1.1. Лабораторная диагностика болезни Марека заключается в: обнаружении антигена в эпителии перьевых фолликулов в реакции диффузионной преципитации (РДП); выявлении антител в сыворотке крови в РДП; обнаружении гистологических и цитологических изменений в органах и тканях.

При необходимости вирус болезни Марека выделяют на развивающихся эмбрионах кур (РЭК) и чувствительной культуре клеток с последующей идентификацией его в РДП и определением патогенности вируса на суточных цыплятах.

2.1. В ветеринарную лабораторию направляют 5 ... 10 живых, клинически больных цыплят, от которых берут кровь, а при вскрытии - патологический материал (кусочки пораженных органов, кожи, мышц, периферических нервов - плечевого, крестцово-седалищного сплетения, фабрициеву сумку, тимус). Патологический материал используют для вирусологических (не позднее 2 ... 3 ч после взятия) и патоморфологических исследований. Кроме того, от больных цыплят берут перья, как указано в п. 2.3, для обнаружения вирусного антигена.

2.2. Из цельной крови после отстаивания отделяют сыворотку, которую исследуют в РДП. Часть крови стабилизируют добавлением 15 ... 20 ЕД/мл гепарина или 5%-ным раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 и используют для заражения цыплят и РЭК.

2.2.1. Пораженные опухолями печень, почки, селезенку растирают в ступке и готовят 10%-ную суспензию на растворе Хенкса, среде Игла или физиологическом растворе. К суспензии добавляют по 1000 ЕД/мл пенициллина, стрептомицина, 40 ... 50 ЕД/мл нистатина и выдерживают при 4 °C в холодильнике в течение 40 ... 60 мин. Если опухоли во внутренних органах больных птиц визуально не обнаруживаются, то для заражения используют только стабилизированную кровь.

2.3. Для выявления антигена болезни Марека от каждой исследуемой птицы с наружной поверхности бедра выщипывают по 10 ... 15 перьев с наличием производящей ткани (эпителия перьевых фолликулов) внутри очина. Очины пера измельчают ножницами на кусочки по 1 ... 2 мм, затем их растирают в ступке или гомогенизаторе. Полученную массу заливают физиологическим раствором 1:10, 3 раза замораживают и оттаивают, после чего выдерживают сутки при 4 °C. Надосадочную жидкость используют в качестве испытуемого антигена.

3.1. В РДП исследуют не менее 10 проб сывороток крови птиц и 10 антигенов (проб пера) от цыплят 30 ... 150-дневного возраста и взрослой птицы.

3.2. РДП ставят в агаровом геле.

3.3. Компоненты реакции: специфическая преципитирующая сыворотка; контрольная отрицательная сыворотка; специфический антиген; контрольный отрицательный антиген; испытуемый материал.

3.4. Агаровую среду готовят по прописи: агар "Дифко" - 1 г, хлористый натрий - 8 г, вода дистиллированная - 100 мл. Смесь автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин, затем фильтруют через два слоя марли и доводят pH смеси до 7,2 ... 7,4 10%-ным раствором едкого натра. Среду консервируют мертиолятом (0,01% к общему объему) и хранят при температуре 4 °C 12 ... 14 сут.

Перед постановкой реакции агар расплавляют и разливают тонким слоем в чашки Петри или на обезжиренные предметные стекла. В слое застывшего агара при помощи штампа нарезают лунки.

3.5. Постановка реакции.

3.5.1. Для идентификации антигена в центральные лунки вносят специфическую сыворотку, а в периферические - испытуемый антиген.

Контроли: 1) специфический антиген + специфическая сыворотка; 2) специфический антиген + отрицательная сыворотка.

3.5.2. Для выявления антител в сыворотке крови в центральную лунку вносят специфический антиген, а в периферические - исследуемые сыворотки.

3.5.3. Чашки Петри или предметные стекла помещают во влажную камеру, выдерживают сутки при температуре 37 °C, затем - сутки при комнатной.

3.6. Учет реакции. Результаты реакции учитывают предварительно через 24 ... 48 ч и окончательно - через 72 ч.

Реакцию считают положительной при наличии четко выраженных полос преципитации между лунками с испытуемым антигеном и специфической сывороткой, а также между контрольным положительным антигеном и специфической сывороткой при отрицательном результате с отрицательной сывороткой.

4.1. Для гистологического исследования кусочки пораженных внутренних органов фиксируют в 10 ... 15%-ном растворе нейтрального формалина (1:20). Гистологические препараты готовят из целлоидиновых или парафиновых срезов, которые после обработки окрашивают гематоксилин-эозином.

