1.1. Лабораторная диагностика ринопневмонии лошадей заключается в выделении вируса на культуре клеток и его идентификации в одной из реакций: реакции торможения гемадсорбции (РТГАд), реакции иммунофлуоресценции (ИФ) или реакции нейтрализации (РН); выявлении антител в сыворотке крови больных и переболевших животных в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) или РН.

1.2. Диагноз на ринопневмонию лошадей устанавливают на основании результатов лабораторного исследования, анализа эпизоотологических и клинических данных, а также патологоанатомических изменений.

1.3. Для постановки лабораторного диагноза путем выделения вируса и его идентификации требуется от 4 до 18 сут, по выявлению прироста антител в крови животных - от 2 до 4 нед.

2.1. От больных животных тампонами берут слизь из носовой полости, от павших животных - кусочки легких (на границе здоровой и пораженной ткани).

Патологический материал помещают в пенициллиновые флаконы с 2...5 мл раствора Хенкса и в термосе со льдом направляют в лабораторию.

2.2. В лаборатории флаконы с тампонами подвергают однократному замораживанию и оттаиванию, после чего тампоны отжимают и удаляют, а содержимое флаконов центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку, куда вносят по 500 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, выдерживают при 4 °C 2...4 ч и используют для заражения культуры клеток.

2.3. Из кусочков органов готовят на растворе Хенкса 10%-ную суспензию, содержащую по 500 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, центрифугируют 20 мин при 3 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость отсасывают и используют для заражения культуры клеток.

3.1. Для выделения вируса ринопневмонии лошадей заражают надосадочной жидкостью (пп. 2.2, 2.3) одну из культур клеток: почки эмбриона коровы (ПЭК), почки эмбриона свиньи (ПЭС), почки кролика (ПК) или почки эмбриона лошади (ПЭЛ), приготовленную в соответствии с "Методическими рекомендациями по получению, культивированию и использованию в научных и производственных целях первичных, перевиваемых и диплоидных культур клеток животного происхождения", утвержденными Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 26 января 1978 г.

3.2. Пробирки с монослоем культуры клеток отмывают раствором Хенкса и заражают по 0,3...0,4 мл испытуемым материалом. Пробирки выдерживают в термостате при температуре 37,5 °C в течение 1,5...2 ч, затем из них удаляют исследуемую жидкость, промывают раствором Хенкса и добавляют 1...2 мл 0,5%-ного гидролизата лактальбумина. На каждый материал используют 5...6 пробирок культуры клеток. Для контроля оставляют 4 пробирки, в которых заменяют ростовую среду на поддерживающую. Пробирки с культурой клеток помещают в термостат при температуре 37,5 °C и ежедневно просматривают под микроскопом.

3.3. Изменения в культуре клеток, вызванные вирусом ринопневмонии, характеризуются округлением клеток и отслоением их от стекла, образованием многоядерных клеток (симпластов). Указанное цитопатическое действие (ЦПД) появляется на 3...6-й день.

При отсутствии ЦПД в первом пассаже или слабом его проявлении проводят три последовательных пассажа. Каждый пассаж проверяют в реакции гемадсорбции с эритроцитами лошади.

4.1. Для постановки реакции гемадсорбции (РГАд) отбирают 3...4 пробирки с зараженной культурой клеток с выраженным ЦПД, сливают питательную среду, вносят в них по 1 мл 2%-ной взвеси эритроцитов и оставляют на контакт на 30...40 мин при температуре 37 °C. Затем эритроциты удаляют, пробирки с культурой промывают физиологическим раствором путем легкого покачивания и просматривают под микроскопом при малом увеличении.

При наличии вируса в материале отчетливо видны прикрепившиеся к клеткам эритроциты, тогда как в контрольных пробирках они проплывают в поле зрения.

При положительной РГАд идентификацию вируса проводят в РТГАд.

4.2. Для постановки реакции торможения гемадсорбции в 4 пробирки с зараженной культурой клеток вносят по 0,5 мл неразведенной специфической сыворотки, оставляют на контакт на 30...40 мин при температуре 37 °C. Затем во все пробирки вносят по 1 мл 2%-ной взвеси эритроцитов. Через 30 мин эритроциты удаляют, а пробирки с культурой промывают физиологическим раствором путем легкого покачивания и учитывают реакцию. В пробирках, обработанных специфической сывороткой, при наличии вируса ринопневмонии гемадсорбция отсутствует.

