощи специальной груши или резиновой трубки в очередную лунку четного вертикального ряда. При необходимости можно использовать цельную кровь, осадок эритроцитов, гемолизированную или хилезную сыворотку. Для контроля реакции в четные лунки 2-го горизонтального неполного ряда вносят положительную контрольную сыворотку. Антиген закапывают пастеровской пипеткой во все лунки нечетных вертикальных рядов (включая и контрольные) и помещают пластинку в камеру электрофореза с тем расчетом, чтобы ток проходил параллельно горизонтальным рядам. К краям пластинки прикрепляют по 4...5 полосок фильтровальной бумаги и опускают их свободные концы в ванны с буферным раствором, наполненные примерно на 2/3 объема. Камеру закрывают крышкой и подключают к выпрямителю тока так, чтобы положительный полюс был справа (со стороны крайнего вертикального ряда с сыворотками). Сила тока должна быть 10...15 мА на каждую стеклянную пластинку (0,08...0,12 мА/см²), напряжение на выходе - 120...220 В. Требуемые параметры тока (по показаниям приборов выпрямителя) достигаются путем изменения количества полосок фильтровальной бумаги, если регулировка тумблером не приводит к желаемому результату.

2.4. Предварительную читку реакции проводят через 15...45 мин после размещения пластинки в силовом поле. Для этого отключают от сети выпрямитель, открывают крышку камеры, вынимают пластинку и просматривают ее в косопроходящем свете (осветитель ОИ-19 или другие источники света) на темном фоне в затемненном помещении.

2.5. Положительная РИЭОФ характеризуется наличием тонкой четкой прямой линии преципитации в горизонтальных рядах геля примерно на середине расстояния между лунками с сывороткой и антигеном. Расплывчатые полосы в геле, диффузные или ограниченные изменения его прозрачности, а также отсутствие изменений расценивается как отрицательный результат.

Окончательную читку реакции проводят после экспозиции стекла с агаровой пластинкой в гипертоническом растворе (12,5%) хлористого натрия в течение 7...10 мин и последующего отмывания в дистиллированной воде (6...18 ч) для удаления неспецифических полос сывороточного белка. При обнаружении едва различимой линии преципитации результат РИЭОФ считается сомнительным. В этом случае реакцию ставят повторно с новой пробой сыворотки. Подтвержденный сомнительный результат РИЭОФ засчитывают как положительный.

Показания РИЭОФ признают действительными, если на данной пластинке во втором горизонтальном ряду во всех трех контролях будет ясно выражена линия преципитации.

Положительный результат РИЭОФ указывает на заражение норок алеутской болезнью и на необходимость изолированного их содержания до момента убоя.

2.6. Результат исследования крови норок в хозяйствах записывают в акте с указанием даты проведения исследований, количества и процента реагирующих норок по отделениям и бригадам, наименования диагностикума, номера его серии, контроля, предприятия-изготовителя, срока годности, фамилии, имени и отчества ветработника, проводившего исследования. Один экземпляр хранят в хозяйстве, второй направляют главному ветеринарному врачу района.

2.7. В необходимых случаях испытывают не только цельные сыворотки и антиген, но и их последовательные разведения.

Для титрования антител у обследуемых норок берут кровь в пробирки в объеме не менее 1...3 см³ и получают сыворотку общепринятым способом, затем готовят последовательные двукратные разведения в физрастворе от 1:2 до 1:262 144 при помощи микротитратора "Такачи" или микропипеток. Каждое разведение испытуемой сыворотки вносят в отдельную лунку четных вертикальных рядов: в нечетные ряды закапывают неразведенный стандартный антиген и пластинку помещают в камеру для электрофореза на 15...45 мин. Одновременно ставят контроль положительной стандартной сыворотки, начиная с разведения 1:2 до 1:64 со стандартным антигеном. Учет реакции проводят в соответствии с п. 2.5. За титр антител в испытуемой сыворотке принимают наибольшее ее разведение, в котором произошла реакция, при одновременном положительном результате с контрольной позитивной сывороткой в предельном (1:64) или половинном (1:32) титре. При титровании антигена готовят последовательные двукратные его разведения от 1:2 до 1:4 в физрастворе. В лунки четных рядов вносят неразведенную контрольную позитивную сыворотку, а в нечетные ряды - антиген в последовательных разведениях. Пластинку помещают в камеру для электрофореза и через 15...45 мин проводят учет реакции, как указано в п. 2.5.

2.8. По истечении срока годности диагностикума или при подозрении на снижение его активности (слабая линия преципитации) проводят титрование антигена и сыворотки, как указано в п. 2.7, и в дальнейшем поступают по пп. 1.5, 1.6.

В случае проявления неспецифических реакций или слабой активности диагностикума применение препаратов данной серии прекращают и об этом сообщают Всероссийскому государственному научно-исследовательскому института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ ветпрепаратов) и предприятию изготовителю набора. Сопроводительное письмо оформляют в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации от 8 мая 1992 г. N 22-7/28 "О порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и закупаемые по импорту".

При наличии невскрытых наборов с препаратами данной серии один набор направляют в адрес института одновременно с рекламацией.

С утверждением настоящего Наставления утрачивает силу "Наставление по применению набора антигена и контрольных сывороток в реакции иммуноэлектроосмофореза для серологической диагностики алеутской болезни норок", утвержденное Главветупром МСХ СССР 04.07.80.