4.2. Для цитологического исследования готовят мазки-отпечатки из пораженных органов. Препараты фиксируют метанолом и окрашивают краской Лейшмана или Мая-Грюнвальда дополнительной окраской по Романовскому-Гимза. Препараты просматривают под световым микроскопом.

4.3. Характерным диагностическим признаком для болезни Марека считают наличие очагово-диффузных инфильтративно-гиперпластических процессов в периферических нервах, внутренних органах, поперечнополосатой мускулатуре и коже. Характерен полиморфноклеточный состав инфильтратов, в которых преобладают лимфоидные, в меньшем количестве - бластные клетки, большое количество недифференцированных крупных опухолевых клеток.

5.1. Для заражения используют куриные эмбрионы из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням птиц, где не проводят вакцинацию цыплят против болезни Марека.

5.2. Заражают одновременно в дозе 0,2 мл 10 ... 15 4 ... 5-дневных РЭК в желток и 10 ... 15 10-дневных эмбрионов на хорионаллантоисную оболочку.

5.2.1. Для заражения РЭК в желточный мешок используют смесь из равных частей стабилизированной крови и 10%-ной суспензии внутренних органов (см. п. 2.2).

5.2.2. Для заражения РЭК на хорионаллантоисную оболочку используют клеточно-свободный вирус, который получают двумя способами:

1-й способ - пробы пера (10 ... 15 очинов) погружают в стерильные пенициллиновые флакончики или пробирки с бидистиллированной водой, содержащей пенициллин и стрептомицин по 1000 ЕД/мл и нистатин 50 ЕД/мл. Через 30 мин содержимое очинов пинцетом выдавливают в ступку, тщательно растирают и добавляют 10 ... 12 мл физиологического раствора;

2-й способ - очины пера измельчают ножницами на кусочки по 1 ... 2 мм, заливают физиологическим раствором 1:10, содержащим антибиотики (в указанных выше дозах), и затем обрабатывают ультразвуком на аппарате УЗДН-1 или МЗЕ 4 раза по 30 с с 2-минутными интервалами при частоте 4 ... 6 А.

Полученную любым из указанных способов суспензию клеток (или клеточный детрит) центрифугируют 20 мин при 3 тыс. об/мин; надосадочный слой используют для заражения РЭК на хорионаллантоисную оболочку.

5.3. Зараженные эмбрионы помещают в термостат при температуре 37,5 °C и дважды в день овоскопируют.

РЭК, зараженные в желток, инкубируют в течение 13 ... 14 сут. Гибель зародышей считается специфической с 8 ... 9-го дня инкубации.

Эмбрионы, зараженные на хорионаллантоисную оболочку, инкубируют в течение 7 ... 8 сут. Гибель их считают специфической через 72 ч после заражения.

Признаком инфицирования эмбрионов вирусом болезни Марека считают их гибель и образование на хорионаллантоисной оболочке серовато-белых пролиферативных очажков-бляшек размером до 1 ... 3 мм в диаметре, увеличение селезенки и печени эмбриона.

5.4. Для учета очажков-бляшек хорионаллантоисную оболочку помещают в чашку Петри, наполненную физиологическим раствором, несколько раз отмывают, расправляют и просматривают с помощью лупы на титропляторе или под микроскопом.

Микро- и макроскопические бляшки и количество их на оболочке могут варьировать в зависимости от чувствительности куриных эмбрионов к вирусу болезни Марека и вирулентности штамма возбудителя.

5.5. Специфичность изменений подтверждают исследованием материала от зараженных эмбрионов в реакции диффузионной преципитации. Для этого собирают пораженные участки хорионаллантоисной оболочки и экстраэмбриональную жидкость. Хорионаллантоисные оболочки растирают в ступке с песком или измельчают в гомогенизаторе, добавляют физиологический раствор в объеме 1:3 и центрифугируют. Надосадочную жидкость соединяют с экстраэмбриональной жидкостью и концентрируют в 20 раз выпариванием в токе воздуха от вентилятора. Полученный концентрат используют в качестве антигена в РДП, как указано в п. 3 настоящих методических указаний.

6.1. Биопробу на цыплятах проводят с целью определения патогенности возбудителя, дифференциации заболевания от некоторых форм гиповитаминозов, лейкоза, а также при экспериментальном изучении болезни Марека.

Цыплят получают из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням птиц, где не проводится вакцинация против болезни Марека.