5.1. Для идентификации вируса в реакции ИФ культуру клеток выращивают в пробирках на покровных стеклах. С появлением монослоя его заражают выделенным вирусом по общепринятой методике. На 2...3-е сутки стеклышки извлекают из пробирок, фиксируют в охлажденном ацетоне 15...20 мин, отмывают в забуференном физрастворе и окрашивают флуоресцирующей сывороткой на одно разведение ниже ее титра. Препараты выдерживают в течение 30...40 мин во влажной камере при 37 °C, затем трехкратно отмывают физиологическим раствором, высушивают при комнатной температуре и просматривают под микроскопом.

5.2. Учет реакции. Реакцию считают положительной при наличии специфической флуоресценции, которая характеризуется тем, что в препаратах, окрашенных флуоресцирующей сывороткой, ткань флуоресцирует тусклым зеленовато-серым цветом, а вирусный антиген при этом выявляется в виде яркого желто-зеленого свечения в перинуклеарной зоне не менее 50% клеток при отсутствии флуоресценции в контрольных незараженных препаратах.

6.1. Предварительно определяют титр вируса. Для этого культуральную вируссодержащую жидкость центрифугируют (при 3 тыс. об/мин в течение 20 мин), надосадочную жидкость титруют в разведении от 10^-1 до 10^-8 на растворе Хенкса. Каждым разведением вируса заражают 4 пробирки с культурой клеток. Результаты учитывают на 6-е сутки.

6.2. За титр вируса принимают его наибольшее разведение, при котором отмечают ЦПД в 50% пробирок с зараженной культурой клеток. Титр выделенного вируса должен быть не менее 10^-2 ЦПД₅₀/мл. Реакцию ставят со 100 ТЦД₅₀/мл вируса.

6.3. Специфическую и контрольную (отрицательную) сыворотки инактивируют при температуре 56 °C в течение 30 мин, готовят два ряда двукратных разведений. Количество разведений должно на одно превышать известный (указанный на ампуле) титр специфической сыворотки.

6.4. В каждую пробирку, содержащую по 2 мл сыворотки, вносят равный объем вируса. Смесь сыворотки и вируса оставляют для контакта на 1...1,5 ч при температуре 18...22 °C. Каждым разведением сыворотки с вирусом заражают по 4 пробирки с культурой клеток в дозе 1,0 мл. Культуру инкубируют при 37,5 °C, ежедневно просматривают под микроскопом.

6.5. Учет реакции нейтрализации проводят на 6-й день. Подавление ЦПД в пробирках со специфической сывороткой и исследуемым вирусом при наличии выраженного ЦПД в контроле с нормальной сывороткой указывает на видовую принадлежность вируса. Вирус считают идентифицированным при наличии нейтрализации не менее чем до одной трети титра положительной сыворотки с гомологичным, заведомо известным вирусом.

7.1. Для обнаружения специфических антител в крови переболевших ринопневмонией лошадей ставят РТГА и РН. Исследуют парные пробы сывороток, взятых в начале заболевания (или в день аборта) и через 2...3 недели после выздоровления. Исследуемые сыворотки инактивируют при 56 °C 30 мин.

7.2. Постановка РТГА. Реакцию проводят микрометодом с применением аппарата Такачи. В качестве антигена используют вакцинный штамм вируса, который готовят путем заражения вирусом культуры клеток.

РТГА ставят с 4 гемагглютинирующими единицами (ГАЕ) вируса, которые находят путем деления на 4 показателя гемагглютинирующего титра. Например, если гемагглютинирующий титр равен 1:8, то 4 ГАЕ будет соответствовать 1:2 (8 : 4 = 2). Если титр исходного вируса 1:2, то используют неразведенную вируссодержащую жидкость.

7.2.1. Для постановки основного опыта в лунки панели разливают по 0,025 мл физиологического раствора. В первые лунки с помощью микропипетки вносят по 0,025 мл исследуемых сывороток и титруют их в разведении 1:2 до 1:1024. Затем в каждую лунку вносят по 0,025 вируса (4 ГАЕ). Панели осторожно встряхивают и после 60-минутного контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют по 0,05 мл 0,2%-ной взвеси эритроцитов лошади.

7.2.2. Контроли: эритроцитов на спонтанную агглютинацию; рабочей дозы антигена по общепринятой методике.

7.2.3. Реакцию учитывают через 2 ч. Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, при котором отсутствует агглютинация эритроцитов.

7.3. Постановка реакции нейтрализации описана в п. 6.

7.4. Ретроспективный диагноз на ринопневмонию ставят при четырехкратном приросте антител в парных пробах сывороток переболевших животных (1).