6.2. Тридцать однодневных цыплят заражают двукратно с интервалом в 2 дня по 0,3 ... 0,4 мл внутрибрюшинно материалом, приготовленным, как указано в п. 2.2.1. В контроле одновременно содержат в аналогичных условиях 10 ... 15 незараженных цыплят такого же возраста.

6.3. За птицей ведут ежедневное наблюдение в течение 85 ... 90 сут при диагностике острой формы болезни Марека и до 120 сут - классической формы.

6.4. Оценку результатов биопробы проводят по комплексу признаков, учитывая клиническое проявление болезни у зараженных цыплят, наличие вирусспецифического антигена в эпителии перьевых фолликулов, специфических микроскопических изменений в тканях (через 3 ... 8 нед.), опухолевых поражений в органах и специфических изменений в нервах через 1 ... 4 мес.

7.1. Для выделения вируса болезни Марека из патологического материала используют 24 ... 48-часовую культуру первично трипсинизированных куриных фибробластов или 72-часовую культуру почек куриных эмбрионов или цыплят, которых готовят общепринятым методом и выращивают в стеклянных флаконах (матрасах) со смещенным горлом.

В качестве питательной среды для культивирования клеток используют гидролизат лактальбумина, среду Игла или Эрла, или среду N 199. В ростовую среду добавляют 10% сыворотки крупного рогатого скота, в поддерживающую - 2%.

7.2. Культуру клеток заражают материалом, приготовленным, как указано в п. 2.2.1, или 10%-ной суспензией из клеток почек от больной птицы. Суспензию готовят по следующей методике: из почек вырезают кусочки размером 2 ... 3 мм, дважды отмывают раствором Хенкса, вносят в колбу и заливают 0,25%-ным раствором трипсина в объеме 1:10. Колбу помещают на магнитную мешалку, суспензию перемешивают в течение 20 ... 30 мин при комнатной температуре. Затем клеточную взвесь фильтруют через 2 слоя марли и центрифугируют при 1 тыс. об/мин в течение 10 ... 15 мин. Осадок ресуспензируют в культуральной питательной среде из расчета, чтобы в 1 мл взвеси было 3 ... 4 млн клеток. В суспензию добавляют по 1000 ЕД пенициллина и стрептомицина и 40 ... 50 ЕД нистатина на 1 мл суспензии, выдерживают в холодильнике в течение 30 ... 60 мин при температуре 4 °C, после чего используют для заражения.

7.3. Перед заражением из матраса (флакона) удаляют ростовую среду и на сформированный монослой клеток вносят исследуемый материал в дозе по 3 мл на флакон размером 4 x 5 см.

После контакта в термостате в течение 30 мин клетки заливают поддерживающей средой и продолжают инкубировать. По мере закисления (изменение цвета среды, величины pH) поддерживающую среду заменяют.

7.4. На 7 ... 8-й день проводят второй пассаж вируса. Для этого поддерживающую среду осторожно удаляют, вносят на монослой одного матраса 1 ... 2 мл подогретого до 30 ... 37 °C 0,125%-ного раствора трипсина и оставляют на контакте при комнатной температуре в течение 2 ... 3 мин. Затем трипсин полностью сливают, а в матрас вносят питательную среду и путем энергичного встряхивания клетки отслаивают от стекла. Полученной суспензией клеток заражают свежий монослой из расчета 1:3, т.е. вирусом, собранным с одного флакона, можно заразить монослой 3 флаконов (из расчета 3 ... 4 млн вируссодержащих клеток на монослой 1 флакона). После контакта в течение 30 мин клетки заливают поддерживающей средой и продолжают инкубировать 48 ... 72 ч.

Через 6 ... 7 сут проводят третий пассаж вируса по такой же методике.

7.5. Учет результатов пассажей ведут по характеру цитопатогенного действия (ЦПД) вируса, имея в виду, что вирус болезни Марека вызывает цитопатические изменения монослоя в виде фокусов, состоящих из скопления округлых рефрактильных клеток, синцитиев и микроскопически видимых бляшек - негативных пятен.

Сроки наступления ЦПД зависят от дозы вируса и количества пассажей. При первичном выделении возбудителя специфические морфологические изменения клеток обычно проявляются во втором-третьем пассажах вируссодержащего материала через 48 ... 96 ч. Специфичность ЦПД подтверждается путем исследования отдельных проб материала в РДП.

7.6. В качестве антигена для РДП используется культуральная жидкость, сконцентрированная в 20 ... 50 раз диализом против глицерина или сахарозы в целлофановых мешочках.

8.1. По данным лабораторного исследования, диагноз на болезнь Марека ставят через 4 дня по результатам РДП и цитологического метода и через 14 сут - по результатам гистологического исследования (1).